血清腫瘤標志物與非小細胞肺癌驅動基因突變發生率的相關性分析

祝夢曉，胡 晨，何 勇

400042 重慶，陸軍特色醫學中心呼吸與危重癥醫學科

肺癌是目前致死率最高的惡性腫瘤，5年生存率僅10%～20%[1]。肺癌靶向治療顯著延長了晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者的生存周期并改善其生活質量，為肺癌患者帶來了新的治療希望[2]。目前最為常見的肺癌驅動基因是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變以及間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)基因融合[3-4]。針對鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS)突變開發的靶向藥物也在臨床研究中有較好的表現[5]。

血清腫瘤標志物在腫瘤的診斷、病理類型及原發灶的判定上發揮著重要的作用，同時其治療過程中的動態變化也可用于療效及預后的判斷。既往研究表明，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA-125)、細胞角蛋白19的可溶性片段(cytokeratin fragment 19，CYFRA21-1)等腫瘤標志物存在于正常細胞中，但在腫瘤細胞中合成和分泌量明顯增加[6]。既往研究表明血清腫瘤標志物可用于預測肺癌靶向治療療效[7]。與此同時，有研究指出血清腫瘤標志物水平與肺癌驅動基因突變率存在相關性，但也有研究得出相反結論[8-10]。因此，血清腫瘤標志物與肺癌驅動基因突變發生率是否存在相關性尚待進一步研究。本研究基于陸軍特色醫學中心大樣本回顧性臨床研究資料，進一步分析肺癌驅動基因突變率與血清腫瘤標志物的相關性，并探討其內在的聯系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究采用橫斷面研究設計[11]，通過PASS 15.0.5計算樣本量，根據已有研究EGFR在NSCLC中的突變率占比50.09%，CEA診斷EGFR檢出率的受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)下面積(area under the curve，AUC)為0.715[10]，使用雙側z檢驗，設定把握度為0.9，在顯著性水平0.050處，樣本量估算結果為至少需要70例患者，其中基因突變NSCLC患者35例，非基因突變NSCLC患者35例?；仡櫺约{入2015年12月至2021年3月來自陸軍特色醫學中心進行組織活檢明確為原發性肺癌并行基因檢測的患者，包含呼吸科、腫瘤科、胸外科的住院及門診患者，共計1 261例。入組標準如下：病理學符合NSCLC的診斷；未經治療的初診患者；在病理活檢前后1周內進行血清腫瘤標志物檢測，至少有CEA檢測結果。排除標準如下：病理學診斷為混有小細胞肺癌成分的混合性NSCLC；患者臨床信息不完整。最終共納入1 008例患者進入下一步分析。

1.2 研究方法

通過醫院病歷系統收集納入1 008例患者的性別、年齡、吸煙史，參照第八版肺癌TNM分型確定臨床分期。記錄患者的年齡、性別、吸煙史、TNM分期、病理類型、基因突變類型以及腫瘤標志物結果。首先根據不同的基因突變類型進行分組(包含EGFR各種突變亞型)，分析突變型與野生型患者在臨床特征及各項腫瘤標志物的差異。其次，通過中位數比較不同基因突變型與野生型患者在腫瘤標志物水平上的差異。根據腫瘤標志物水平進行連續分組，分析不同腫瘤標志物升高水平組中基因突變患者占比差異。同時，通過分期進行亞組分析上述差異性。最后采用ROC曲線分析不同因素對EGFR突變率的影響。根據國際肺癌研究協會第八版肺癌TNM分期，將患者分為早期可手術組(Ⅰ～ⅢA期)及晚期不可手術組(ⅢB～Ⅵ期)，分析兩組患者腫瘤標志物和基因突變相關性的差異。

本研究經陸軍特色醫學中心研究倫理委員會批準(2020第117號)。

1.3 基因檢測

經皮穿刺、支氣管鏡或胸腔鏡獲取原發腫瘤組織標本。采用QIAamp DNA FFPE組織試劑盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)按生產廠家說明書提取腫瘤組織DNA。用Qubit dsDNA檢測技術(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)測定腫瘤組織的DNA濃度。聚合酶鏈反應用ABI7500實時PCR系統進行，通過采用擴增受阻突變系統(ARMS)和肺癌驅動基因檢測試劑盒(廈門艾德生物技術有限公司提供)進行檢測標本是否存在驅動基因突變。用于定性檢測NSCLC患者EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HER2/MET基因變異。

