基于網絡藥理學的金銀花-連翹藥對干預銀屑病的分子機制*

曹一欽，文昌暉，△，王秀琳，張玲麗，賈敏，李斌

1貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550001；2貴州中醫藥大學第一附屬醫院皮膚科；3上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院

銀屑病是一種遺傳與環境共同作用誘發的免疫介導的慢性、復發性、炎癥性、系統性疾?。?］，其發病機制主要與遺傳、環境及機體免疫等因素相關；典型臨床表現為鱗屑性紅斑或斑塊，局限或廣泛分布，無傳染性，治療困難，常終身帶??；主要病理表現為以T淋巴細胞介導為主的多種免疫細胞共同參與的免疫反應引起角質形成細胞過度增殖或關節滑膜細胞與軟骨細胞發生炎癥。

消疕湯是貴州省名中醫賈敏教授經驗方，在臨床運用30來年，用于治療尋常型銀屑病進行期中醫辨證屬血熱風燥證者。金銀花、連翹二藥均為消疕湯的君藥，現代藥理研究認為金銀花、連翹均有抗炎、抑菌、調節免疫等作用［2-3］?，F結合網絡藥理學原理探究金銀花-連翹藥對干預銀屑病的分子通路及作用機制。

1 中藥網絡藥理學思路

基于網絡藥理學研究方法，應用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)等［4］，構建關于金銀花-連翹藥對干預銀屑病作用機制的“中藥-成分-靶標-通路”網絡，為進一步研究銀屑病發病機制及中醫藥治療提供思路。

1.1 數據來源與方法

1.1.1 金銀花-連翹化學成分和潛在作用靶標收集依據《中華人民共和國藥典》（2015年版），通過TCMSP平臺（http：//tcmspw.com/tcmsp.php，中國藥科大學）在中藥信息設定界面對“金銀花”“連翹”進行檢索并收集其所有化學成分，同時按照篩選標準［5］口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30.0%和藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18選取有效成分，建立金銀花-連翹化學成分信息數據庫。通過TCMSP平臺Related Targets信息數據檢索界面，分別收集金銀花-連翹潛在作用靶標，建立金銀花-連翹活性成分與潛在作用靶標的聯系網絡。

1.1.2 銀屑病靶標收集通過GeneCards平臺（https：//www.genecards.org），以銀屑病的英文名稱“Psoriasis”為關鍵詞進行檢索，收集到疾病靶標數據庫中目前已知的銀屑病治療靶點作為金銀花-連翹藥對的候選治療靶標，靶標信息主要包括治療銀屑病藥物的名稱、療效、臨床應用、作用靶標的基因及蛋白質等相關信息。

1.1.3 蛋白質-蛋白質相互作用信息（PPI）通過TCMSP整合了String平臺（https：//string-db.org/cgi/input.pl）等數據庫中蛋白質-蛋白質相互作用信息。以置信度得分大于0.4為篩選參數分析金銀花-連翹藥對干預銀屑病靶點之間的相互作用關系，運用Cytoscape軟件構建PPI，并通過Network Analyzer工具分析網絡中節點的度值，根據度值的排序確定核心靶點。

1.1.4 網絡構建與分析通過網絡綜合分析，構建藥對潛在靶標與疾病靶標之間的PPI信息網絡特征值，運用Cytoscape軟件的MCODE插件篩選蛋白互作網絡中的蛋白模塊，篩選關鍵蛋白模塊。取中藥靶標-疾病靶標互作網絡的核心節點，以度值=2、節點=2和最大深度=100作為篩選參數，選取藥對潛在靶標-疾病靶標相互作用網絡的關鍵節點［6］。通過基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路，挖掘分析金銀花-連翹藥對干預疾病關鍵靶標及其對應的活性成分，并構建“中藥-核心成分-關鍵靶標-主要通路”的網絡通路圖，進一步明確金銀花-連翹藥對干預銀屑病的主要分子作用機制。

1.1.5 關鍵靶標分析及通路富集結合TCMSP和String數據庫信息，整合GO（http：//www.gene ontology.org）和KEGG（http：//www.kegg.jp）資源，直接提取靶標基因或蛋白質分子功能、細胞內定位及其所參與的生物學反應和通路，運用R軟件處理相關數據，將金銀花-連翹藥對干預銀屑病的關鍵作用靶標進行基因功能和通路富集分析，以P值降序的方式將GO和KEGG計算分析的結果排列顯示，并應用R軟件繪制GO和KEGG富集分析氣泡圖。

