孕婦產前血清學檢查抗G抗體鑒定與分析

黃靚 劉丹 鳳維杰 劉盼盼

新生兒溶血?。℉DN）是由于母嬰血型不合引起的胎兒或新生兒免疫性溶血性疾病，黃疸、貧血、肝脾腫大等為其主要癥狀，嚴重者甚至可能發生膽紅素腦病，造成神經系統損害，導致聽力損傷、智力障礙或發育遲緩等不良后果[1-2]，母嬰血型不合新生兒溶血病是母親體內存在著與胎兒紅細胞不相合的IgG型抗體，該抗體發生同種被動免疫，從而引起胎兒或者新生兒免疫性溶血性疾病[3]。孕婦產前血清學抗體檢查，能有效預防新生兒溶血，臨床存在一些不常見抗體，在臨床診斷時容易導致誤判，影響臨床診斷治療。比如Rh系統的抗G抗體，其同時表現出抗D和抗C，但是和普通抗D和抗C混合抗體不同?，F將近幾年本單位在孕婦產前血清抗體檢查中發現的同時具有抗D和抗C表現的4例樣本中發現2例抗G抗體，做如下報道。

材料與方法

1 臨床資料 4例產婦均自述Rh（D）陰性，年齡均在28～33歲之間。丈夫均為Rh（D）陽性，孕期均大于16周，其中2例有孕產史，另外2例無孕產史。4人均無輸血史。到我院進行產前檢查，做抗體篩查及產前抗體滴度檢查。

2 試劑與儀器 ABO試劑紅細胞、抗體篩選細胞、IgM抗D抗體、抗E、抗e、抗C、抗c、二巰基乙醇（2-Me）來自上海血液生物醫藥有限公司；IgM+IgG抗D試劑購自Millipore公司；抗體鑒定細胞（Screening panel 123/Sanquin Reagents B.V公司）；菠蘿酶、ABO血型+RhD微柱凝膠血型卡、Bio-Rad IH-1000全自動血型儀、低離子抗人球蛋白微柱凝膠卡、ID-incubator37SI微柱凝膠離心機都來自Bio-Rad公司；KUBOTA-KA離心機（日本久保田）；水溫箱、標本離心機（北京白洋醫療器械公司）。

3 方法

3.1 血型鑒定：采用Bio-Rad IH-1000全自動血型儀及ABO血型+RhD微柱凝膠血型卡，Rh陰性確認試驗使用IgM+IgG抗D試劑及低離子抗人球蛋白微柱凝膠卡，Rh血型系統其他抗原檢測，使用抗E、抗e、抗C、抗c抗體，試管法檢測。按照《實用血液免疫學血型理論和實驗技術》[4]操作指南操作。產婦及其丈夫血型結果見表1。

表1 孕婦及其丈夫血型鑒定結果

3.2 抗體篩選及抗體鑒定：抗體篩選試驗采用Bio-Rad IH-1000全自動血型儀及低離子抗人球蛋白微柱凝膠卡，抗體鑒定采用低離子抗人球蛋白微柱凝膠卡，抗體鑒定細胞和微柱凝膠離心機，按照《臨床輸血與輸血技術學實驗指導》[5]操作方法，抗篩結果均陽性，抗體均表現出抗D和抗C格局，具體見表2。

3.3 吸收放散試驗及抗G抗體鑒定：抗G抗體鑒定，采取兩步吸收放散方法，吸收試驗前使用Ccdee細胞需做吸收放散試驗，排除Del型存在。第一步吸收試驗：選取O型Rh表型為ccDEE的三洗后酶處理紅細胞與產婦血清37℃吸收2 h，吸收后紅細胞有抗體結合，直抗陽性。吸收后血清，使用譜細胞中ccDee和CCdee的細胞檢測其抗體，2例檢測出抗C抗體，另2例抗C抗體為陰性，均未檢出抗D抗體。第一步洗脫放散試驗：利用冷檸檬酸放散技術，對第一步吸收后紅細胞洗脫放散，使用譜細胞中ccDee和CCdee的細胞檢測放散液抗體，其中3例抗D陽性，一例抗D陰性，抗C均陰性。第二步吸收試驗：取第一步洗脫放散后放散液與O型Rh表型為Ccdee三洗后酶處理紅細胞37℃吸收2小時，吸收后紅細胞，2例為直抗弱陽性，2例為直抗陰性。利用譜細胞中ccDee和CCdee細胞檢測吸收后放散液抗體，3例抗D陽性，1例陰性，抗C均陰性。第二步洗脫放散試驗：利用冷檸檬酸放散技術對第二步吸收后紅細胞洗脫放散，使用譜細胞中ccDee和CCdee的細胞檢測放散液抗體，2例抗D、抗C均陰性，2例抗D、抗C均為陽性，后兩例的表現為抗G。吸收及冷檸檬酸放散技術均根據《實用血液免疫學血型理論和實驗技術》[4]指南操作，抗體鑒定利用微柱凝膠卡式法鑒定，操作按照《臨床輸血與輸血技術學實驗指導》[5]操作方法。具體試驗路線圖見圖1。

