不同二代ALK -TKIs二線治療ALK陽性晚期非小細胞肺癌的耐藥基因變異分子圖譜差異

丁 寧， 徐曉波， 周潔白， 張 勇， 劉子龍， 劉 潔， 張東輝，2，李佳旻， 胡 潔，2

200032 上海，復旦大學附屬中山醫院呼吸與危重癥醫學科1；201104 上海，上海市老年醫學中心呼吸與危重癥醫學科2

間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)陽性非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌一種分子亞型，占比3%～7%[1]。ALK基因與其他基因發生斷裂后重排，產生ALK融合蛋白，通過激活PI3K-AKT、RAS、JAK-STAT信號通路，促進腫瘤增殖，被認為是肺癌的驅動基因之一[2-3]。間變性淋巴瘤激酶-酪氨酸激酶抑制劑(anaplastic lymphoma kinase-tyrosine kinase inhibitor，ALK-TKIs)通過與激酶域特定區域(三磷酸腺苷結合口袋)結合，進而抑制其激酶活性，阻斷ALK融合蛋白激活下游通路，從而發揮抗腫瘤作用[2-3]，進而顯著提高ALK陽性晚期NSCLC患者的生存率。但ALK-TKIs治療后腫瘤細胞可進化獲得耐藥性，仍會導致疾病復發。研究表明，ALK-TKIs的獲得性耐藥機制通常為ALK依賴型及非ALK依賴型[4-6]。第二代ALK-TKIs后線治療的耐藥機制中有相對較高比例的ALK激酶域二次突變發生(50%～70%)[5-7]。而體外細胞株研究結果顯示，不同二代ALK-TKIs對不同突變位點的活性存在差異和交叉耐藥[7-9]。因此，有必要深入了解不同二代ALK-TKIs耐藥機制之間的差異，從而對臨床用藥的全局化管理提供佐證。

本研究為觀察性研究，ALK陽性晚期NSCLC患者在二代ALK-TKIs后線治療耐藥后再活檢的腫瘤組織或液體活檢樣本的腫瘤相關基因變異情況，比較不同二代ALK-TKIs的耐藥機制差別，以期指導未來的治療決策。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究納入103例2014年1月至2020年10月本中心確診的ALK融合陽性非小細胞肺癌患者。受試者入組標準：所有患者經病理組織學檢查確診為NSCLC患者；初診時具有完整的影像學和內鏡檢查結果，根據國際肺癌研究協會 (International Association for the Study of Lung Cancer, IASLC)第8版TNM分期明確為IV期或不可根治治療的III期患者； 初始診斷時腫瘤組織標本采用以下任意一種或多種方法檢測為ALK陽性：Ventana免疫組化染色、原位免疫熒光雜交(FISH)、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)或二代測序技術(next generation sequencing，NGS)；接受一代ALK-TKI克唑替尼治療后，按實體瘤的療效評價標準(RECIST 1.1)評估確認為疾病進展，并緊接著以二代ALK-TKIs(阿來替尼、色瑞替尼、布格替尼、恩沙替尼)為后續治療者；在二代ALK-TKIs治療后以RECIST 1.1標準確認為疾病進展，且具有足夠符合標準的生物學標本進行NGS檢測，并具有完整臨床相關信息資料者。排除標準：非ALK+肺癌患者；患者未采取二代TKI作為二線靶向治療方案。本研究經復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準(B2017-142R)，患者均知情同意。

1.2 研究方法

為比較4種二代ALK-TKIs的耐藥后的基因組圖譜，送檢標本包括腫瘤組織、血漿、腦脊液和胸腔積液。為了克服腫瘤異質性，本研究匯集了在同一時間點收集的所有類型合格標本中檢測到的基因改變進行分析。所有樣本與全血樣本匹配，作為陰性對照。生存隨訪：無進展生存期(progression-free survival，PFS)定義為從開始特定ALK-TKIs治療之日起至疾病進展或最后一次隨訪之日。

1.3 基因檢測NGS方法

樣本檢測采用基于靶向425或139個癌癥相關基因的基因組DNA提取和雜交捕獲。如以往研究報道進行 DNA 提取、文庫制備和基于雜交的靶向富集，以及測序和數據分析[10]。2個基因panel均覆蓋ALK基因所有外顯子(包括側翼內含子區域)和融合相關內含子。

