ABO變異型B311亞型的鑒定及家系分析*

任倩 李春苗 劉興莉

ABO血型系統是最重要且最復雜的血型系統之一，與臨床輸血、器官移植等存在緊密聯系。隨著分子生物學的發展，ABO血型及亞型的基因序列不斷被人們認識。目前已知的ABO亞型多由編碼區的基因變異引起，如6、7外顯子堿基突變、缺失、插入、替換等，均可影響A或B糖基轉移酶的活性，從而導致ABO表型的變化[1]。除外顯子外，內含子、5'-和3'-非編碼區等也會影響轉錄效率[2]。因此，ABO基因序列變異的分析對準確報告ABO表型以及為臨床輸血提供有用的信息都至關重要。本研究通過血清學方法對家系成員ABO血型進行鑒定，然后通過聚合酶鏈反應（PCR）對ABO基因序列進行測定，研究其分子基礎并進行家系分析。

資料與方法

1 對象 先證者，女，5歲7月，因腺樣體肥大入院，輸血前檢查發現ABO血型正定型A抗原反應正常、B抗原反應弱，術前無輸血史，同時采集其父母血液樣本進行家系分析，家系成員均簽署了知情同意書。

2 試劑與儀器 抗-A、抗-B血型定型試劑（單克隆抗體）（批號20210913）購自上海血液生物醫藥有限公司,抗A1試劑（批號20211028）和抗A，B（批號20211208）均購自江蘇中濟萬泰生物醫藥有限公司，抗-H試劑（批號8000258203）購自荷蘭Sanquin公司，抗D（IgM）（批號20191811）、人ABO血型反定型用紅細胞試劑盒（批號20215309）購自上海血液生物醫藥有限公司，ABO正反定型血型卡（批號20210603）購自長春博迅生物技術有限公司，人類紅細胞ABO血型基因分型試劑盒（熒光PCR法）、全血DNA提取試劑盒均購自江蘇中濟萬泰生物醫藥有限公司。Hamilton全自動血型分析儀（型號Microlab Starlet IVD）購自長春博迅生物技術有限公司，熒光定量PCR儀（型號FQD-96A）購自杭州博日科技股份有限公司。

3 方法

3.1 血清學分型：抽取先證者及家長各2～3mL靜脈血，EDTA抗凝，采用經典試管法進行正反定型。血清學血型分型方法和操作步驟參照《全國臨床檢驗操作規程》。

3.2 DNA提取與擴增：用全血DNA提取試劑盒（江蘇中濟萬泰生物醫藥有限公司）提取基因組DNA。PCR擴增目的基因，產物經回收純化用于基因分型及序列測定。

3.3 熒光PCR法基因分型：用人類紅細胞ABO血型基因分型試劑盒（熒光PCR法）（江蘇中濟萬泰生物醫藥有限公司）進行基因分型。

3.4 序列測定：測序試劑盒購自江蘇中濟萬泰生物醫藥有限公司，對ABO基因第1-7外顯子和啟動子5'UTR區進行序列測定。ABO基因參考序

列為ABO*A1.01.01等位基因序列（GenBank：AJ536122）。引物序列見表1。

表1 PCR擴增引物序列

結 果

1 血清學定型結果 血型血清學結果見表2。正定型，先證者紅細胞與抗A發生強凝集（4+），與抗B發生混合凝集（MF），與抗A，B發生強凝集（4＋），與抗H發生強凝集（3+W）；反定型，先證者血清不與A細胞、B細胞凝集。其母親紅細胞與抗B發生強凝集（4+），與抗A，B發生強凝集（4＋），與抗H發生強凝集（4+）；反定型，血清與A細胞發生凝集（2+）；血清中無不規則抗體的存在。先證者父親為正常的AB型血反應格局。

表2 先證者及其家族成員ABO血型血清學結果

2 血型基因熒光分型 根據ABO基因分型結果，先證者熒光分型為A/B，先證者父親熒光分型為A/B，先證者母親熒光分型為B/O。熒光PCR分型結果見圖1。

圖1 先證者及其父母熒光分型結果

3 基因測序結果及變異分析 先證者基因型為ABO*A1.02/B311，先證者母親基因型為B311/ABO*O.01.01。DNA序列分析顯示，與ABO*B.01相比，B311存在啟動子5'UTR區-35到-18缺失（圖2）；先證者的父親基因分型的測序結果顯示具有ABO*A1.02和ABO*B.01的堿基特征。先證者及其家族成員ABO基因克隆測序結果見表3。

表3 先證者及其家族成員ABO基因測序結果

4 家系分析 根據ABO血型基因第1-7外顯子及啟動子5'UTR區測序結果顯示，先證者基因型為ABO*A1.02/B311，先證者母親基因型為B311/ABO*O.01.01，先證者父親基因型為ABO*A1.02/ABO*B.01。（圖3）。