1.4 血清腫瘤標志物的檢測

在組織活檢的前后1周內晨采空腹靜脈血3 mL，血液采集均在治療前進行。離心機4 000 r/min高速分離血清15 min。嚴格按照電化學發光分析儀和試劑盒說明書，使用相同的電化學發光免疫法對血清腫瘤標志物進行檢測。正常血清腫瘤標志物參考范圍：CEA 0～5.0 ng/mL、NSE 0～16.3 ng/mL、CYFRA21-1 0～3.3 ng/mL、CA-125 0～35 U/mL。

1.5 統計分析方法

本研究使用SPSS 20.0版本對所有數據進行分析。使用夏皮羅-威爾克檢驗(shapiro-wilk test)評估正態性，結果顯示各項腫瘤標志物均為偏態數據(P<0.001)，因此對腫瘤標志物采用M(P25，P75)描述。對連續非正態分布的變量使用Mann-WhitneyU檢驗。分類變量采用皮爾森χ2檢驗進行分析。通過斯皮爾曼等級相關系數來評估兩個非正態分布連續變量之間的相關性。采用ROC曲線分析，采用Delong法計算AUC的標準誤差。采用趨勢χ2檢驗(cochran-armitage trend test)分析組間是否存在線性趨勢。P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 研究結果

2.1 一般資料及基因突變分布

納入患者中位年齡58歲(年齡范圍35～76歲)，男性占66.8%(674/1 008)，女性占33.2%(334/1 008)。包含了217例Ⅰ～ⅢA期患者，以及791例ⅢB～Ⅵ期患者。病理類型以腺癌(807例)為主，鱗癌139例，其他類型62例(包含31例非小細胞癌，12例腺鱗癌，7例大細胞癌，6例肉瘤樣癌，5例低分化癌，1例SMRCA4缺失型癌)。吸煙或既往吸煙患者共661例，非吸煙患者共347例。

本組病例中，驅動基因的檢出率為64.5%(651/1 008)，最常見的驅動基因突變是EGFR突變(44.1%，424/1 008)，其次是為KRAS突變(10.4%，105/1 008)，ALK融合突變共檢出54例(5.4%)。EGFRL858R突變是最常見的突變亞型，占EGFR突變患者的47.2%，占總突變人群的31%。EGFR19del突變亞型占EGFR突變患者的44.8%，占總突變人群的29%。非經典EGFR突變共34例，包括22例EGFR20插入突變、9例EGFRL861Q突變、3例EGFR19del/L858R復合突變(圖1)。在無明確腺癌成分的病理類型中，基因突變的總體檢出概率較低(23/153)，包含8例PIK3CA突變、5例KRAS突變、4例EGFR19del突變、3例EFGRL858R突變、2例MET14跳躍突變、1例ALK融合突變(圖1)。

圖1 651例驅動基因突變的NSCLC患者突變類型分布圖

2.2 臨床特征與基因突變關系

EGFR基因突變更常見于女性(61.4%vs.34.0%，P<0.001)、無吸煙史(40.1%vs.31.5%，P<0.001)的腺癌患者(50.2%vs.5.0%vs.19.4%，P<0.001)，而與年齡及腫瘤分期無明顯相關性。腫瘤標志物方面，CEA異常升高(49.9%vs.32.6%，P<0.001)以及正常范圍的CYFRA21-1(48.5%vs.38.3%，P=0.003)患者更易發生EGFR基因突變，而NSE、CA-125與EGFR基因突變無明顯相關性。ALK融合突變同樣常見于無吸煙史(7.8%vs.4.1%，P=0.013)、女性(7.8%vs.4.2%，P=0.016)、腺癌(6.4%vs.0.7%vs.1.6%，P=0.006)人群，但其更容易見于年輕的患者(7.0%vs.3.0%，P=0.006)。ALK融合突變與各項腫瘤標志物的異常升高無明顯相關性。KARS基因突變常發生于男性(12.6%vs.5.7%，P<0.001)、吸煙(12.7%vs.5.8%，P<0.001)以及肺腺癌(11.6%vs.2.9%vs.9.7%，P=0.009)患者，KARS基因突變與NSE異常升高有相關性(12.9%vs. 8.5%，P=0.030,表1)。

