0.01 mol/L DTT處理意外抗體篩查試劑紅細胞以消除達雷妥尤單抗干擾及臨床適應性研究

赫喜榮 張凡 王娜 王璐璐 劉希曦 蘆宏凱

達雷妥尤單抗（Daratumumab）是一種人源化CD38IgG1單克隆抗體，于2015年被美國食品藥品管理局（FDA） 批準用于治療多發性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM），于2019年7月在我國批準上市。

CD38單抗可以與腫瘤細胞表面的CD38抗原表位特異性結合，通過多種機制有效地清除腫瘤細胞，如多發性骨髓瘤細胞。然而，CD38抗原除了在骨髓瘤細胞上表達之外，也在紅細胞上低表達，CD38單抗與表達了CD38抗原的紅細胞結合會干擾輸血相容性檢測，在臨床使用CD38單抗后，采用任何基于抗球蛋白試劑的檢測方法，如凝膠法、試管法或固相法等，均能觀察到紅細胞意外抗體引起的凝集反應，且該反應在CD38單抗停用后可持續6個月[1-2]。隨著抗 CD38單克隆抗體的廣泛使用，其給輸血相容性檢測所帶來的困難也成了亟待解決的問題。我國已發表多篇抗CD38單抗影響配血的相關病例與綜述[3-7]。目前可以克服該問題的方法包括二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）或二巰基乙醇（2-mercaptoethanol，2-Me）處理紅細胞 、凝聚胺方法、蛋白水解酶（胰蛋白酶/木瓜蛋白酶）處理紅細胞、紅細胞表型分型、紅細胞基因型分型和中和蛋白試驗等[8]。上述方法中，蛋白水解酶對CD38的變性不如DTT有效，且會對MNS、Duffy等多個血型系統抗原產生影響；紅細胞表型分型通常需要在患者開始接受CD38單抗治療前或在輸血3個月后進行；而紅細胞基因分型雖然可以隨時檢測，但需要在專業的基因擴增實驗室中進行，檢測周期較長，可能會延誤患者輸血；中和蛋白試驗所需抗體種類較多，價格昂貴，不易普及。

經試驗證實，用0.2 mol/L DTT對獻血者紅細胞進行預處理后再與達雷妥尤治療的患者血漿進行間接抗人球蛋白試驗（IAT），不會影響抗人球蛋白試驗結果[9]。HOSOKAW等人用不同濃度（0.2、0.1、0.05、0.01以及0.005 mol/L）的DTT處理紅細胞，使用流式細胞儀對處理前后的紅細胞CD38抗原、K和Fyb抗原進行分析，結果表明0.01 mol/L DTT是可以消除達雷妥尤單抗對輸血相容性檢測干擾的最低濃度，且并不影響Fyb抗原性又能保留部分K抗原性[10]。在臨床工作中，使用DTT預處理試劑紅細胞再進行輸血前意外抗體的檢測至少需要2～3 h，繁雜且耗時，這給輸血科為臨床提供及時、安全且有效的血液制品帶來了極大的困難，同時延遲輸血也可能對患者造成不可逆且無法預計的嚴重后果。為解決上述問題，本試驗旨在探討適用于接受達雷妥尤單抗治療患者紅細胞血型系統意外抗體篩查的更便捷有效的試劑，并探討其穩定性。

材料與方法

1 一般資料 本試驗共納入接受達雷妥尤單抗治療的患者13例其中男性6例，女性7例；患者年齡45～78歲，中位數年齡為66（58，73）歲；患者單次輸注達雷妥尤單抗的平均劑量為（15.2±2.6） mg/kg；平均輸注頻次為12.9±5.7次。這13例患者的血漿中有11例僅含抗CD38抗體，2例抗CD38抗體合并意外抗體（抗-E）。