圖2 啟動子5'UTR區克隆測序結果

圖3 先證者及其家族成員家系分析

討 論

ABO血型系統與臨床輸血有著密切的聯系，血型鑒定的正確與否是臨床安全輸血的關鍵所在，實際工作中，經常會遇到血型正反定型不符或者抗原、抗體減弱等情況，除年齡、疾病等因素外，多數為ABO基因變異導致的亞型或變異型。隨著分子生物學的發展，ABO血型及亞型的基因序列不斷為我們所認識[3]。本研究中先證者血型正定型A抗原反應正常、B抗原反應弱，為進一步確定患者血型及抗原減弱原因測定了ABO基因序列并進行了家系分析。

根據ABO血型血清學特征將A亞型分為A2、A3、Ax、Am、Ael、Aend、Ay等，Salmon依照A亞型的分類標準將B亞型分為B3、Bx、Bm、Bel、Bw[1]。WIENER等于1972年報道了首例非分泌B3，被認為是最稀少的一種B亞型[4]，在中國漢族人中的比例約為1/900（B型），AB3型在中國漢族人中比例為1/1 800（AB型）[5]。目前NCBI中登記的B3亞型有16種[6]，其中，B311亞型最早于2013年在中國上海發現[2]，迄今共有4例AB311和5例B311報告[7-9]。B3亞型最主要的血清學表現是正定型抗B抗體呈現混合視野外觀（MF），抗H抗體呈現強凝集；反定型多數沒有抗B，僅少數存在冷反應性抗B[10]。

本研究中先證者及其母親，試管法與抗H血清凝集分別為3+W、4+，呈現出與報道中B311亞型抗H強凝集相同的表現[9]。先證者基因測序結果為AB311，其紅細胞與抗A血清凝集為4+，與抗B血清呈混合凝集外觀；但其母親測序結果為B311，紅細胞與抗B血清為強凝集4+，與報道的B311抗B抗體呈現混合視野外觀的血清學表現（MF）描述不符[10]。 這可能與年齡和生長發育特點相關，研究顯示，由于2型前體物質不成熟，臍帶血紅細胞ABO抗原數量比成人低[11]，新生兒紅細胞所帶的抗原數目只有成人的25%～50%，且抗原發育不成熟[12]，隨著年齡增長，更多的A抗原或B抗原得以表達[13]，2～4歲時表達水平與成人相同[11]。丹尼爾在《人類血型》[14]論著里提到，由于等位基因的競爭作用，兩種不同的糖基轉移酶會競爭共同受體物質，使得A2B細胞上的A抗原比A2細胞上的A抗原弱，A1B細胞上的A抗原比A1細胞上的A抗原弱，這可能是導致本研究中先證者與其母親雖同時具有B311等位基因，但血清學表現并不一致的原因。張韋等[15]的研究中指出，日常使用的單克隆抗體效價很高，增加了與細胞的反應強度，使得部分凝集強度稍弱的亞型標本漏檢，而與人源血清反應明顯減弱，本研究使用的血清抗體為單克隆抗體，也可能是引起母親血清學表現正常的原因。同時也提示我們，今后的工作中，對于疑難血型，應增加人源血清學實驗，以提高亞型檢出率。

已知ABO亞型多由編碼區的基因突變引起，如發生在第6、7外顯子的堿基突變、替換、插入、缺失和雜交等位基因等，可能影響A或B糖基轉移酶的活性，進而引起ABO表型的變化[16]。除了外顯子的變化，第一個內含子及5'-和3'-非編碼區的ABO基因的特異性調控元也被發現能影響轉錄效率，從而影響ABO基因產物，導致ABO亞型的產生[17-18]。本研究中B311亞型即發生在基因啟動子上游5'UTR區，在該區域檢測出-35到-18堿基的缺失，與2013年上海報道的首例B311亞型堿基序列一致。研究證明，啟動子的突變可能會影響轉錄因子與啟動子的結合，從而影響啟動子的轉錄活性[19-20]。蔡曉紅等研究發現，-35到-18堿基的缺失，導致了啟動子活性降低了50%以上，可能影響了RNA聚合酶Ⅱ或其他轉錄因子與啟動子結合的能力[9]，從而導致了B311亞型紅細胞表面抗原的弱表達，與本研究先證者的血清學結果相符。

有研究提出，先心病等疾病可能會導致ABO血型抗原的弱表達[21]。為了探究先證者抗原表達弱是否與疾病相關，我們對其父母ABO血型基因第1-7外顯子及啟動子5'UTR區進行了序列測定，通過家系分析發現，先證者B311等位基因應來自于其母親，其抗原表達弱可能與B311等位基因相關，與本身所患腺樣體肥大可能沒有關系。

ABO亞型患者很難找到同型血液，一般輸注時紅細胞盡量選擇O型洗滌紅細胞，血漿或冷沉淀選擇AB型或亞型對應的正常血型，血小板選擇亞型對應的正常血型。由于B3型血漿中通常不含抗-B，輸血也可采用B型相容性輸血。因此，一般情況下為保證臨床用血安全可采用O型洗滌紅細胞；如若患者病情危重且無抗B抗體存在，也可考慮B型紅細胞。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突