硫化物脅迫對縊蟶血液 SO24-濃度及SULT1B1-12基因表達的影響

孫慧妙 ，沈偉良，陳彩芳，林志華 ，韓慶喜

( 1. 浙江萬里學院 生物與環境學院 浙江省水產種質資源高效利用技術研究重點實驗室，浙江 寧波 315100；2. 寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315823；3. 寧波市海洋與漁業研究院，浙江 寧波 315012；4. 浙江萬里學院 寧海海洋生物種業研究院，浙江 寧海 315604)

1 引言

水生穴居動物由于生存空間有限，其攝食、排泄均在洞穴中進行，導致殘餌、排泄物等有機物在洞穴中積累。尤其是退潮時，洞穴內氧氣含量迅速下降，在缺氧條件下，底部沉積物中的硫酸鹽、亞硫酸鹽和含硫有機物會被還原為硫化物H2S[1]，使得穴居動物長時間暴露于高濃度的硫化物環境中，對硫化物產生了一定的耐受性。目前對耐硫生物的研究主要集中在單環刺螠（Urechis unicinctus）[2]、美洲刺螠（Urechis caupo）[3]、羅 氏 沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）[4]和日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）[5]等水生無脊椎動物中。

硫化物（H2S、HS-和S2-）是底棲環境常見的不良環境因子，具有呼吸毒性和免疫毒性[6-7]，會抑制需氧生物的有氧呼吸，使新陳代謝減慢，甚至導致生物體的死亡。為了抵御硫化物的毒性，耐硫生物會對其進行氧化代謝解毒[2]。此硫化物氧化代謝途徑在硫醌氧化還原酶（Sulfide Quinine Oxidoreductase，SQR）、硫雙加氧酶（Sulfur Dioxygenase，SDO）、硫轉移酶（Sulfur Transferases，ST）等一系列酶的作用下，將有毒硫化物轉化為無毒硫酸鹽[8]。硫酸鹽在機體內會被進一步活化為3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸（3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate，PAPS）；而胞質磺基轉移酶（Cytosolic Sulfotransferase，SULT）以PAPS作為其磺化反應的通用供體，促進甲狀腺激素、類固醇和兒茶酚胺類等有效內源性物質的失活和消除[9]。胞質磺基轉移酶1B1（Cytosolic Sulfotransferase 1B1, SULT1B1）通過磺化反應調節甲狀腺激素（Thyroid Hormones，THs）水平[10]，以調控機體生理代謝水平。

縊蟶（Sinonovacula constricta）是我國重要的經濟養殖貝類之一，常棲居于潮間帶的泥砂質灘涂中。作為典型的穴居雙殼貝類，其埋棲深度可達體長的5～8倍，遠遠深于泥蚶（Tegillarca granosa）、文蛤（Meretrix meretrix）等其他灘涂貝類[11-12]。由于潮汐作用和洞穴內有限的海水交換，縊蟶常暴露于高濃度的硫化物環境中，且其耐受硫化物的能力要強于單環刺螠、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、羅氏沼蝦等水生動物[12-13]。本課題組已有研究表明，縊蟶線粒體硫化物氧化途徑是其對硫化物解毒的重要策略[11-12]；在對其基因組的進一步分析中發現，縊蟶SULT1B1（ScSULT1B1）基因家族存在基因擴張現象，且在對已有的硫化物脅迫后縊蟶鰓轉錄組數據的比較分析中亦篩選到了該家族成員SULT1B1-12基因的全長cDNA序列。因此，本研究擬以硫代謝途徑中間產物—硫酸鹽水平為連接點，對ScSULT1B1-12基因的序列特征、組織表達和硫化物脅迫后的表達特征進行分析，探討其在縊蟶耐硫性狀中的作用機制，旨在為縊蟶耐硫化物分子機制研究及后續開展分子標記輔助育種提供理論依據。

2 材料和方法

2.1 實驗材料

實驗用縊蟶采集自寧波市海洋與漁業研究院科技創新基地。選取健康、活力好、殼體完整、規格均勻的成年縊蟶，體質量為（10.72±1.64）g，殼長為（5.8±0.5）cm。實驗開始前暫養7 d，海水鹽度為21.2±0.5，溫度為（18.1±1.5）℃，連續充氣，每日換水1次，并定時投喂適量的小球藻。隨機選取4顆縊蟶，設為4個生物學平行，分別解剖取其鰓、閉殼肌、肝胰腺、斧足、外套膜、水管等組織，組織經液氮速凍后保存于-80℃，用于ScSULT1B1-12基因的組織表達研究。