腫瘤組織原始中位平均測序深度1310X(128X-4992X)，去dup后中位平均測序深度802X(36X-3728X)；血漿ctDNA和胸水或腦脊液上清cfDNA原始中位平均測序深度5827X(1096X-40334X)，去dup后中位平均測序深度2528X(438X-10158X)。白細胞對照原始平均測序深度>100X。

不同樣本類型基因擴增定義閾值不同，腫瘤組織基因擴增定義為≥4.0拷貝數，血漿ctDNA和胸水/腦脊液上清樣本基因擴增定義為≥3.2拷貝數。

1.4 統計學分析

本研究采用Fisher精確檢驗用于比較不同藥物治療組別患者之間以及不同變異體組別患者之間的基因突變頻率，使用R軟件(4.0.3版本)進行相關統計分析。

2 結果

2.1 患者基線特征

本研究納入2014年1月至2020年10月共計103例符合入組標準的ALK融合陽性晚期NSCLC患者，均為一線克唑替尼治療耐藥后、二線接受二代ALK-TKIs治療后再次耐藥，且行再活檢進行下一代測序(NGS)檢測。中位年齡48(25～76)歲， 大部分為65歲以下、女性、不吸煙、腺癌，其中99例(阿來替尼組56例、色瑞替尼組25例，布加替尼組15例、恩沙替尼組3例)檢測到ALK變異和具有臨床意義的其他腫瘤驅動基因變異納入耐藥后基因變異分子圖譜分析。阿來替尼、色瑞替尼、布加替尼3組患者的中位PFS分別為7.5、6.5和14.2個月，因恩沙替尼僅3例患者，故未統計PFS。具體患者信息見表1。

2.2 二線二代ALK-TKIs 治療后耐藥突變圖譜復雜多樣

66.7%(66/99)檢出ALK激酶結構域耐藥突變，其中G1202R/K比例最高，占18.2%(18/99)，L1196M其次，占14.1%(14/99，圖1)；21.2%(21/99)患者檢出旁路和下游信號通路活化，其中包括PIK3CA(5/99)、KRAS(4/98)、PTEN(4/99)、MET(3/99)。12.1%(12/99)患者出現2種ALK耐藥突變，有5.1%(5/99)患者出現多個ALK耐藥突變(見表2)。此外，有33.3%(33/99)患者耐藥原因為非ALK依賴型。

表1 103例應用二代ALK-TKIs二線治療ALK陽性晚期

圖1 二代ALK-TKIs 二線治療ALK 陽性晚期NSCLC耐藥后基因變異圖譜比例圖

表2 不同ALK-TKIs治療組二線治療ALK陽性晚期NSCLC耐藥后的ALK突變數量 [n =99，例(%)]

注：餅圖的比例是把所有患者檢測到的ALK突變個數相加，計算ALK激酶域每個突變占比

2.3 不同EML4-ALK融合變體不同耐藥基因發生率存在顯著差異

45例V1型變異體和35例V3型變異體經過一代克唑替尼和二代ALK-TKIs二線治療后，ALK繼發突變發生率存在顯著差異。V3型患者更易發生ALK激酶結構域繼發性突變，發生率為85.7%(30/35)，而V1型發生率則僅為55.6%(25/45)(P=0.003 9)。V3型的G1202R/K突變發生率顯著高于V1型，分別為57.1%(20/35)、4.4%(2/45)，差異具有統計學意義(P<0.000 1)。L1196M發生率則在V1型中相對更為常見(31.1%，14/45)，V3型為14.3%(5/35)(P=0.079 4，圖2)。

2.4 不同二代TKI二線治療耐藥突變圖譜存在差異

因為此次入組的恩沙替尼患者只有3例，不具代表性，因此主要分析了其余3種二代TKIs的耐藥后基因變異圖譜(圖3)。阿來替尼、色瑞替尼和布加替尼3種藥物二線治療耐藥后的主要差異之一為ALK繼發突變發生率不同，分別為76.8%(43/56)、48%(12/25)、53.3%(8/15)(P=0.02)，其中阿來替尼的ALK繼發突變發生率最高。