EGFR各突變亞型與野生型相比均較易發生在無吸煙史、女性以及CEA異常升高的患者中。較為特殊的是：①EGFR19del突變(22.5%vs.16.3%，P=0.020)和非經典突變(4.5%vs.2.6%，P=0.042)更易發生在高齡患者，而EGFRL858R突變與年齡無明顯相關(21.7%vs.17.1%，P=0.331)；②血清CYFRA21-1正?；颊甙l生EGFR19del突變的比率較高(24.1%vs.16.4%，P=0.001)，而EGFRL858R突變(21.7%vs.18.3%，P=0.051)和EGFR非經典突變(2.7%vs.3.6%，P=0.782)與血清CYFRA21-1水平無明顯相關性；③EGFR19del突變(22.9%vs.2.9%vs.1.6%，P<0.001)和EGFRL858R(23.4%vs.2.2%vs.12.9%，P<0.001)突變更易發生在肺腺癌當中，而EGFR非經典突變(3.8%vs.0.0%vs.4.8%，P=0.050)與病理類型無明顯相關性(表2)。

表1 NSCLC患者不同基因突變組與野生型組臨床特征及腫瘤標志物的比較 [n(%)]

表2 NSCLC患者EGFR基因不同突變亞型組與野生型組臨床特征及腫瘤標志物的比較 [n(%)]

2.3 不同基因突變類型患者血清腫瘤標志物水平的差異

在本組病例中，EGFR突變患者的血清CEA水平顯著高于EGFR野生型患者[12.19(3.49，79.05)vs.4.93(2.47，17.29) ng/mL，P<0.001]。亞組分析顯示，EGFR19del突變[15.85(3.31，90.35)vs.4.93(2.47， 17.29) ng/mL)，P<0.001]、EGFRL858R突變[ 9.57(3.28，76.64)vs.4.93(2.47，17.29) ng/mL，P<0.001]以及非經典突變亞型[18.96(6.92，100.00)vs.4.93 (2.47，17.29) ng/mL，P<0.001]患者血清CEA水平均顯著高于野生型患者。同時，EGFR突變患者的血清CYFRA21-1水平低于野生型患者[3.92(2.32，8.92)vs.4.87(2.65，9.16) ng/mL，P=0.017]。亞組分析顯示，EGFR19del突變患者組與EGFR野生型患者在血清CYFRA21-1水平的差異有統計學意義[3.61(2.31，8.03)vs.4.87(2.65，9.16) ng/mL，P=0.008]。KARS突變型患者的血清NSE水平高于KARS野生型患者[16.43(13.50， 22.63)vs. 14.97(11.40, 20.52) ng/mL,P=0.029]。ALK融合突變患者與ALK野生型患者與在所有納入分析的血清腫瘤標志物水平上的差異均無統計學意義(表3)。

表3 不同基因突變類型NSCLC患者血清腫瘤標志物水平差異 [M(P25，P75)]

A: Ⅰ～ⅢA期患者組中不同EGFR突變亞型與野生型比較 a：P=0.689, b：P=0.123, c：P=0.091；B: ⅢB～Ⅵ期患者組中不同EGFR突變亞型與野生型比較 a：P=0.006, b：P<0.001, c：P=0.144；C:Ⅰ～ⅢA期患者組中ALK融合突變與ALK野生型對比 a：P=0.001；D: ⅢB～Ⅵ期患者組ALK融合突變與ALK野生型對比 a：P=0.026

2.4 不同分期影響突變類型與血清腫瘤標志物的相關性

在Ⅰ～ⅢA期患者中，不同EGFR突變亞型與EGFR野生型患者血清CEA水平的差異均不具有統計學意義(圖2A)。而在ⅢB～Ⅵ期患者中，EGFR經典突變亞型患者血清CEA水平顯著高于EGFR野生型患者，但EGFR非經典突變患者的血清CEA水平與EGFR野生型患者的差異無統計學意義(圖2B)。ALK融合突變與ALK野生型患者血清CYFRA21-1水平的差異，無論是早期組還是晚期組均有統計學意義(P<0.05, 圖2C、D)。

2.5 血清CEA水平與EGFR基因突變率相關性

結果顯示EGFR突變率均隨著CEA水平的升高而逐漸升高，兩組變化有直線相關關系(Mantel-Haenszel差異檢驗，P<0.001，圖3)。分層分析顯示，ⅢB～Ⅵ期患者組中EGFR突變率均隨著CEA水平的升高而逐漸升高，兩組變化有相關關系(P<0.001)，而Ⅰ～ⅢA期患者組CEA水平與EGFR突變不具有直線相關關系(P=0.568,圖3)。通過各指標ROC曲線的參數結果顯示，無論是總體人群還是ⅢB～Ⅵ期患者組，血清CEA水平均有最大的曲線下面積(總人群：0.635，晚期組：0.681)；而在Ⅰ～ⅢA患者組，血清CEA水平曲線下面積僅有0.388，遠低于吸煙及性別因素(圖4)。