2 結果

2.1 金銀花-連翹藥對化學成分靶標預測及分析通過TCMSP數據庫共收集得到金銀花活性成分236個，主要為有機酸類、黃酮類、環烯醚萜苷類、三萜皂苷類、揮發油類；連翹化合物150個，主要為苯乙醇苷類、木脂素類、萜類、黃酮類及揮發油類、生物堿類。按OB≥30.0%和DL≥0.18標準篩選后，金銀花-連翹藥對化合物與銀屑病相關的成分共28個，金銀花成分15個，連翹成分17個，兩藥相同成分4個：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、β-谷固醇（beta-sitosterol），藥對度值≥20個共6個，占21.43%。由此可見，“金銀花-連翹”中的候選化合物分子可能多靶標、多途徑作用于整個生物網絡系統，提示金銀花和連翹在共性靶標之間存在明顯潛在加成作用。見表1。

表1 “金銀花-連翹”藥對干預銀屑病的28個活性成分

對“金銀花-連翹”藥對活性成分通過TCMSP平臺進行作用分析，取Degree排名前20，得到候選靶標具有的基因功能信息涉及：前列腺素G/H合酶1和2、半胱胺酸天冬氨酸酶（Caspase）-3和9、胰蛋白酶-1、間質膠原酶、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、谷胱甘肽S-轉移酶Mu2，核受體輔激活劑、細胞凋亡調節劑，鈉通道蛋白型5亞基α，β-2腎上腺素能受體、聚乙二醇腎上腺素能受體、雌激素受體、過氧化物酶體增殖物激活受體γ、雄激素受體，鉀電壓門控通道亞科H成員，γ-氨基丁酸受體亞基α-1、轉錄因子AP-1、細胞凋亡調節因子等。

2.2 “金銀花-連翹”藥對治療銀屑病的核心靶標網絡共獲得銀屑病相關差異基因3601個，藥對共同作用靶點127個，其中金銀花115個，連翹121個，兩藥相同的靶標112個。

通過TCMSP的PPI相互作用數據庫，構建“金銀花-連翹”藥對的潛在靶標與疾病靶標相互作用網絡，取排名前30，得到候選靶標基因，Akt1、ALB、IL6、VEGFA等靶標排名靠前?；蚬δ苄畔⑸婕埃捍萍に厥荏w(estrogen receptor，ESR)、核激素受體、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)受體、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)受體，調節T細胞、B細胞、內皮細胞，抑制活化巨噬細胞、輔助T細胞的產生，調節新陳代謝、血管生成、脂肪分解，促炎細胞因子、炎細胞因子，調節蘇氨酸激酶、酪氨酸蛋白激酶、受體酪氨酸激酶活性，調節細胞外刺激引起的細胞級聯反應，EGF受本信號通路、轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGFβ)介導的信號轉導通路、SAP/JNK信號通路、胸腺-磷酸（MAP）激酶信號轉導通路、核轉錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路等。由此可知銀屑病的發病機制涉及多個病理環節的不同分子作用過程。見圖1。

圖1 “金銀花-連翹”藥對的潛在靶標（前30名）

2.3 金銀花-連翹藥對干預銀屑病關鍵靶標的GO基因功能分析通過GO功能分析“金銀花-連翹”藥物靶標與疾病靶標基因功能，獲得138個條目，具有顯著意義的有127個條目（P＜0.01），采用P值降序和基因富集數量綜合過濾，對其進行排序，前20名的生物學功能主要涉及：核受體的活性、轉錄因子活性、細胞因子受體結合、細胞因子活性、類固醇激素受體活性、受體配體活性、泛素樣蛋白連接酶結合、磷酸酶整合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、氧化還原酶活性、血紅素結合、蛋白磷酸酶整合、四吡咯整合、激素受體結合、核激素受體結合、泛素蛋白連接酶結合、激活轉錄因子結合、激酶調節活性、整合蛋白結合、BH功能點位整合，見表2、圖2。