2 儀器與試劑 Diagnostic Grifols，S.A.廠家生產的濃度為0.8%的紅細胞血型抗體篩選細胞試劑盒（微柱凝膠法）（Lot：21019.01）；抗人球蛋白檢測卡（微柱凝膠法）（Lot：21212.01.1）為DiagnosticGrifols，S.A.廠家生產；DG Therm專用孵育器和DGSpain專用離心機由Diagnostic Grifols，S.A.廠家生產；抗-M（IgG，Lot：8000262293）、抗-N（IgG，Lot：8000262072）、抗-D（IgG，Lot：KKE2001）、抗-K（IgM，Lot：8000450634）、抗-k（IgM，Lot：8000451443）、抗-Fya（IgG，Lot：8000260141）、抗-Fyb（AGT，Lot：8000450774）、抗-JKa（IgM，Lot：8000261569）、抗-JKb（IgM，Lot：8000253645）、抗-Lea（IgM，Lot：8000451442）、抗-Leb（IgM，Lot：8000262430）、抗-P1（IgM，Lot：8000262430）及抗-S（IgM，Lot：8000261570）試劑為Sanquin生產；抗-C（IgM，Lot：20203001）、抗-c（IgM，Lot：20203102）、抗-E（IgM，Lot：20193202）及抗-e（IgM，Lot：20193301）試劑為上海血液生物醫藥有限責任公司生產；DTT粉末為Gentihold廠家生產；抗-K（IgG，本試驗室自制）；血細胞分析儀型號為美國貝克曼-庫爾特公司LH780。

3 研究方法

3.1 DTT溶液的配制：32 mL pH7.3的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解1.0 g DTT粉末制成0.2 mol/L DTT溶液；100 mL pH7.3的PBS溶解0.154 g DTT粉末制成0.01 mol/L DTT溶液。

3.2 0.2 mol/L DTT處理試劑紅細胞：離心分離紅細胞血型抗體篩選細胞試劑盒的紅細胞和保養液；用pH7.3的PBS洗滌試劑紅細胞4次后取壓積紅細胞；將0.2 mol/L DTT溶液與洗滌后的壓積紅細胞以4∶1混合；37℃水浴30 min，每5 min混勻一次；孵育后用pH7.3的PBS洗滌4次，棄去上清；用原試劑紅細胞的保養液制成0.8%的紅細胞懸液。

3.3 0.01 mol/L DTT處理試劑紅細胞：離心分離紅細胞血型抗體篩選細胞試劑盒的紅細胞和保養液；用pH7.3的PBS溶液洗滌試劑紅細胞4次后取壓積紅細胞；將0.01 mol/L DTT溶液與洗滌后的壓積紅細胞以17∶1混合[10]；37℃水浴30 min，每5 min混勻一次；孵育后用pH7.3的PBS溶液洗滌4次，棄去上清；用原試劑紅細胞的保養液制成0.8%的紅細胞懸液。

3.4 意外抗體篩查試驗：采用微柱凝膠抗人球蛋白介質檢測法。在相應的微孔管中加入50 μL 0.8%的試劑紅細胞和25 μL待檢血漿，37℃孵育15 min后使用DG專用離心機進行離心并讀取結果。

3.5 紅細胞計數：使用儀器法電阻抗原理，脈沖信號的強弱反映細胞體積的大小，脈沖信號的多少反映細胞的數量。將一套紅細胞血型抗體篩選細胞試劑盒平均分裝為兩組，一組用0.01 mol/L DTT處理，一組不做處理，每天對兩組試劑紅細胞分別進行紅細胞計數檢測直至原試劑紅細胞效期止。

3.6 抗原性檢測：IgG類抗體試劑采用微柱凝膠抗人球蛋白法檢測，IgM或IgA類抗體試劑采用試管法檢測。調整抗體試劑滴度，將抗體試劑用0.9%的氯化鈉溶液進行系列稀釋后與未處理試劑紅細胞反應，將凝集強度為1+時的稀釋液作為工作液，對DTT處理后的試劑紅細胞抗原性每天進行檢測，比較處理前及處理后試劑紅細胞抗原性變化。

