基于Notch1/NF-κB信號通路探究補陽還五湯對腦缺血再灌注損傷的拮抗作用及其機制*

李偉藝，劉紅松，高山瑛，蘇志強

漢中市人民醫院中醫康復科，陜西 漢中 723000

缺血性腦卒中是具有高致殘率和致死率的臨床常見疾病，是腦卒中相關死亡的主要原因［1］。雖然恢復腦組織血液供應是治療急性缺血性腦卒中的主要目的，但這一過程同時加重了腦組織損傷，即腦缺血再灌注損傷［2］。腦缺血再灌注損傷的發生發展過程復雜，涉及炎癥反應、氧化應激反應、細胞凋亡等，目前臨床尚無有效治療方法［3］。補陽還五湯是治療缺血性腦卒中氣虛血瘀證的經典中藥方劑。研究表明，補陽還五湯單獨或聯合其他療法對缺血性腦血管病及其后遺癥均有療效，能抑制氣虛血瘀證患者內皮細胞凋亡，促進神經元再生［4-7］。雖然已有研究表明補陽還五湯對腦缺血疾病具有再灌注保護和治療作用，但其作用機制仍需進一步探討。Notch信號通路是一個進化高度保守的信號轉導途徑，在調節細胞增殖、分化和凋亡過程中起重要作用。缺血性腦卒中發生后，Notch通路的相關因子表達水平改變，激活核轉錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，加重炎癥反應，影響疾病的發展進程［8-10］。本研究以Notch/NF-κB信號通路為切入點，分析補陽還五湯對腦缺血再灌注損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周齡SPF級SD大鼠75只，雌雄各半，體質量180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2016-0006。飼養條件：室溫（22±1）℃，濕度（50±10）%，每天定時換氣，保持12 h∶12 h光暗照明，食水不限。

1.2 藥物、試劑與儀器補陽還五湯（黃芪120 g，當歸6 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，紅花3 g，川芎3 g，地龍3 g）由漢中市人民醫院藥劑科煎制濃縮成含生藥2 g/mL藥液；Jagged1（MCE公司，貨號：HY-P1846A）；TTC染色液、HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；Revert AidTM first Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo Scientific）；神經源性位點缺口同源蛋白1抗體（Notch1）、NF-κB p65、磷酸化激活核轉錄因子κB p65（phosphorylated nuclear factor-κB p65，p-NF-κB p65）、發狀分裂相關增強子1（hairy division related enhancer,Hes1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceral-dehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔單抗、羊抗兔二抗（美國CST公司）；DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；7500型PCR儀（美國Applied Biosystems）；IX53型顯微鏡（日本奧林巴斯）；G：BOX型多功能凝膠成像系統（Syngene）；Multiskan MK3型酶標儀（Thermo Fisher Scientific）。

1.3 方法

1.3.1 分組、造模與給藥75只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、補陽還五湯組、補陽還五湯+Jagged1組、Jagged1組，每組15只，適應性飼養3天后造模。參考文獻［11］方法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，缺血90 min后去除線栓恢復血流供應，即再灌注24 h。各給藥組大鼠于術后清醒2 h后開始給藥，補陽還五湯組大鼠灌胃補陽還五湯16 g/kg，早晚各1次，連續7天；補陽還五湯+Jagged1組大鼠灌胃補陽還五湯藥液16 g/kg，早晚各1次，同時腹腔注射25 mg/kg Jagged1溶液，隔日1次，連續7天；Jagged1組大鼠腹腔注射25 mg/kg Jagged1溶液，隔日1次，連續7天；假手術組、模型組大鼠灌胃等量生理鹽水。

1.3.2 神經功能評分采用Longa法進行神經功能評分，0分：無神經損傷癥狀；1分：對側前爪不能完全伸展；2分：行走時向外側轉圈；3分：行走時向外側傾倒；4分：不能自發行走，意識喪失；5分：死亡，評分為4～5分大鼠剔除實驗。

