生物信息學分析干擾素信號通路在神經母細胞瘤遠處轉移中的作用

王捷頻，張雨婷，肖 東

(1.汕頭大學醫學院，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學醫學院第一附屬醫院，廣東 汕頭 515041；3.深圳市兒童醫院，廣東 深圳 518000)

神經母細胞瘤作為最常見的兒童惡性腫瘤之一，發病機制尚不明確。其5年生存率在37%～69%之間[1]?；颊咴缙谕ǔＪ菬o癥狀，少數因腫瘤的數量及位置伴有腹痛、腹脹及便秘[2]。由于缺乏特異性的早期癥狀與腫瘤標志物，50%的高風險患者在診斷時已伴有腫瘤的遠處轉移[3]。因此，識別神經母細胞瘤中參與腫瘤轉移的預后標志物，對于早期診斷及阻斷轉移過程具有重要意義。本研究通過生物信息學分析識別神經母細胞瘤遠處轉移相關的網絡樞紐基因并分析其參與的調控過程，以期為神經母細胞瘤的診斷及治療提供新的策略。

1 資料與方法

1.1 芯片數據下載和預處理

在GEO數 據庫 （http://www.ncbi.nlm.gov/geo）中檢索種屬為人并且與神經母細胞瘤相關的測序數據集，并下載GSE90689數據集。該數據集基于GPL6480平臺，包含神經母細胞瘤原發灶、轉移灶和正常骨髓細胞共57例樣本。根據研究目的，我們選擇了14例來自神經母細胞瘤原發病灶的神經節苷脂2細胞與10例來自轉移灶的神經節苷脂2細胞的mRNA數據，并將數據進行ID轉換及標準化處理，以進行下一步研究。

1.2 篩選差異表達基因

篩選神經母細胞瘤原發灶與轉移灶的差異表達基因，利用R 3.460軟件Limma程序包進行分析，通過樣本中各個基因的表達量的均值±2倍標準差計算出|log2FC|的閾值為0.723。根據P＜0.05與|log2FC|＞0.723條件對數據進行過濾，將標本間的差異表達基因導出。

1.3 功能與通路富集分析

為進一步解釋差異表達基因在神經母細胞瘤轉移過程中發揮的作用，利用DAVID數據庫（http://david.ncifcrf.gov）對差異表達基因進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析和基因本體論（gene ontology，GO）富集分析，以此實現基因與生物學功能上的連接，P＜0.05的功能與通路有統計學意義。

1.4 蛋白質互作用網絡的構建及關鍵基因篩選

采用STRING 11.0（https://string-db.org）數據庫預測蛋白質互作用網絡，進一步研究蛋白之間相關作用的關系。將STRING中導出的網絡圖數據導入Cytoscape進一步優化和分析，安裝MCODE插件聚類基因富集模塊，繪制蛋白質互作用網絡。安裝Cytohubba插件，選取候選模塊中相關性高的基因，通過最大團中心性（maximal clique centrality，MCC）算法篩選出神經母細胞瘤轉移過程的樞紐基因。作為Cytohubba插件中11種算法之一，MCC已被證實在蛋白質互作用網絡中對關鍵蛋白的預測具有更好的效能[4]。

1.5 樞紐基因的表達水平與生存分析

利用R2平臺分析樞紐基因在腫瘤不同分期的表達水平與患者的生存時間。R2平臺（http://r2.amc.nl）是由荷蘭阿姆斯特丹學術醫學中心腫瘤基因組學系開發的基于網絡的基因組學分析和可視化平臺?；?0個樞紐基因高低表達組中患者的生存時間，我們在平臺中進行了Kaplan-Meier生存分析。

