不同氮水平下AM真菌對油茶幼苗生長、根系形態和光合特性的影響

黃雨軒，葉 媚，熊 靜，沈輝龍，黃偉豪，張林平，吳 斐

（江西農業大學a.林學院；b.鄱陽湖流域森林生態系統保護與修復國家林業和草原局重點實驗室，江西 南昌 330045）

油茶Camellia oleifera隸屬山茶科Theaceae，為常綠小喬木或灌木，是我國特有的木本油料樹種[1]。茶油富含不飽和脂肪酸，被譽為“東方橄欖油”[2-3]。由于全國油料作物種植面積持續下降，國內食用植物油供給缺口不斷擴大，發展油茶產業是保障國內油料供給、緩解糧油爭地的有效途徑[4-6]。油茶主要分布在酸性紅壤地區，土壤養分匱乏，而油茶林對氮的需求量大，氮肥的低利用率是油茶集約化生產中的主要問題[7]，不僅增加了經營成本，還因活性氮流失對環境造成負面影響。

叢枝菌根（arbuscular mycorrhizae，AM）真菌隸屬球囊菌門Glomeromycota，能與大約80%的陸生植物根系形成共生體[8]。大量研究結果表明，AM真菌對植物進行光合作用和生長具有積極作用，為了減少化肥施用量，AM真菌作為生物菌肥的潛力受到廣泛關注[9-10]。張學林等[11]的研究結果表明，不同氮肥用量下，接種AM真菌可以改善玉米Zea mays根系特性，增強其氮素吸收能力?？状贡萚12]的研究結果表明，在減量施肥水平下接種AM真菌對甘蔗Saccharum生物量的提高作用顯著高于常規施肥水平。韋正鑫等[13]的研究結果表明，AM真菌可以顯著提高滇重樓Paris polyphylla的光合作用強度，但不同AM真菌的接種效果存在差異。油茶是菌根植物，前人的研究結果表明，AM真菌可以通過改善油茶的根系結構，促進油茶對礦質元素的吸收，增強油茶葉片的光合作用[14]。目前，有關不同氮水平下AM真菌對油茶生長影響的研究鮮有報道。本研究中通過盆栽試驗，探究不同氮水平下，2種AM真菌對油茶幼苗生長、根系形態和光合特性的影響，旨在了解促進油茶生長的最佳氮水平和AM真菌，為AM真菌作為生物菌劑的研發與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1）植物。選用高產油茶品種長林53作為供試植物，種子采自江西星火農林科技發展有限公司。2020年12月將種子用0.1%的KMnO4進行表面消毒5 min，并埋藏于滅菌沙中催芽。待種子萌發，選取長勢一致的幼苗作為研究對象。

2）菌種。幼套近明球囊霉Claroideoglomus etunicatum和摩西斗管囊霉Funneliformis mosseae購自長江大學根系生物學研究所，使用玉米和三葉草Trifolium pretense作為宿主植物，以滅菌沙為基質，進行擴繁。菌劑包括菌絲、孢子（34個/g）、宿主根及基質。

3）基質。供試土壤采自江西農業大學校園內，為紅壤土。土壤基本理化性質：pH值6.2，有機質含量22.35 g/kg，有效磷含量2.30 mg/kg，銨態氮含量8.75 mg/kg，硝態氮含量2.04 mg/kg。土壤過篩（2 mm），經高溫滅菌（121 ℃，2 h）處理，消除土著微生物的干擾。河沙過篩（2 mm），用自來水沖洗干凈，晾干后干熱滅菌（180 ℃，4 h）。供試基質為滅菌土和滅菌沙（體積比1∶1）的混合物。

1.2 試驗設計

采用雙因素試驗設計：3個AM真菌水平（不接種、接種F.mosseae、接種C.etunicatum）；4種氮濃度水平（0、3.75、7.50、15.00 mmol/L NH4NO3）。共12個處理，每個處理重復20盆，共計240盆。每盆裝基質1 800 cm3。在接種處理中加入60 g菌劑；不接種處理中加入等量滅活菌劑（121 ℃，2 h），同時加入10 mL菌劑過濾液（1 μm尼龍網）。