1.3.3 大鼠腦梗死體積檢測（TTC染色）實驗結束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，-20℃冷凍20 min，沿冠狀面將大腦切成2 mm厚的連續5份切片，置于0.2% TTC染色液中，37℃避光孵育30 min，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后拍照，Image J軟件計算大鼠腦梗死體積。

1.3.4 大鼠海馬神經元損傷觀察（HE染色）大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，斷頭取腦，腦組織用4%多聚甲醛固定，冠狀切取含海馬的視交叉前后3 mm腦組織，常規脫水、透明，石蠟包埋，切片（厚度為4 μm），脫蠟至水，行HE染色，觀察大鼠海馬神經元損傷情況。

1.3.5 海馬組織IL-6、TNF-α、MDA含量和GSH-Px、SOD活性檢測（ELISA法)大鼠麻醉后處死，分離海馬組織，檢測海馬組織IL-6、TNF-α、MDA含量和GSH-Px、SOD活性。

1.3.6 B淋巴細胞瘤(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bax、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）mRNA水平檢測（RT-qPCR）取各組大鼠海馬組織，加入Trizol裂解液提取總RNA，使用RevertAidTM first Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版。引物由日本Takara公司設計合成，引物序列見表1。反應體系：dNTPs 0.5 μL+5×Buffer 5 μL+Taq酶0.3 μL+MgCl2 1.5 μL+cDNA模板2 μL+上下游引物各1 μL，加去離子水至總體積25 μL。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環，最后72℃延伸10 min，4℃5 min終止反應，實驗重復3次。采用2-△△CT法計算目的基因mRNA相對表達水平。

表1 引物序列

1.3.7 Notch1/NF-κB信號通路蛋白表達檢測（Western blot法）取各組大鼠海馬組織，研磨勻漿后提取組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，定量完畢后于蛋白中加入loading buffer，在EP管中混勻，置于沸水中煮沸5 min使蛋白變性。隨后配置15%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，上樣后80 V電泳2 h，60 V轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，一抗稀釋比例為1∶2000，4℃過夜，第2天用TBST緩沖液清洗3次，每次10 min，然后加入羊抗兔二抗（1∶1000），37℃孵育2 h，TBST緩沖液清洗3次后滴加ECL發光液，反應1 min后置于凝膠成像系統顯影。Western blot實驗的內參蛋白為GAPDH，應用Image J軟件分析各蛋白對應灰度值，計算蛋白相對表達量。

蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值

1.4 統計學方法應用SPSS 25.0軟件分析數據，計量資料以±s表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠神經功能損傷情況與假手術組比較，模型組大鼠出現嚴重神經功能損傷，神經功能評分升高（P＜0.05），經補陽還五湯干預后，大鼠神經功能評分降低（P＜0.05）。與補陽還五湯組比較，補陽還五湯+Jagged1組和Jagged1組大鼠神經功能評分升高（P＜0.05），且Jagged1組大鼠神經功能評分高于補陽還五湯+Jagged1組。見圖1。

圖1 各組大鼠神經功能評分

2.2 大鼠腦梗死體積變化情況與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死體積增加（P＜0.05）。與模型組比較，經補陽還五湯干預后大鼠腦梗死體積減少（P＜0.05）。與補陽還五湯組比較，補陽還五湯+Jagged1組和Jagged1組大鼠腦梗死體積增加，Jagged1組大鼠腦梗死情況更嚴重（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠腦梗死體積比較

2.3 大鼠海馬神經元損傷情況HE染色結果顯示，假手術組海馬神經元細胞結構完整、排列緊密，細胞核清晰，染色均勻。模型組海馬神經元結構被嚴重破壞，細胞核變形、固縮、破碎，染色加深，細胞排列松散且有空腔形成。補陽還五湯干預后海馬神經元損傷情況改善，Jagged1干預使補陽還五湯對海馬神經元的保護作用減弱，且Jagged1組海馬神經元損傷較補陽還五湯+Jagged1組更嚴重。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬神經元損傷情況（HE×400）