圖1 吸收放散試驗流程圖

3.4 抗體效價檢測：對2例判斷為抗G抗體的產婦血清，利用O型Rh表型為ccDEE和CCdee的細胞，分別對其表現出抗D和抗C性質抗體效價檢測，并利用ccDEE的三洗后酶處理紅細胞與產婦血清37℃反復吸收后，做ABO抗體效價，操作按照《臨床輸血與輸血技術學實驗指導》[5]操作方法。

3.5 新生兒溶血試驗：本次報道僅收集到3號產婦新生兒標本，血型鑒定，Rh血型系統其他抗原檢測，均采用上文方法。新生兒溶血試驗按照《臨床輸血與輸血技術學實驗指導》[5]操作方法。

結 果

1 抗G抗體鑒定及效價測定 通過本試驗設計的2步吸收放散法，在4例同時表現抗D及抗C格局孕婦血清中，成功鑒定2例含有抗G抗體，并分別鑒定其效價，具體見表2。并且在本試驗設計中發現在某些抗體效價較高時，吸收試驗短時間無法吸收完全，可以靠兩步吸收放散有效加以區別和驗證。比如本文中樣本3，由于抗G抗體效價較高，導致第一步在短時間內無法做到完全吸收，出現吸收后血清與D抗原仍有反應，但是在第二步吸收放散中就可以得到驗證，因為第一步放散液中放散的抗G抗體效價得到降低，因此通過第二步吸收后，可以驗證其不含抗D。降低了吸收試驗中反復多次吸收，相對以往試驗設計有效地節約了時間。根據本次試驗經驗總結，將常見：抗G+抗D+抗C、抗G+抗D、抗G+抗C、抗D+抗C、單獨抗G預期試驗格局匯總，見表3。

表2 吸收放散及抗體效價結果

表3 常見抗G抗體試驗格局

2 新生兒溶血鑒定及治療 結合孕婦產前抗G抗體鑒定結果，能有效鑒定抗G引起的新生兒溶血，避免誤判，3號孕婦新生兒ABO血型為A型，Rh血型不含C抗原，在新生兒溶血試驗時，抗C反應極弱，極易漏檢，最初選取Ccdee A型紅細胞做新生兒溶血，結果陽性，懷疑ABO溶血。后結合病歷，發現其母親抗體鑒定結果，選取ccdee A型紅細胞鑒定為陰性，具體結果見表4。因此當一個ccdee孕婦抗體鑒定表現出抗D和抗C時，尤其抗C反應較弱時，且其新生兒血型不含C抗原時，尤其要注意抗G存在的可能性。該患兒住院期間未做新生兒換血治療，僅做藍光治療，住院期間申請紅細胞0.5 U，給予A型D-、C-紅細胞0.5 U，輸血后無不良反應，Hb由輸血前87 g/L提高到101 g/L，數日后膽紅素等指標正常出院。若未對孕婦抗G有效鑒定，則會發生誤判，影響臨床診療。

表4 新生兒血清學檢測

討 論

Rh血型系統抗體可導致胎兒和新生兒的溶血性疾?。℉DFN），而Rh血型系統是目前人類血型系統研究中最具復雜性和多態性的系統，其中RhD和RhCE基因密切相關、高度同源，是造成其多態性復雜性的重要原因。G抗原就是1種獨特的Rh抗原，最