A：總納入病例不同CEA水平EGFR突變類型構成比及變化趨勢；B：Ⅰ～ⅢA患者組不同CEA水平EGFR突變類型構成比及變化趨勢；C：ⅢB～Ⅵ期患者組不同CEA水平EGFR突變類型構成比及變化趨勢

A：總納入病例中各項指標對預測EGFR基因突變效能；B：Ⅰ～ⅢA患者組各項指標對預測EGFR基因突變效能；C：ⅢB～Ⅵ患者組各項指標對預測EGFR基因突變效能

3 討論

近年來，靶向治療顯著提高了晚期NSCLC患者的生存時間以及生活質量。與既往研究結論一致，我們的研究結果同樣發現EGFR突變通常發生在女性、非吸煙的腺癌人群中，ALK融合突變更易發生在年輕人群中，KARS突變在吸煙、男性人群中更加常見[12]。于此同時，本研究還發現不同基因突變與血清腫瘤標志物呈現一定的相關性。EGFR突變更易發生在血清CEA異常升高以及血清CYFRA21-1水平正常的患者，且血清CEA水平越高的肺癌患者EGFR突變概率越高。

既往研究表明，CEA升高可增強多種腫瘤細胞的細胞間粘附并促進腫瘤形成[13]，且可通過造成細胞外基質細胞失錨狀態，從而抑制腫瘤細胞凋亡[14-15]。同時，突變的EGFR蛋白會異常激活下游信號轉導通路，誘導轉錄因子表達和激活，從而破壞抗凋亡通路，加速細胞增殖[16]。EGFR下游激活的信號轉導蛋白，如蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)和信號傳導及轉錄激活蛋白3/5(signal transducer and activator of transcription 3/5，STAT3/5)，在EGFR突變誘導的抗凋亡效用中發揮重要作用[17]。在間皮瘤相關的基礎研究中發現，CEA表達受EGFR信號通路的正向調節[18]。這可能是EGFR突變體誘導的抗凋亡信號導致CEA蛋白的表達水平升高的潛在分子機制，但仍需進一步的研究證實。

CYFRA21-1是較為公認用于鱗狀細胞癌鑒別診斷的腫瘤標志物，其水平高低與病情呈正相。當腫瘤細胞發生溶解時，其中的細胞角質蛋白釋放入血，而使血中CYFRA21-1升高。既往研究提示治療前血清CYFRA21-1水平與NSCLC靶向治療效果呈負相關[19-21]，這可能與腫瘤的異質性導致鱗狀細胞癌成分較多相關。本研究發現CYFRA21-1與EGFR突變發生率呈負相關，也有可能是腫瘤的異質性所導致。

不同于既往的研究，我們的研究還納入了部分早期肺癌患者。結果提示，盡管在早期患者中EGFR野生型與突變型在血清CEA水平上差異并不明顯，但攜帶ALK融合突變的早期肺癌患者中CYFRA21-1水平低于野生型患者，差異具有統計學意義。既往研究提示早期NSCLC患者中，ALK融合突變患者的OS更長， 預后更好[22]。同時有研究證明，術前高水平的CYFRA21-1是NSCLC患者術后預后不良獨立危險因素[23]，但上述研究未對患者的基因突變狀況進行檢測。我們結果發現早期肺癌患者中ALK融合突變患者組中CYFRA21-1水平低于野生型患者，也似乎預示此類患者的預后較好，可待后續的跟蹤隨訪進一步驗證。來自韓國的研究報道顯示，ALK融合突變的早期肺癌患者通常原發灶較小，T分期主要集中在1期[24]。這可能是導致早期ALK融合突變患者血清CYFRA21-1水平較低的一方面原因。

本研究仍存在一定局限性，首先納入的罕見突變患者數量較少，針對罕見突變的研究需要更大樣本的臨床研究加以探索。其次，本研究為回顧性研究，存在不同檢測時間點對腫瘤標志物的影響，且入組病例部分腫瘤標志物檢測項目缺失，會對結果造成一定的影響。最后，本研究檢測出的多重基因突變的概率較低，可能與研究采用的基因檢測為PCR法相關，后續可設計采用二代測序為基因檢測手段的前瞻性研究進一步驗證腫瘤標志物與肺癌驅動基因突變的關系。

綜上所述，本研究通過大樣本的臨床資料，揭示了腫瘤標志物與常見的肺癌驅動基因之間的聯系。血清CEA、CYFRA21-1和NSE水平可作為判斷NSCLC驅動基因突變的輔助指標。在無法獲知患者基因突變的情況下，通過結合腫瘤標志物及患者臨床特征，判斷是否應用靶向藥物治療，具有一定的參考意義。