2.2 硫化物脅迫實驗

選取384顆健康縊蟶成貝進行硫化物攻毒實驗。在實驗開始前2 d停止投喂和充氧。鑒于硫化物對縊蟶的96 h安全濃度為158 μmol/L[11]，故本研究設置3個濃度組，分別為50 μmol/L、150 μmol/L和300 μmol/L，每組均設4個平行。實驗用九水硫化鈉（Na2S·9H2O）配置100 mmol/L硫化物母液，成倍稀釋母液使水體濃度分別達到相應實驗設定濃度。每3 h補充1次母液，以維持暴毒水體硫化物濃度的穩定。于硫化物攻毒后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，從各平行組隨機選取4顆縊蟶，抽取血液后解剖取其鰓和肝胰腺。各樣品均于液氮速凍后儲存于-80℃，用于Sc-SULT1B1-12基因的時間表達研究。

2.3 縊蟶血液 S O24-離子濃度檢測

用珠磨法破碎縊蟶血細胞，3 000 r/min離心5 min；取上清液1 mL，加入1 mL乙腈沉淀蛋白質后加入8 mL去離子水，振蕩混勻后靜置5 min；隨后10 000 r/min離心10 min，取上清液，經過孔徑為0.22 μm濾膜過

濾。經離子色譜法檢測濾液中 S O24

-濃度。

2.4 ScSULT1B1-12基因的生物信息學分析

從硫化物脅迫后縊蟶鰓轉錄組數據庫中篩選得到ScSULT1B1-12基因全長序列。利用ORF Finder查找 其 開 放 閱 讀 框（Open Reading Box，ORF）。使 用NCBI（National Center for Biotechnology Information）的BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）分析序列的完整性并進行同源性比較分析。使用ProtParam預測其等電點（Isoelectric point，pI）和分子量（Molecular weight，Mw）（https://web.expasy.org/protparam/）。利 用PROSITE（https://prosite.expasy.org/）進行功能域的分析。通過SWISSMODEL（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）進行其蛋白質高級結構預測。用Clustal W軟件進行多序列比對分析。利用MEGA-7軟件構建系統發育樹，并利用iTOL（https://itol.embl.de/）進行在線美化。

2.5 ScSULT1B1-12基因在縊蟶不同組織及硫化物脅迫下的表達

Trizol法提取縊蟶組織總RNA，使用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，日本）反轉錄成cDNA模板。根據ScSULT1B1-12基因全長序列設計RT-qPCR引物（表1）。利用LightCycler?480II實時PCR系統進行熒光定量PCR反應，每組樣品設4個生物學平行，4個技術重復。以RS9基因為內參基因[14]，采 用2-ΔΔCT法[15]計算ScSULT1B1-12的 相 對 表達量。

表1 實驗所用引物及其序列Table 1 Primers and their sequences used in the experiment

2.6 數據處理

所有數據以平均值±標準差來表示，均使用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），p＜0.05表示差異顯著。

3 結果

3.1 硫化物脅迫下縊蟶血液 S O24-濃度的變化

隨著脅迫時間的延長，除50 μmol/L濃度組外，其余 較 高 濃 度 組（150 μmol/L、300 μmol/L）縊 蟶 血 液SO24-濃度波動較大，總體均呈下降趨勢；且濃度越高，波動越劇烈（圖1）。50 μmol/L硫化物脅迫下，其SO24-濃度波動不大，在3 h時小幅上升，6 h時略微下降，隨后12 h、24 h、48 h時保持上升趨勢，但差異不顯著（p＞0.05），72 h時小幅下降。150 μmol/L硫化物脅迫下，其 SO24-濃度3 h時顯著下降（p＜0.05），6 h、12 h時持續小幅上升，之后24 h時有所下降，到48 h、72 h時保持在同一水平內波動。300 μmol/L硫化物脅迫下，其 SO24-濃度3 h時顯著上升（p＜0.05），6 h時大幅下降（p＜0.05），12 h時再次顯著升高（p＜0.05），24 h時小幅波動，48 h、72 h持續大幅下降（p＜0.05）。

圖1 硫化物脅迫下縊蟶血液 SO24-濃度的變化Fig. 1 Changes in S O24- concentration of Sinonovacula constricta under sulfide stress