2020年5月，每盆植入1棵油茶幼苗，確保根系與菌劑接觸。將盆栽放在江西農業大學基地大棚內，溫度25～28 ℃，相對濕度70%～75%。施氮處理前，每個月澆灌200 mL 1/4 Hoagland 營養液（136 g/L KH2PO4、101 g/L KNO3、236 g/L Ca(NO3)2·4H2O、246.5 g/L MgSO4·7H2O、 2.86 g/L H3BO3、1.81 g/L MnCl2·4H2O、0.22 g/L ZnSO4·7H2O、0.08 g/L CuSO4·5H2O、0.02 g/L H2MnO4·H2O、7.354 g/L C10H12O8N2NaFe）。

培養3個月，待AM真菌與油茶形成良好共生關系，開始施氮處理。每隔6 d分別澆灌200 mL濃度為 0、3.75、7.50、15.00 mmol/L的NH4NO3溶液，并配施1/4無氮Hoagland營養液（87 g/L K2SO4、115 g/L CaCl2、136 g/L KH2PO4、246.5 g/L MgSO4·7H2O、2.86 g/L H3BO3、1.81 g/L MnCl2·4H2O、0.22 g/L ZnSO4·7H2O、0.08 g/L CuSO4·5H2O、0.02 g/L H2MnO4·H2O、7.354 g/L C10H12O8N2NaFe），共澆灌10次，再培養1周后收獲，待測。

1.3 指標測定

1）AM菌根侵染率。參照Phillips等[15]的方法，每個處理隨機選取5株，將根系進行透明、軟化、酸化、染色、脫色和制片，采用放大十字交叉法統計AM真菌侵染率（具有菌根結構的交叉點數量占總交叉點數量的百分比）。

2）形態指標。使用卷尺測量油茶植株的高度，使用游標卡尺測量地徑。使用Espon Perfection V700 Photo型掃描儀對油茶幼苗整體根系進行掃描，使用WinRHIZO（Pro2012）根系軟件分析根系形態。

3）氣體交換參數。每株油茶選取3片健康完整的葉片（頂芽下的第3～5片），使用LI-6400便攜式光合儀（LI-COR公司，美國）測定凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）[16]。

4）葉綠素熒光參數。在測定之前，先對植株進行30 min暗處理，每株油茶選取3片完整展開葉，使用PAM-2500便攜式調制葉綠素熒光儀（Walz公司，德國），測定最大光化學效率（Fv/Fm）、實際光化學效率（ΦPSⅡ）、非光化學猝滅（qN）和光化學猝滅（qP）。

1.4 數據分析

使用IBM SPSS statistics 20.0軟件對數據進行分析，采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）檢測接種AM真菌處理、施氮處理及其交互作用對所有測定指標的影響，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）中的 Duncan’s檢驗法檢測不同處理間的差異（P=0.05）。使用Origin 2019軟件繪制柱狀圖。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）進行綜合評價，并選出最佳氮水平和AM真菌。

2 結果與分析

2.1 接種AM真菌及施氮對油茶生長和侵染率的影響

不同接種AM真菌及施氮處理下油茶的AM真菌侵染率如圖1所示。不接種處理根系未被AM真菌侵染，在不同菌劑間菌根侵染率無顯著差異。由圖1可見，隨著氮濃度的增加，C.etunicatum和F.mosseae對油茶根系的侵染率呈現先增加、后降低的趨勢，在3.75 mmol/L NH4NO3濃度下最高，分別為41.74%±6.77%和38.34%±7.39%，在15.00 mmol/L NH4NO3濃度下最低，分別為23.67%±3.25%和24.19%±3.46%。

圖1 不同接種AM真菌及施氮處理下油茶幼苗的AM真菌侵染率Fig. 1 Effects of AM fungi inoculation and nitrogen application on the infection rate of AM fungi in C. oleifera