早由ALLEN和TIPPETT描述[6]，RhD和RhCE 的C等

位基因所編碼的Ser103是G活性的關鍵[7]，所有針對Ser103位特異性的抗體都能與RhD和C等位基因的產物反應，這就是抗G而非抗C，通常帶有D或者C抗原的紅細胞都含有G抗原，故臨床上抗G抗體一般是由ccdee個體產生，一般帶有抗D和（或）抗C，這樣就涉及3種抗體，抗D、抗C和抗G，在臨床檢測時就會出現5種抗體鑒定可能表現為同一種格局：抗G+抗D+抗C、抗G+抗D、抗G+抗C、抗D+抗C、單獨抗G。這種復雜現象極易給鑒定帶來混淆和誤判，尤其在不含C抗原新生兒，由抗G抗體導致的新生兒溶血中。因此如何有效鑒別抗G對臨床檢測工作提出了挑戰，早期有報道用rG/dce或r''G/dce細胞放散分離方法確定G抗體，但是這種細胞極其稀少[8]，有文獻報道，采用ccDee和CCdee細胞吸收放散試驗來確定抗G[9]，但是無論是ccDee還是CCdee在我國人群比例均不是太高，如張愛等報道福州地區獻血人群Rh血型分布中ccDee僅占D陽性人群的0.25%，而CCdee也僅占陰性人群的7.03%，不太容易獲取。而ccDEE占D陽性人群的6.57%，Ccdee占陰性人群的34.35%[10]。因此，本次試驗中嘗試應用ccDEE和Ccdee細胞，做吸收放散，通過兩步吸收放散試驗，分別檢測吸收后血清和放散液抗體，并結合吸收后紅細胞直接抗人球蛋白試驗結果。有效地區別了抗D、抗C及抗G。試驗中要注意的是，有很多文獻報道Ccdee細胞存在Del的情況，如章旭和李曉豐等在RhD*1227A等位基因在遼寧漢族Rh陰性人群和隨機人群中的頻率分析中報道[11]，在117名Rh陰性人群中20例Ccdee含RhD*1227A等位基因，其中18例吸收放散證實為Del型，因此在使用Ccdee細胞時，要加做吸收放散試驗，確定是否為Del，避免在試驗中造成失誤。

另外在測定抗G抗體效價時，SKOV[12]曾報道Rh表型上G抗原位點數，結果顯示DCe/DCe 9900-12200；dCe/dCe 8200-9700；DCE/DCE 5400；DcE/DcE 3600-5800；Dce/Dce 4500- 5300；DcE/dce 4200。因此JUDD等曾指出，比較抗C和抗D的滴度時，推薦r'r'和R2R2檢測細胞[13]，JIANHUA等也在檢測抗G抗體效價時推薦r'r'和R2R2檢測細胞[14]。所以在測定抗G抗體效價時最好使用ccDEE和CCdee細胞。SOUMYA等在文獻[15]中報道抗G造成的HDN比單純的Rh系統抗體如抗D等造成的HDN嚴重，同時有文獻報道，抗G抗體與C+紅細胞反應更強，而與C-紅細胞反應弱[16]，推測抗-G引起HDN的嚴重程度往往更取決于C抗原，而不是D抗原，這可能與G抗原在C+紅細胞上表達更多有關，本例報告中，抗G抗體表達抗C并不高，因此新生兒未嚴重至換血治療，也可能與此有關。很多因素，如免疫亞型這些風險抗體及其轉移率胎兒，不同類型的FcγR表達效應單核細胞和巨噬細胞，和Rh不相容抗原表達在紅細胞的胎兒和新生兒，均可以影響HDFN的發病率[17]，因此抗G抗體及其抗體效價對HDFN的發病率的影響，仍值得大家探討。雖然國內Rh陰性群體相對較少，而且對于需要輸血的患者，在輸血前檢測中嚴格區分抗D、抗C和抗G意義不大，但是對于孕產婦而言，區分抗D、抗C和抗G卻十分重要，在排除干擾有效檢測ABO產前滴度以及抗D免疫球蛋白使用等方面有提示意義。尤其我國開放二胎政策后，受免疫刺激，導致孕產婦抗篩陽性增加的可能性，免疫溶血造成新生兒溶血的風險增加，因此有效區分抗G對于孕婦產前血清學檢測及預防新生兒溶血具有一定意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突