其次是耐藥位點存在差異：其中G1202R發生率分別為31.6%(阿來替尼)，33.3%(色瑞替尼)及10.0%(布加替尼)，但P值無顯著差異(P=0.24)；G1269A(7/56)均發生在阿來替尼組(P=0.07)，其中有2例為與其他ALK位點的復合突變；色瑞替尼G1202R、L1196M、F1174X和C1156Y發生率較高；而布加替尼F1174X、D1203N、E1210K發生率較高。D1203N(P=0.000 2)和E1210K(P=0.003 5)主要發生在布加替尼耐藥后，布加替尼組F1174X發生率也高于阿來替尼和色瑞替尼組(P=0.13，圖4)。

3 討論

3.1 ALK-TKIs治療ALK陽性晚期NSCLC耐藥后基因變異圖譜具有共性

本研究為目前最大樣本量、根據耐藥后再活檢的NGS結果，比較同期接受不同二代ALK-TKIs治療耐藥后基因變異圖譜異同的真實世界研究。雖然目前對ALK-TKI的獲得性耐藥機制基本已有初步認識[4,11]，主要為以下四種類型：①ALK激酶結構域的耐藥突變；②旁路及下游信號通路的激活(如EGFR擴增、IGF1R過表達、HER2擴增、MET擴增、BRAFV600E突變等)；③組織學轉化(如腺癌-小細胞癌轉化等)；④一代ALK-TKIs藥物的藥代動力學因素導致的耐藥，但一代ALK-TKIs與二代ALK-TKIs的上述各耐藥機制發生占比有所差異[6]，二代ALK-TKIs耐藥后ALK激酶結構域的耐藥比例達50%～60%，遠高于一代ALK-TKIs的20%～30%。有研究報道克唑替尼最常見的ALK獲得性耐藥突變為G1269A、F1174X和L1196M；而接受過一種或多種二代ALK-TKIs治療患者主要的ALK耐藥突變為G1202R/del。我們此次研究的結果也進一步佐證了這一現象。

圖3 二代ALK-TKIs二線治療ALK陽性晚期NSCLC耐藥后基因突變圖譜

注：餅圖的比例是把所有患者檢測到的ALK突變個數相加，計算ALK激酶域每個突變占比

3.2 不同變異體ALK陽性晚期NSCLC二代ALK-TKIs二線治療后的耐藥基因圖譜存在顯著差異，提示臨床治療決策時需要充分考慮ALK變異的異質性

本研究比較了V1和V3型患者接受二線二代ALK-TKIs治療后的耐藥機制差異。V1及V3型是ALK融合患者最常見的兩種變體，本研究納入的V1及V3型患者占總研究人群的78.7%，兩者間的耐藥機制存在差異：V3型患者的ALK激酶結構域突變比例明顯高于V1型，且V3的G1202R突變型明顯高于V1型，具有統計學差異。這與既往報道相一致[16]。本研究亦觀察到V1型患者的L1196M突變明顯高于V3型患者的趨勢。這些發現有助于為ALK陽性晚期NSCLC患者的精準分層治療提供依據，例如，V3亞型的患者是否可以優先推薦三代ALK-TKI的前線應用，從而規避后續獲得性G1202R耐藥，以期延長患者的PFS甚至OS。