不同接種AM真菌及施氮處理下油茶的株高和地徑如圖2所示。由圖2中的雙因素方差分析結果可知：接種AM真菌和施氮處理對油茶幼苗株高和地徑的影響顯著（P＜0.05）；兩者的交互作用對地徑的影響顯著（P＜0.05），對株高的影響不顯著（P＞0.05）。隨著氮濃度的增加，接種和未接種油茶幼苗的株高呈現先上升、后下降的趨勢，于3.75 mmol/L NH4NO3濃度下達到峰值；而油茶幼苗的地徑隨著氮濃度的增加呈現上升的趨勢。在不施氮條件下，接種C.etunicatum使油茶幼苗株高提高了14.88%，接種F.mosseae使油茶幼苗株高提高了3.88%，接種C.etunicatum的油茶株高顯著高于接種F.mosseae的處理（P＜0.05）。在 3.75、7.50和 15.00 mmol/L NH4NO3濃度下，接種F.mosseae使油茶株高提高的幅度（12.68%、12.04%和12.93%）大于接種C.etunicatum的提高 幅 度（10.55%、0.73%和10.22%）。 在0和3.75 mmol/L NH4NO3濃度下，接種C.etunicatum顯著增加了油茶幼苗的地徑（23.35%和13.23%）（P＜0.05）。在0、3.75和7.50 mmol/L NH4NO3濃度下，接種F.mosseae顯著增加了油茶幼苗的地徑（16.92%、16.68%和11.73%）（P＜0.05）。

圖2 不同接種AM真菌及施氮處理下油茶幼苗的株高和地徑Fig. 2 Effects of AM fungi inoculation and nitrogen application on the height and stem diameter of C. oleifera

2.2 接種AM真菌及施氮對油茶根系形態的影響

不同接種AM真菌及施氮處理下油茶幼苗根系的各形態指標見表1。由表1中雙因素方差分析結果可知：接種AM真菌及施氮對油茶根系的長度、平均直徑、體積和表面積有顯著影響（P＜0.05）；兩者的交互作用對根系的表面積、體積和平均直徑有顯著影響（P＜0.05），對根系長度無顯著影響（P＞0.05）。隨著氮濃度的增加，接種和未接種油茶根系的長度、平均直徑、體積、表面積均呈現先增、后降的趨勢，根系的長度、體積和表面積在3.75 mmol/L NH4NO3濃度下達到峰值。在4種NH4NO3濃度下，與未接種和接種C.etunicatum的油茶幼苗相比，接種F. mosseae顯著增加了油茶幼苗根系的長度（除0和3.75 mmol/L NH4NO3外）、體積和表面積（P＜0.05）。在0和3.75 mmol/L NH4NO3濃度下，接種F. mosseae的油茶幼苗根系的平均直徑顯著高于未接種植株（P＜0.05）。

2.3 接種AM真菌及施氮對油茶氣體交換參數的影響

不同接種AM真菌及施氮處理下油茶幼苗葉片的氣體交換參數如圖3所示。由圖3中的雙因素方差分析結果可知，接種AM真菌處理和施氮處理對凈光合速率、胞間CO2濃度、蒸騰速率和氣孔導度有顯著影響（P＜0.05）；兩者的交互作用對胞間CO2濃度有顯著影響（P＜0.05），對凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導度的影響不顯著（P＞0.05）。隨著氮濃度的增加，油茶凈光合速率呈先升高、后逐漸穩定的趨勢。在0、3.75和15.00 mmol/L NH4NO3濃度下，接種F.

mosseae使油茶凈光合速率提高的量顯著高于接種C.etunicatum（P＜0.05）。在4個氮濃度下，接種F.mosseae顯著提高了油茶的凈光合速率（20.00%、28.01%、17.52%、22.04%）、胞間CO2濃度（4.59%、11.74%、1.72%、5.90%）和蒸騰速率（25.95%、38.73%、22.74%、28.95%）。

表1 不同接種AM真菌及施氮處理下油茶幼苗根系的各形態指標?Table 1 Effects of AM fungi inoculation and nitrogen application on the root morphological index of C. oleifera

圖3 不同接種AM真菌及施氮處理下油茶幼苗葉片的氣體交換參數Fig. 3 Effects of AM fungi inoculation and nitrogen application on the gas exchange parameters of C. oleifera