1.6 共表達網絡的構建

為驗證樞紐基因是否具有相同的表達模式，即是否存在共調控、功能相關或處于同一通路，使用R軟件的加權基因共表達網絡篩選包，構建差異表達基因共表達網絡?；诟骰虻腜earson相關矩陣分析結果，確立β值并建立無尺度網絡，并通過層次聚類，將網絡中相關性較高的基因分成不同模塊。計算每個模塊的特征向量值，并合并了距離近的模塊。最后計算模塊基因與腫瘤分期及是否轉移之間的相關性，篩選出重要的模塊及其中的基因，以此驗證樞紐基因是否屬于同一通路，共同調控神經母細胞瘤的遠處轉移。

1.7 驗證差異基因

在GEO數據庫中檢索并下載GSE90121數據集。該數據集基于GPL570平臺，包含神經母細胞瘤原發灶和轉移灶共16例樣本。對比10個樞紐基因在原發灶和轉移灶中的表達量，驗證其在神經母細胞瘤轉移過程中的作用。

2 結果

2.1 篩選差異表達基因

以P＜0.05與|log2FC|＞0.723篩 選 差 異 表 達 基因，共得到320個差異表達基因，其中包括上調基因162個，下調基因158個（圖1與圖2）。

圖1 差異表達基因的表達熱圖

圖2 差異表達基因的韋恩圖

2.2 差異表達基因的KEGG和GO富集分析

根據DAVID數據庫對原發灶與轉移灶之間差異表達基因進行生物學功能和通路的富集分析。GO富集分析結果顯示，差異表達基因生物學功能明顯富集在I型干擾素信號通路、對病毒的反應、免疫反應、細胞黏附、細胞分裂、血小板活化與血小板脫粒。細胞成分主要富集在細胞質、細胞表面與染色質。分子功能主要富集在蛋白結合。KEGG通路分析顯示，上調基因主要富集在礦物質的吸收，而下調基因主要富集在造血系統與血小板的活化（圖3、圖4與圖5）。

圖3 上調差異表達基因的GO富集分析

圖4 下調差異表達基因的GO富集分析

圖5 KEGG富集分析

2.3 蛋白質互作用網絡構建與樞紐基因篩選

利用STRING數據庫構建蛋白質互作用網絡，將其導入Cytoscape進一步分析，并通過Cytohubba插件中的MCC算法得到網絡中的樞紐基因，包括IFI44L、IFI44、HERC5、HERC6、USP18、DDX60、ISG15、MX1、RSAD2、MX2（圖6）。

圖6 蛋白質互作用網絡

2.4 樞紐基因的生存預后與表達分析

通過R2平臺獲得10個樞紐基因在神經母細胞瘤患者中的預后分析。其中，在IFI44L、HERC5、USP18、MX1、MX2高表達患者中，總體生存率更高。MX2是唯一一個在不同分期中表達水平差異有統計學意義的樞紐基因（P=0.02）（圖7）。

圖7 生存分析與不同分期的表達水平

2.5 共表達網絡的構建

將320個差異表達基因納入共表達網絡分析，定義網絡拓撲擬合指數為0.8，得到最佳軟閾值β=8時的鄰接矩陣?；虬凑障嚓P性被分成10個模塊，經模塊間相關性分析合并后得到9個模塊，其中與臨床性狀（是否轉移）和腫瘤分期相關性最高的為灰色模塊，且蛋白質互作用網絡中10個樞紐基因皆從屬于灰色模塊（圖8）。

圖8 加權共表達網絡分析

2.6 樞紐基因篩選后驗證

通過數據集GSE90121不同樣本差異表達分析，結果顯示10個樞紐基因在神經母細胞瘤轉移灶與原發灶中表達量存在差異。在轉移灶中以IFI44L、IFI44的高表達及MX2、MX1、USP18、ISG15、RSAD2、HERC5、DDX60的低表達為主（圖9）。

圖9 外部數據集中樞紐基因的表達熱圖

3 討論

神經母細胞瘤作為兒童最常見的惡性腫瘤之一，其遠處轉移是患兒死亡的重要危險因素，然而其轉移機制目前尚不明確。本研究通過一系列生物信息學分析，篩選神經母細胞瘤原發灶與轉移灶之間的差異表達基因，并通過蛋白質互作用網絡與共表達網絡對基因進行進一步篩選，確定了10個與神經母細胞瘤轉移密切相關的樞紐基因?；谘芯康慕Y果，我們旨在尋找潛在的治療靶點，以減少患者早期轉移的可能。