圖2 “金銀花-連翹”藥對候選靶標具有的功能信息氣泡圖（前20名）

表2 “金銀花-連翹”藥對候選靶標具有的功能信息

2.4 “金銀花-連翹”藥對治療銀屑病KEGG的通路富集分析KEGG通路富集分析共獲得155條通路，具有顯著意義的有145條通路（P＜0.01），采用P值降序和基因富集數量綜合過濾，前20名干預銀屑病的主要作用通路涉及：糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)信號通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、前列腺癌、乙型肝炎、人巨細胞病毒感染、丙型肝炎、膀胱癌、蛋白多糖在癌癥中的作用、南美錐蟲?。乐掊F蟲?。?、胰腺癌、C型凝集素受體信號通路、小細胞肺癌、內分泌抗性、結腸直腸癌、甲型流感、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號通路、麻疹，其中PI3K-Akt信號通路的度值最高（Degree=31）。見圖3—4、表3。

表3 “金銀花-連翹”藥對候選靶標參與的通路信息

圖3 “金銀花-連翹”藥對候選靶標參與的通路信息氣泡圖（前20名）

圖4 “金銀花-連翹”藥對干預銀屑病關鍵靶標通路信息

3 討論

消疕湯有清熱疏風、涼血止癢功效。研究發現：消疕湯可以降低銀屑病患者血清中促炎細胞因子水平（如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-17、IL-22、IL-23等），升高抑炎因子（TGF-β1、SOD、IL-10等）水平，升高血清Treg細胞比例，使得Th17/Treg水平趨于平衡，以調節免疫狀態、控制炎癥反應［7-10］。動物實驗研究發現，消疕湯可以抑制銀屑病模型組大鼠皮膚角質細胞的角化不全及角化過度，并減少炎癥細胞在皮損部位的浸潤［11］。銀屑病屬中醫學“白疕”范疇，多因素體營血虧虛，血熱內蘊，化燥生風，肌膚失養而成。李斌教授［12-13］認為尋常型銀屑病的病機為血熱陽浮，以熱為主，病位在血分，血熱是根本病機，宜“從血論治”，并使用辛散宣發或輕清宣透之品，使伏藏的邪氣或由表或由上而解，或由里達外而解。金銀花、連翹二藥為消疕湯中的君藥，性味輕揚宣散，有清熱涼血、發散宣透功效?，F代藥理研究認為：金銀花、連翹有抗炎、抑菌、調節免疫作用［2-3］。金銀花-連翹藥對度值最高的化學成分是槲皮素、木犀草素，均為黃酮類?，F代藥理研究認為槲皮素是一種黃酮類抗氧化劑，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降糖及免疫調節等作用［14］，可減少（IL-1β、IL-6、MCP-1、IP-10、G-CSF、TNF-α和VEGF）等促炎細胞因子的產生［15］，增加抗炎細胞因子（IL-4、IL-10和TGF-β1等）水平［16］，還可以抑制TGF-β1過度表達［17］，從而發揮抗炎作用。WILLIAMS等［18］研究發現：槲皮素是廣泛的激酶抑制劑，可作用于PI3K-Akt通路，調節酪氨酸激酶、蛋白激酶C（PKC）和絲裂原活化蛋白激酶水平。木犀草素有消炎、抗過敏、降尿酸、抗菌、抗病毒等作用［3］。

目前認為銀屑病的發生發展與T輔助細胞（Th）、樹突狀細胞（DC）、巨噬細胞（MC）、角質形成細胞（KC）及其分泌的細胞因子之間復雜的相互作用密切相關。喬菊等［19］認為TNF-α信號通路、IL-17通路在銀屑病發病機制中有重要作用。丁琦等［20］發現銀屑病患者血清Th17和IL-17水平上升，Treg表達下降，進一步證實了Th17/Treg失衡是銀屑病發病的關鍵因素。銀屑病的重要病理改變是皮損區微循環異常及血管內皮功能受損，予改善血管內皮功能及調節微循環的藥物治療后可緩解病情［21-22］。角質形成細胞過速增殖也是其病理特征之一，其機制尚不清楚。張淼等［23］認為：PI3K-Akt信號轉導通路對研究銀屑發病機制有一定指導作用。