2.4 接種AM真菌及施氮對油茶葉綠素熒光參數的影響

不同接種AM真菌及施氮處理下油茶幼苗葉片的葉綠素熒光參數如圖4所示。由圖4中的雙因素方差分析結果可知，接種處理對油茶葉片的最大光化學效率、實際光化學效率、光化學猝滅和非光化學猝滅有顯著的影響（P＜0.05），施氮處理對油茶最大光化學效率、實際光化學效率和光化學猝滅有顯著影響（P＜0.05）；兩者交互作用對油茶最大光化學效率、實際光化學效率、光化學猝滅和非光化學猝滅有顯著影響（P＜0.05）。隨著氮濃度的增加，接種與未接種油茶最大光化學效率、實際光化學效率、光化學猝滅和非光化學猝滅均呈現先上升、后下降的趨勢（圖4）。在4個氮濃度下，接種F.mosseae顯著提高了油茶的最大光化學效率（16.23%、26.63%、16.92%、33.18%）、實際光化學效率（37.61%、32.27%、33.10%、29.38%）、光化學猝滅（13.88%、8.89%、3.97%、4.74%）和非光化學猝滅（16.94%、24.07%、17.60%，除15 mmol/L NH4NO3外）；接種C.etunicatum顯著提高了油茶最大光化學效率（11.01%、11.13%、9.96%、20.77%）和實際光化學效率（33.10%、25.01%、32.51%、28.96%）。在4個氮濃度下，接種F.mosseae后油茶最大光化學效率的增量顯著高于接種C.etunicatum（P＜0.05）。在0和3.75 mmol/L NH4NO3濃度下，接種F.mosseae后油茶實際光化學效率的增量顯著高于接種C.etunicatum（P＜0.05）。

圖4 不同接種AM真菌及施氮處理下油茶幼苗葉片的葉綠素熒光參數Fig. 4 Effects of AM fungi inoculation and nitrogen application on chlorophyll fluorescence parameters of C. oleifera

2.5 油茶幼苗生長、根系形態和光合特性的綜合評價

為篩選適宜油茶生長的最佳氮水平和AM真菌，采用PCA分析方法對不同氮素水平和AM真菌處理下油茶的根系形態、光合特性和生長情況進行綜合評價。將株高、地徑、根系長度、根系平均直徑、根系體積、根系表面積、凈光合速率、胞間CO2濃度、蒸騰速率、氣孔導度、最大光化學效率、實際光化學效率、光化學猝滅和非光化學猝滅這14個指標作為原始指標，將數據標準化后進行PCA分析。根據特征值、方差貢獻率和累計方差貢獻率將原始指標分成14個主成分，前2個主成分的累計方差貢獻率達84.56%，說明這2個主成分可以反映出原始指標的大部分信息（表2）。

表2 油茶幼苗的生長、根系形態和光合特性指標的主成分分析結果Table 2 Principal component analysis of C. oleifera seedlings growth, root morphology and photosynthesis characters

由表2可知，根系長度、根系表面積、凈光合速率和最大光化學效率的載荷值均大于0.9，對第1主成分起主要作用，第2主成分中載荷值最大的為株高。根據2個主成分的特征值和因子載荷，得出各主分分值計算公式：

式中：Y1和Y2分別表示第1主成分和第2主成分的得分；X1～X14分別表示株高、地徑、根系長度、根系平均直徑、根系體積、根系表面積、凈光合速率、胞間CO2濃度、蒸騰速率、氣孔導度、最大光化學效率、實際光化學效率、光化學猝滅和非光化學猝滅的標準化后的特定值。

經計算可得主成分綜合得分及排序（表3），結果表明無論是否接種AM真菌，各施氮處理按油茶苗的綜合得分從高到低排序依次均為3.75、7.50、15.00、0 mmol/L NH4NO3；同一氮水平下，各接種處理按油茶苗的綜合得分從高到低排序依次為接種F.mosseae、接種C.etunicatum、不接種處理。因此，3.75 mmol/L NH4NO3和F.mosseae分別是增強油茶的光合作用和促進其生長效果最佳的氮水平和AM真菌。

表3 接種AM真菌及施氮處理的主成分得分及排序Table 3 Principal component score and ranking of AM inoculation and nitrogen treatments

3 結論與討論

綜上所述，F.mosseae和C.etunicatum均能與油茶形成良好的共生關系，改善根系形態，增強光合作用，促進其生長。相較于C.etunicatum，接種F.mosseae提高油茶的株高和地徑、改善根系形態、增強光合作用的效果更佳。在4種氮濃度水平（0、3.75、7.50、15.00 mmol/L NH4NO3）中，3.75 mmol/L NH4NO3是促進油茶生長的最適氮水平。