2.4 大鼠海馬組織炎癥和氧化應激情況與假手術組比較，模型組海馬組織IL-6、TNF-α、MDA含量增加，GSH-Px、SOD活性降低（P＜0.05）。與模型組比較，補陽還五湯組海馬組織IL-6、TNF-α、MDA含量降低，GSH-Px、SOD活性增加（P＜0.05）。與補陽還五湯組比較，補陽還五湯+Jagged1組和Jagged1組IL-6、TNF-α、MDA含量增加，GSH-Px、SOD活性降低（P＜0.05），且Jagged1組IL-6、TNFα、MDA含量高于補陽還五湯+Jagged1組，GSH-Px、SOD活性低于補陽還五湯+Jagged1組。見表2。

表2 各組大鼠海馬組織炎癥因子和氧化應激水平比較（±s）

注：a表示與假手術組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05；c表示與補陽還五湯組比較，P＜0.05；d表示與補陽還五湯+Jagged1組比較，P＜0.05

組別假手術組模型組補陽還五湯組補陽還五湯+Jagged1組Jagged1組鼠數15 12 13 12 11 IL-6（ng/L）250.15±39.41 790.56±52.82a 349.21±33.64ab 687.25±40.92abc 867.65±46.37abcd TNF-α（ng/L）230.41±32.68 1600.95±47.13a 890.65±45.38ab 1307.26±48.72abc 1901.85±60.14abcd MDA（nmol/mg）11.22±1.34 19.32±1.26a 14.81±1.22ab 16.88±1.29abc 22.94±1.38abcd GSH-Px（U/mg）96.26±9.88 42.32±7.21a 70.68±8.02ab 55.29±6.94abc 33.84±6.12abcd SOD（U/mg）230.59±17.42 102.46±15.33a 195.62±16.84ab 157.34±19.72abc 90.59±13.95abcd

2.5 大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表達與假手術組比較，模型組海馬組織Bax與Caspase-3的mRNA表 達 增 加，Bcl-2 mRNA表 達降低（P＜0.05）。與模型組比較，補陽還五湯組Bax與Caspase-3的mRNA表達降低，Bcl-2 mRNA增加（P＜0.05）。與補陽還五湯組比較，補陽還五湯+Jagged1組 和Jagged1組Bax、Caspase-3的mRNA表達增加，Bcl-2 mRNA表達降低（P＜0.05），且Jagged1組Bax、Caspase-3的mRNA表達高于補陽還五湯+Jagged1組，Bcl-2 mRNA表達低于補陽還五湯+Jagged1組。見圖4。

圖4 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表達

2.6 Notch1/NF-κB信號通路相關蛋白表達與假手術組比較，模型組海馬組織Notch1、p-NF-κB p65及Hes-1蛋白表達水平均上調（P＜0.05），NF-κB p65蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）；補陽還五湯干預后Notch1、p-NF-κB p65及Hes1蛋白表達水平降低（P＜0.05），NF-κB p65蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）；在補陽還五湯基礎上加入Jagged1干預，Notch1、p-NF-κB p65及Hes1蛋白表達增加，Jagged1組上述蛋白表達量高于補陽還五湯+Jagged1組（P＜0.05），NF-κB p65蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠Notch1/NF-κB信號通路蛋白表達

3 討論

缺血性腦卒中是指由于腦供血動脈狹窄或閉塞引起腦供血不足所致的腦組織壞死的總稱，其治療方法以溶栓為主，但在治療過程中可能繼發新的病理改變，誘發缺血再灌注損傷［12-13］。腦缺血再灌注損傷過程中的炎癥和氧化應激反應是引起腦卒中患者腦組織損傷、運動和認知神經功能異常的主要原因，可間接反應患者的腦損傷程度［14］。本研究采用線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠出現明顯神經功能損傷，腦梗死體積顯著增加，神經元損傷明顯，海馬組織炎癥因子IL-6和TNF-α含量增加，氧化應激因子MDA含量增加，GSH-Px、SOD活性降低，表明模型組大鼠腦組織發生炎癥和氧化應激反應，腦損傷明顯，提示造模成功。