PI3K-Akt信號通路：目前研究表明PI3K-Akt信號轉導通路是細胞存活的重要通路，參與細胞生長、細胞增殖、血管新生、細胞能量代謝和腫瘤細胞侵襲等多個過程，在細胞生長、增殖等功能中起重要作用［24］，Akt是PI3K的下游靶蛋白，也是PI3K信號通路的關鍵分子，通過磷酸化其下游FoxO、mTOR等蛋白來調控細胞增殖與凋亡。國內外研究表明，銀屑病的發生涉及一個未知的環境因素，它作用于遺傳易感性宿主，從而觸發炎性和免疫性級聯反應［25-27］。應激化角質細胞釋放出一系列因子激活真皮層樹突細胞，后者隨后進入淋巴結釋放出IL-12和IL-23，促進T細胞分化為Th1和Th17細胞，并通過趨化因子和黏附分子轉移至真皮層和表皮層，之后激活的T細胞在真皮層激活巨噬細胞并釋放出眾多的炎性細胞因子（包括TNF-α、IFN-γ和IL-17），繼而導致角質形成細胞的活化和增殖，臨床表現為銀屑病斑塊。Akt是PI3K信號通路下游直接的靶蛋白，Akt活性增強可引起角質細胞的過度增殖和真皮乳頭血管增生［28］。

IL-17信號通路：在外界刺激下DC過度分泌TNF-α和IL-23（包括IL-12），IL-23誘導幼稚T淋巴細胞分化為Th17細胞，Th17細胞產生的IL-17和IL-22水平升高。Treg細胞與Th17細胞是一種CD4+T淋巴細胞亞群在不同條件下分化生成，分別介導免疫耐受與炎癥反應，兩者在功能上相互拮抗。在銀屑病起始階段，未知的環境刺激或耐受性喪失（例如自身抗原活化）導致TNF的產生和隨后皮膚樹突細胞的活化，來自皮膚樹突細胞的細胞因子IL-23大量增加，隨后刺激Th17細胞、CD4+輔助性T細胞、細胞毒性CD8+T細胞數量增加，產生大量IL-17、IL-22和TNF-α［29］，導致促炎細胞因子的產生，包括IL-1β、IL-6和TNF-α以及表皮角質細胞的依賴性增殖。IL-17與其相應受體結合后激活下游p38MAPK信號通路［30］，繼而上調IL-6表達，直接刺激銀屑病患者表皮增生［31］；IL-17可上調IKKα/β磷酸化，通過NF-κB信號通路調節趨化因子、細胞因子（IL-6、TNF-α、COX-2），導致中性粒細胞募集移行并聚集于銀屑病皮損之中，IL-17還可誘導生成VEGF，從而誘發或加重銀屑病皮損。Th17細胞及其分泌的細胞因子IL-17、IL-6、IFN-γ水平升高，抑制性Treg細胞數量減少，分泌的抑制性細胞因子IL-10含量減低，可誘發皮損區炎癥細胞及T淋巴細胞聚集浸潤、增生，致使銀屑病久治不愈［29-32］。

TNF信號通路：TNF-α是一種重要的促炎癥性細胞因子，具有促進多種細胞因子產生和調節免疫反應信號網絡的作用，可引起機體強烈的炎癥反應［33］。TNF-α可直接促進皮膚角質形成細胞增生［34］。TNF-α能通過激活銀屑病相關基因與IL-17協同活化角質形成細胞，募集嗜中性粒細胞等炎癥細胞浸潤，誘導產生抗菌肽，過度分泌的TNF-α反作用于DC刺激異常免疫反應持續進行［35］，TNF-α可通過誘導T細胞來表達VEGF，促進銀屑病患者真皮乳頭層毛細血管的擴張和扭曲，以及斑塊的形成［36］。TNF-α參與全身過敏反應，增加血管內皮細胞的黏附分子表達［37］，從而促進血管增生，加重銀屑病皮損。

綜上所述，應用網絡藥理學方法對金銀花-連翹藥對干預銀屑病的活性成分、關鍵靶點和分子通路機制進行了初步預測，為進一步研究消疕湯干預銀屑病提供了思路。由于數據庫數據不全，且忽略了中藥成分含量、相互作用以及體內其他藥代動力學影響等，具體機制有待臨床或動物實驗的進一步研究，因此本研究尚有一定局限性。