結 果

1 意外抗體篩查試驗 用未處理的試劑紅細胞進行意外抗體篩查試驗，13例患者血漿均呈現不同程度的陽性結果。用0.2 mol/L DTT和0.01 mol/L DTT處理后的試劑紅細胞進行檢測，11例檢測結果為陰性，2例存在意外抗體（經特異性抗體鑒定結果為抗-E），具體結果見表1，抗體篩選細胞譜見表2。

表1 13例患者的意外抗體篩查試驗結果

表2 紅細胞血型抗體篩選細胞細胞譜

2 溶血程度 0.2 mol/L DTT處理后的試劑紅細胞從第5天開始出現溶血；0.01 mol/L DTT處理后的試劑紅細胞直至原試劑有效期末未出現肉眼可見溶血。

3 紅細胞計數 0.01 mol/L DTT處理后31天內，紅細胞計數與未處理試劑紅細胞的紅細胞計數變化無統計學意義（P＞0.05）具體結果見表3。

表3 未處理與0.01 mol/L DTT處理后試劑紅細胞的紅細胞計數變化差異

4 抗原性檢測 未處理試劑紅細胞與相應抗體反應凝集強度為1+時的抗體稀釋度見表4-1和4-2；0.01 mol/L DTT處理后試劑紅細胞的抗原性檢測為：D、Fya、Fyb、M、N、C、c、E、e、JKa、JKb、Lea、Leb、P1以及S抗原的抗原性在保存31天內與未處理時保持一致，凝集強度未發生變化；K和k抗原在處理后第0天，檢測結果為陰性（IgM），0.01 mol/L DTT處

表4-1 未處理試劑紅細胞與相應抗體反應凝集強度為1+時的抗體稀釋度

理后試劑紅細胞與抗體試劑原液室溫反應，結果為陰性；4℃反應，結果為陰性。本實驗室檢測出一例僅含IgG類抗-K意外抗體的獻血員血漿，用其血漿與表達了K抗原的未處理試劑紅細胞反應，凝集強度為4+，而與用0.01 mol/L DTT處理后第0天的試劑紅細胞反應，凝集強度為2+。

表4-2 未處理試劑紅細胞與相應抗體反應凝集強度為1+時的抗體稀釋度

討 論

CD38是一種分子量為45000Da的Ⅱ型單鏈跨膜糖蛋白，整體結構包括短的N端胞內區、單次跨膜區和長的C端胞外區，因其不僅在骨髓瘤細胞上表達，也在紅細胞上低表達，所以當接受了達雷妥尤單抗治療的患者有紅細胞輸注需求時，患者血漿中的抗CD38單抗與表達了CD38抗原的紅細胞結合就會影響輸血相容性檢測，導致輸血困難或延遲。有研究報道[11]，用CD38單抗的患者不同階段的直接抗人球蛋白試驗（DAT）結果呈現明顯差異。研究表明[12]，CD38單抗與患者紅細胞結合后會導致患者DAT陽性，但同時也會清除紅細胞表面的CD38抗原，且在使用CD38單抗一周后清除效應逐步明顯，患者的DAT逐漸減弱甚至轉為陰性。

用DTT處理紅細胞是目前國際上消除抗CD38單抗干擾最常用的方法[13]。DTT能破壞CD38分子胞外區的二硫鍵，使抗原變性進而阻止其與抗CD38單抗結合，以此達到消除抗CD38單抗干擾的目的。DTT是一種可溶性的白色固體，是常用的還原劑，因其容易被空氣氧化，穩定性較差，故所制溶液需冷凍（≤-18℃）保存。并且DTT具有毒性，吸入、攝入、皮膚吸收均可造成傷害，當使用固體形式或高濃度溶液時，需戴好手套和護目鏡并在通風櫥中操作。