補陽還五湯是治療氣虛血瘀證腦中風恢復期的經典方劑，方中重用黃芪大補臟腑經脈營衛之氣，當歸、赤芍、桃仁、紅花、川芎共為臣藥行氣活血，地龍為佐藥通經活絡、舒暢血脈，諸藥相互為用，共奏補氣活血通絡之功效［15］。本研究結果顯示，補陽還五湯干預后大鼠神經功能損傷減輕，腦梗死體積縮小，海馬神經元損傷減輕。大量研究表明，氧化應激和炎癥反應作為腦缺血再灌注后的關鍵分子機制，其對缺血性腦疾病的發生發展過程具有重要作用，針對這些機制進行靶向治療顯示出較好的神經保護作用［16-17］。周佳［18］、賈壯壯等［19］研究表明，抑制氧化應激和炎癥反應能夠抑制神經細胞凋亡，有效減輕腦缺血再灌注大鼠神經功能缺損。本研究結果顯示，補陽還五湯可降低腦缺血大鼠海馬組織中IL-6、TNF-α、MDA含量，提高GSH-Px、SOD活性。Bcl-2和Bax是調控細胞凋亡的關鍵基因，Bax過表達可促進細胞凋亡，而Bcl-2可與Bax形成二聚體抑制Bax基因表達，從而抑制細胞凋亡，Bcl-2和Bax可共同激活促凋亡因子Caspase-3及其家族的其他因子，引起衰老和凋亡的發生［20］。在本研究中，經補陽還五湯干預后腦缺血大鼠海馬組織Bax與Caspase-3的mRNA表達降低，Bcl-2 mRNA增加，表明補陽還五湯對腦缺血再灌注損傷具有抗炎、抗氧化應激和抗凋亡作用。

Notch信號通路在進化上有高度保守性，與細胞增殖、分化、凋亡及干細胞自我更新活動密切聯系，是調控神經元凋亡的關鍵信號通路之一［21-22］。研究表明，腦缺血發生時γ-分泌酶被瞬時激活，使得海馬中Notch1水平上調，而Notch1可使NF-κB中的p65亞基增加，進一步加重炎癥細胞浸潤，炎性因子的表達水平升高，加重腦缺血期的神經元損傷［23］。Hes1是Notch1的下游靶基因，其表達水平直接反映了Notch1表達情況［24］。本研究顯示補陽還五湯降低了Notch1、p-NF-κB p65及Hes1蛋白表達水平，表明補陽還五湯對腦缺血再灌注損傷的保護作用可能與Notch/NF-κB信號通路有關。為了進一步驗證補陽還五湯是否通過Notch/NF-κB信號通路發揮對腦缺血再灌注損傷的保護作用，本研究使用了Notch1抑制劑Jagged1，結果顯示Jagged1的干預削弱了補陽還五湯減輕大鼠神經功能和海馬神經元損傷、縮小腦梗死體積的作用，同時加重了氧化應激和炎性反應，促進細胞凋亡，Notch1、p-NF-κB p65及Hes1蛋白的表達水平增加，而這種現象在Jagged1組更為顯著，說明在Jagged1干預下，Notch1表達被上調，加重腦缺血再灌注損傷，而補陽還五湯可以拮抗這種作用，發揮對腦缺血后腦組織和神經元細胞的保護作用。

綜上所述，本研究初步證實了補陽還五湯可下調Notch1表達，抑制Notch1/NF-κB信號通路的激活，發揮對缺血再灌注腦組織的保護作用。但該調控過程中是否有其他相關蛋白的參與，仍需進一步研究。