我們研究中共篩選出320個差異表達基因，其中包括上調基因162個與下調基因158個。進行GO、KEGG富集分析，以探究差異表達基因之間的相互作用。上調基因主要富集在干擾素相關的信號通路與對病毒的反應。研究表明，干擾素通路的激活可以影響不同腫瘤的生長和轉移[5]。還有一種觀點認為Ⅰ型干擾素是由惡性細胞產生的，可以通過腫瘤細胞內在或外在的方式引發免疫反應[6]。至于對病毒的反應，我們認為與通過Ⅰ型干擾素所引發的免疫反應有關。在Xin等[7]的研究表明CD200在神經母細胞瘤中的過度表達，可下調機體的抗腫瘤免疫，調節腫瘤的免疫微環境。相比之下，下調基因主要富集于細胞黏附過程。細胞黏附過程在腫瘤的轉移過程中發揮了關鍵作用，整合素作為主要的細胞黏附受體，決定了腫瘤轉移過程中的定植位置[8]。此外下調的基因也富集于血小板的活化和脫粒。Stone等[9]證明P-選擇素介導的血小板結合促進了肺小細胞癌和神經母細胞瘤的轉移。

研究中最終獲得10個與神經母細胞瘤轉移相關的樞紐基因，分別是IFI44L、IFI44、HERC5、HERC6、USP18、DDX60、ISG15、RSAD2、MX1、MX2。通過分析樞紐基因的主要功能，我們發現Ⅰ型干擾素在其中扮演著關鍵角色[10]。為了研究10個樞紐基因在神經母細胞瘤轉移中的作用，我們進行了加權基因共表達網絡篩選分析并定位每個樞紐基因所在的模塊，10個樞紐基因皆屬于灰色模塊，說明樞紐基因可能通過I型干擾素信號通路在神經母細胞瘤轉移的過程中共表達。Ⅰ型干擾素被認為是癌癥治療的雙刃劍[11]。據報道，干擾素特征基因在腫瘤的進展中起著不同的作用。Kim等[12]報道，干擾素誘導雙鏈RNA依賴蛋白激酶在黑色素瘤淋巴結轉移中和結腸癌轉化中高度表達。Ⅰ型干擾素還可以上調免疫檢查點抑制劑的表達水平，抑制劑對程序性死亡受體1通路治療的阻斷具有抗性[13]。干擾素-α不僅可以增強程序性死亡受體1的表達，還可以在持續的免疫反應中對T細胞反應造成衰減[14]。然而，一些研究表明在神經母細胞瘤中，Ⅰ型干擾素具有抗腫瘤作用。Streck等[15]在神經母細胞瘤小鼠模型中測試了I型干擾素的抗血管生成活性。在干擾素-α治療的小鼠中，皮下和腹膜后的腫瘤明顯變小。他們還發現干擾素-α可以降低瘤內成纖維細胞生長因子和血管內皮生長因子的表達水平[16]。Dedoni等[17]報道干擾素-β可以通過調節P38 MAPK誘導人神經母細胞瘤細胞的凋亡。這些研究表明，干擾素特征基因高表達的原因可能是神經母細胞瘤進展中機體的自身免疫反應。我們認為干擾素特征基因可以作為神經母細胞瘤患兒潛在的預后標志物與治療的分子靶點。

總而言之，我們通過一系列生物信息學研究識別了10個神經母細胞瘤轉移相關的樞紐基因。這些基因與Ⅰ型干擾素信號通路關系密切，具有作為神經母細胞瘤的診斷標志物及治療靶點的潛能。這些發現對揭示神經母細胞瘤遠處轉移的研究進展具有重要意義。