在我國，多家實驗室推薦使用0.2 mol/L DTT對紅細胞處理后再做輸血相容性檢測以消除抗CD38單抗干擾[14]。本實驗室選取可以消除達雷妥尤單抗對抗人球蛋白介質輸血相容性檢測干擾的最低濃度0.01 mol/L DTT進行研究，與0.2 mol/L DTT分別處理試劑紅細胞，研究不同濃度DTT對試劑紅細胞的溶血程度、紅細胞計數以及部分血型抗原的抗原性變化及細胞保存期限的影響。

本實驗結果顯示，0.01 mol/L DTT和0.2 mol/L DTT均適用于達雷妥尤單抗治療患者紅細胞血型系統意外抗體篩查試驗，但經0.2 mol/L DTT處理后的試劑紅細胞從第5天開始出現溶血，而經0.01 mol/L DTT處理后的試劑紅細胞直至原試劑有效期末仍未出現溶血。高濃度DTT顯著增加了與紅細胞的非特異性IgG結合，對紅細胞膜有一定的損傷[10]，更易使紅細胞變得脆弱而出現溶血的現象。故在后續實驗中未對0.2 mol/L DTT處理后的試劑紅細胞的紅細胞計數以及血型抗原的抗原性變化進行檢測。經0.01 mol/L DTT處理后的試劑紅細胞保存31天內的紅細胞計數與未經DTT處理的試劑紅細胞的紅細胞計數變化無統計學差異（P均＞0.05），可以滿足意外抗體檢測的需求。

本研究對0.01 mol/L DTT處理后的試劑紅細胞進行了抗原性檢測，所檢測的紅細胞血型抗原包括：D、Fya、Fyb、M、N、C、c、E、e、K、k、JKa、JKb、Lea、Leb、P1以及S抗原。結果顯示，0.01 mol/L DTT處理并保存31天內紅細胞D、Fya、Fyb、M、N、C、c、E、e、JKa、JKb、Lea、Leb、P1以及S抗原的抗原性與未處理時保持一致均為1+，凝集強度未發生變化；而使用IgM抗體進行K抗原檢測，在處理后第0天即檢測不到；使用IgG類抗體檢測K抗原，凝集強度為2+。說明0.01 mol/L DTT處理后的試劑紅細胞可保留部分K抗原性，這與此前國外報道一致。QUACHH等[15]的研究認為DTT在破壞CD38抗原的同時也會使Kell等抗原變性或減弱相一致。HOSOKAWA等[10]報道0.01 mol/L DTT處理后的紅細胞可保留部分K抗原性，其反應強度與未處理時相比降低了4倍。雖然DTT會破壞試劑紅細胞表面的K抗原，使得漏檢Kell血型系統的抗體，但對于中國漢族人而言，K基因的表達頻率僅為0.03%[16]，因此抗-K漏檢率相對較低。

與0.2 mol/L DTT相比，經0.01 mol/L DTT處理后的試劑紅細胞可至少保存31天（31天以后因試劑紅細胞已過有效期而未能檢測），降低了工作人員在試驗過程中接觸DTT的毒性風險。實現了長期保存的DTT處理后試劑紅細胞可隨時用于因接受了達雷妥尤單抗治療而影響輸血前檢測患者的意外抗體篩選試驗。部分文獻建議[4]臨床醫師應與輸血科工作人員達成一定的共識，在患者接受達雷妥尤單抗治療前，進行意外抗體篩選試驗和鑒定，在接受治療后，及時告知輸血科工作人員。但在臨床工作中，這樣的共識不易達成，極易造成遺漏，增加臨床醫師和輸血科的工作負擔，同時增加患者因反復抽血檢測造成的醫源性貧血。

本研究制備的試劑紅細胞能夠在4℃下穩定保存，需要時直接取用，且有效消除CD38對意外抗體篩選試驗的干擾，并準確檢測出同種抗體，大大縮短了輸血前檢查的時間，為臨床用血的安全性、及時性和有效性提供了保障。亦為進一步開發可用于達雷妥尤單抗治療患者意外抗體篩選試驗商品化試劑盒提供了實驗依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突