3.2 ScSULT1B1-12基因序列的生物信息學分析

ScSULT1B1-12基因的cDNA序列全長為1 100 bp，包含 897 bp的ORF，編碼298個氨基酸（圖2）。其預測的蛋白分子量為35.03 kDa，理論等電點為6.37，其中極性氨基酸所占比例較高，為親水性蛋白，無信號肽。功能域預測發現其有1個功能域（Pfam：Sulfotransfer_1，46～291 aa）。該蛋白的二級結構由117個H鍵、137個螺旋數和44個轉角組成。三級結構預測顯示其為同源二聚體。

氨基酸序列同源性分析顯示，ScSULT1B1-12與其他軟體動物ScSULT1B1的同源性最高，其中與長牡蠣（Crassostrea gigas）和美洲牡蠣（Crassostrea virginica）的同源性分別為52.36%和48.48%。與其他動物SULT1B1進行多重序列比對表明，該基因保守性較高，含有4個催化活性位點（56K、104N、106H和134A）、N端的PAPS結合域（YPKSGTXW）、C端的PAPS結合和二聚化域（RKGXXGDWKNXFTVXXE）（圖3）。

圖3 11種動物SULT1B1氨基酸序列的多重比較Fig. 3 Multiple alignments of the amino acid sequences of SULT1B1 in eleven animals

用MEGA7.0軟件以鄰接法構建了各物種SULT1B1的系統進化樹，在線美化后如圖4所示。該進化樹由3個分支組成，ScSULT1B1-12首先與貝類聚為一支，隨后與節肢動物聚為一支，最后再與脊椎動物聚為一支。

圖4 鄰接法構建的ScSULT1B1-12系統進化樹Fig. 4 The ScSULT1B1-12 phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method

3.3 ScSULT1B1-12基因組織表達分析

利用RT-qPCR技術檢測了ScSULT1B1-12在縊蟶鰓、閉殼肌、肝胰腺、斧足、外套膜、水管中的表達情況（圖5）。結果表明ScSULT1B1-12基因在6種組織中均有表達，且其在鰓中表達量最高，其次為閉殼肌和肝胰腺。

圖5 ScSULT1B1-12基因在縊蟶不同組織中的表達Fig. 5 The expression of ScSULT1B1-12 gene in different tissues of Sinonovacula constricta

3.4 ScSULT1B1-12基因在硫化物脅迫下的表達特征分析

硫化物脅迫下，縊蟶鰓中ScSULT1B1-12基因表達水平隨著時間的延長總體呈下降-升高-下降的波動模式（圖6M）。50 μmol/L硫化物脅迫下，鰓ScSULT1B1-12基因的表達量在3 h 時略微下降，6 h、12 h時小幅波動上升后于 24 h 時顯著升高（p＜0.05），隨后48 h 時顯著下降（p＜0.05），并在 72 h 時略有上升。150 μmol/L 硫化物脅迫下，鰓ScSULT1B1-12基因的表達量在 3 h 時顯著下降（p＜0.05），6 h、12 h 時小幅波動后于 24 h 時顯著升高（p＜0.05），隨后 48 h 時顯著下降（p＜0.05），并在 72 h 時保持在同一表達水平。300 μmol/L硫化物脅迫下，鰓ScSULT1B1-12基因的表達水平較前兩組波動劇烈，在3 h時略微下降后于6 h時顯著上升至峰值（p＜0.05），12 h時顯著下降（p＜0.05），隨后24 h小幅升高，在48 h時又劇烈下降（p＜0.05），最后于72 h時保持在同一表達水平。

圖6 硫化物脅迫下ScSULT1B1-12基因在縊蟶鰓（M）和肝胰腺（m）中的表達特征Fig. 6 The expression characteristics of the ScSULT1B1-12 gene in gill (M) and hepatopancreas (m) of Sinonovacula constricta under sulfide stress

硫化物脅迫下，縊蟶肝胰腺中ScSULT1B1-12基因表達水平亦呈波動模式（圖6m）。50 μmol/L、150 μmol/L硫化物脅迫下，肝胰腺ScSULT1B1-12基因的表達模式類似，總體呈下降趨勢。50 μmol/L濃度組，其基因表達量在3 h時顯著下降（p＜0.05），隨后在6 h、12 h、24 h、48 h時在同一范圍內小幅波動，最后于72 h時顯著下降（p＜0.05）。150 μmol/L濃度組，肝胰腺ScSULT1B1-12基因表達量在前3 h維持同一水平，6 h時顯著下降（p＜0.05），之后在12 h時顯著上升（p＜0.05），隨后24 h、48 h、72 h時保持下降趨勢。300 μmol/L濃度組，肝胰腺ScSULT1B1-12基因的表達量在3 h時略微下降，6 h繼續下降后于12 h、24 h、48 h時在同一范圍內波動，最后于72 h小幅上升。