3.3 不同二代ALK-TKIs用于二線治療ALK陽性晚期NSCLC的耐藥突變圖譜差異明顯，且復合突變比例高，無法充分發揮其特異性抑制ALK變異的優勢

本研究結果進一步發現不同二代ALK-TKIs的ALK耐藥突變存在差異。阿來替尼耐藥后ALK激酶結構域突變比例最高。對于二代ALK-TKI治療患者最常見的耐藥突變G1202R突變，則更常見于阿來替尼和色瑞替尼，這也是符合既往文獻的分析報道[6]。G1296A(7/56)突變則全部發生在阿來替尼組，其中有3例患者同時存在G1296A位點和其他位點的復合突變，2例患者同時存在PTEN等旁路或下游信號通路激活，其他2例患者僅僅找到G1296A的單一位點突變。因此對于G1296A是否為阿來替尼獨有的耐藥機制需作以下思考：① 在ALK-TKIs的體外試驗顯示色瑞替尼和阿來替尼均能有效抑制G1296A突變，但體外試驗的結論并不能完全替代藥物的臨床療效，因此在色瑞替尼組無一例出現G1296A突變，反之驗證了G1296A可能是阿來替尼獲得性耐藥的重要位點[7]；②G1296A也常見于克唑替尼耐藥后，因本試驗缺乏克唑替尼耐藥后的基因數據做參考，無法確定G1296A出現的與治療相關的時間節點[6]；③對于同時存在其他ALK復合突變及旁路或下游信號通路活化的患者，需考慮除外G1296A，存在阿來替尼多重耐藥機制的可能；④ 存在其他沒有檢測到的耐藥基因(如血液樣本檢測對MET擴增檢測的挑戰)。另外，布加替尼組耐藥突變D1203N(4/15)、E1210K(3/15)發生率高于阿來替尼組和色瑞替尼組。同樣從體外試驗來看，單一的D1203N及E1210K突變均對布加替尼敏感[7]，而本試驗布加替尼組耐藥后出現的D1203N及E1210K突變比例最高。仔細分析可以看到本組試驗人群中其中D1203N突變均為ALK復合突變，而3例E1210K突變有2例為ALK復合突變，這也能解釋布加替尼的耐藥原因。二代ALK-TKIs二線治療耐藥機制的異同，進一步佐證了多種ALK-TKIs的先后應用可能會導致后續產生多種復雜的耐藥機制共存的現象，如包含ALK的復合突變與ALK合并其他旁路下游通路激活等同時發生。這一復雜耐藥機制必將增加后續治療難度。二代ALK-TKIs的交替應用，或三代ALK-TKI也未必能全面克服這些多種耐藥機制共存的復雜局面。

本研究中出現ALK位點的復合突變比例較文獻報道略高，可能的原因一是與連續的ALK-TKIs的應用導致ALK的復合突變有關，也可能是由于NGS檢測平臺探針設計覆蓋ALK基因所有外顯子(包括側翼內含子區域)和融合相關內含子，使ALK檢出率提高，但更為重要的是，復合突變無疑會增加后線藥物治療難度。

因此二代ALK-TKIs應用于二線治療無疑較難發揮他們特異性抑制ALK基因變異的優勢。本研究中阿來替尼、色瑞替尼、布加替尼三組的中位PFS分別僅為7.5，6.5及14.2個月，與目前已報道的二代ALK-TKI二線治療臨床研究報道中位PFS相仿[12-15]，遠不如二代ALK-TKIs一線治療ALK陽性晚期NSCLC的數據。臨床上有必要將高效的特異性抑制劑前線使用，發揮最大療效。同時，也必須重視基因的動態監測在ALK陽性患者治療過程中的重要性，幫助臨床醫生明確患者耐藥機制，采用針對性的新一代靶向治療，或采用基于化療或其他靶點的聯合治療，當然這都需要未來臨床研究進一步驗證。

3.4 本研究的局限性

因本研究開展的時間和藥物的可及性因素影響，入組的患者均采用克唑替尼作為一線治療。當今ALK陽性晚期NSCLC患者一線治療優先推薦二代或者三代ALK-TKIs，因此我們還需要深入研究新一代ALK-TKIs一線治療的耐藥機制差異，助力對ALK陽性晚期NSCLC患者一線精細分層精準治療和全程治療策略的全局把握。

本研究還具有以下幾個局限性：①本研究缺少克唑替尼耐藥后樣本，比較遺憾無法分辨克唑替尼一線治療和二代ALK-TKIs二線治療耐藥誘導的ALK耐藥突變。②由于組織可及性有限以及血漿檢測MET擴增的挑戰性，我們無法對所有患者進行MET突變分析，可能對MET擴增耐藥機制的發生率會有一定影響。

總之，本研究深入分析了幾種2代ALK-TKIs藥物作為二線治療ALK陽性晚期NSCLC患者的獲得性耐藥基因變異圖譜的共性與差異。再次驗證了ALK激酶結構域的耐藥突變是二代ALK-TKIs最主要的獲得性耐藥機制；發現不同的變體如V1及V3型患者的耐藥突變譜有所不同；且不同的2代ALK-TKIs耐藥譜亦有差異，不僅加深了對ALK-TKIs耐藥機制的理解，而且為臨床制定ALK陽性晚期NSCLC治療方案的決策提供了重要參考。