AM真菌是一類專性活體營養共生微生物，對宿主植物根系的侵染是其功能發揮的前提。土壤中的氮含量影響AM真菌對根系的侵染率[17]，Calabrese等[18]經研究發現高氮條件下AM真菌對毛果楊Populus trichocarpa的侵染率比低氮條件下更高，而Pan等[19]經研究發現高氮降低了AM真菌對大籽蒿Artemisia sieversiana和羊草Leymus chinensis的侵染率。本研究結果表明，隨著施氮濃度的增加，AM真菌對油茶根系的侵染率先增加、后降低。這可能是因為不施氮條件下，土壤中養分匱乏限制了AM真菌的菌絲生長和孢子發育，隨著土壤中可利用的礦質營養增多，宿主植物對AM真菌的依賴性可能會降低，并且光合產物向AM真菌的分配減少[20]，從而導致AM真菌對油茶的侵染率下降。

根系是植物吸收水和礦質養分的主要器官，根系形態影響植物根系對水分和礦質養分的吸收。本研究結果表明，隨著氮濃度的增加，油茶幼苗根系長度、體積和表面積呈先增加、后降低的趨勢，在3.75 mmol/L NH4NO3濃度下達到峰值。該結果與王樹起等[21]得出的研究結果一致，這可能是因為適宜水平的氮能促進根系生長，而高氮條件下土壤中硝酸鹽含量過高，抑制植物生長素的生物合成，或限制生長素從枝向根的轉移，從而抑制根的生長[22]。大量研究結果表明，菌根化植物的根系長度、根系表面積和根系體積等均顯著高于未菌根化植物[23-24]。前期研究結果表明，接種C.etunicatum顯著增加了油茶根系的長度、體積、投影面積等[14]。本研究結果進一步證實：接種F.mosseae和C.etunicatum均能促進油茶根系的生長，且接種F.mosseae比接種C.etunicatum對油茶根系生長的促進效果更好。

光合作用為油茶生長發育提供物質基礎，直接影響油茶的品質和產量[13]。氮是葉綠素的重要組成成分，施氮對植物的葉綠素熒光特性及光合作用有明顯的調節作用[25]。袁德梽[26]的研究結果表明，隨著施氮水平的提高，油茶光合特性變化由強到弱依次為中氮（40 g/m）、高氮（50 g/m）、低氮（20 g/m）。本研究結果表明，隨氮濃度的升高，油茶最大光化學效率、實際光化學效率和株高呈先升高、后降低的趨勢，其中3.75 mmol/L NH4NO3是改善油茶光系統Ⅱ性能和促進生長的最佳氮水平。接種AM真菌能有效提高許多木本植物的光合速率，促進植物生物量的積累和植株的生長發育[27]。本研究結果表明，接種2種AM真菌均顯著改善了油茶的氣體交換參數和葉綠素熒光參數，提高了油茶的株高和地徑，該結果與黃京華等[28]、林宇嵐等[29]、歐靜等[27]的研究結果一致。這可能是因為接種AM真菌可以提高宿主植物的葉綠素含量，有利于其捕捉光能，從而改善了油茶的光合特性和生長狀況[30]。

AM真菌對宿主植物的影響存在種間差異[28]。韋正鑫等[13]研究了28種AM真菌對滇重樓光合特性和生長的影響，發現5種AM真菌對滇重樓的促生效果好于其他23種。黃京華等[28]發現F.mosseae對黃花蒿營養吸收的促進作用高于變形球囊霉Glomus versiforme。本研究結果表明：不施氮條件下，接種C.etunicatum的油茶株高顯著高于接種F.mosseae的植株；施氮后，接種F.mosseae的油茶株高、最大光化學效率、實際光化學效率、根系長度、根系體積、根系表面積的增量高于接種C.etunicatum的植株。主成分分析結果表明，在相同氮水平下，接種F.mosseae處理的排序均優于接種C.etunicatum處理，因此接種F.mosseae比接種C.etunicatum更適用于促進油茶幼苗的生長。

本試驗中從油茶生長、根系形態和光合特性的角度探究了適合油茶生長的最適氮濃度和AM真菌，但尚不明確AM真菌促進油茶吸收和利用氮素的機制，在后續的研究中，將圍繞AM真菌對油茶吸收和轉運氮素的影響進行研究，探究AM真菌參與調控油茶氮營養的生理機制和分子機制。