4 討論

硫是生命的基本元素，硫代謝對細胞的生長和存活至關重要[8]。在該代謝通路中，首先硫化物相繼在SQR、SDO、ST等酶的催化下氧化生成代謝中間產物硫酸鹽[8]。本研究發現，硫化物脅迫后縊蟶血液SO24-濃度與脅迫時間呈負相關關系。而硫酸鹽必須經活化后才能參與SULT介導的磺化反應，并在調節內源性化學物質的生物活性，促進其消除中發揮關鍵作用[9,16]。故推測硫化物脅迫后縊蟶體內硫酸鹽產物被活化為PAPS，為磺化反應提供通用供體[9]，在激素、兒茶酚胺神經遞質等的穩態中起著重要作用[17]。

SULT1B1屬于SULT超家族成員之一[18]。該超家族基因包含4個保守的催化活性位點、PAPS結合域、PAPS結合和二聚化域[19]。本研究中ScSULT1B1-12基因也具有上述的催化活性位點及保守功能域。其中位于其C端的KTVE基序（KXXXTVXXE）是SULTs中同源和異源二聚體的常見蛋白質相互作用基序[20]。大多數SULTs是以同源二聚體形式存在[21]。這亦與本研究結果一致，ScSULT1B1-12蛋白的三級結構預測顯示其為同源二聚體。除了SULTs的催化殘基和二聚化區域外，SULTs最保守的區域是PAPS結合域[22]。每個亞型都必須結合PAPS才能發揮其功能[23]。這些活性位點與結構域為ScSULT1B1-12發揮其磺化功能提供了結構支撐。

從ScSULT1B1-12基因的組織表達結果發現其主要在鰓和肝胰腺中高表達，其中鰓表達量最高。這可能是由于鰓是水生生物的呼吸器官，直接暴露于硫化物中[11]，其對脅迫的敏感性較高[24]；而肝胰腺作為經典的解毒代謝器官，也是硫化物氧化的主要部位[25-26]。ScSULT1B1-12基因在縊蟶肝胰腺中高表達，與在嚙齒動物和人類中的研究結果相一致[27]，推測可能與該器官的強代謝能力有關[28-29]。

SULT1B1催化以THs為底物的磺化反應[10,30]，該反應是THs代謝的重要途徑[10]，以調節機體內THs的穩態。而THs是機體最重要的激素之一[31]，可調節所有組織的新陳代謝[10,31-33]，且能參與免疫調節[34-37]。本研究結果表明，硫化物脅迫下ScSULT1B1-12基因的轉錄水平呈波動模式，總體呈下降趨勢。這可能是由于磺化反應是導致THs失活的重要一步[10]，在脅迫初期ScSULT1B1-12基因的表達量顯著升高，使THs大量失活以抑制機體的生理代謝水平，降低其能量消耗；但隨著脅迫時間的延長，其表達量受抑制，可使THs活性保持在一定水平，以加強機體代謝機能來維持基本生命活動所需，同時提高機體的免疫功能，以應對高硫化物濃度的不良環境。此外，縊蟶體內S O24-濃度的變化，從一定程度上也反應了被活化的硫酸鹽通用供體，還可能參與除SULT1B1外的其他SULT超家族成員介導的磺化反應。

5 結論

本研究對ScSULT1B1-12基因的序列結構進行生物信息學分析，表明其在結構上具備催化磺化反應的能力。組織分布表明，其在鰓和肝胰腺中表達量較高。硫化物脅迫后縊蟶血液 SO24-濃度呈下降趨勢，同時ScSULT1B1-12基因的轉錄水平呈抑制趨勢，表明硫酸鹽可被活化生成磺化反應的供體，而ScSULT1B1-12催化的磺化反應受抑制后可使縊蟶體內THs保持活性，以加強其代謝機能來維持機體的基本生命活動，同時提高機體的免疫功能，以適應高硫化物濃度的不良環境。

補充材料

表S1 物種拉丁文學名及其NCBI登錄號對照表

補充材料可通過https://hyxbocean.cn/獲取。補充材料未進行排版和編輯，內容的準確性和科學性由作者承擔。