壯藥凈癬洗劑質量標準研究

韋振源，龔敏陽，鐘 江，楊正騰，陳 朝，吳 霜，馬家寶，黃 慶

（廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023）

壯藥凈癬洗劑是廣西中醫藥大學第一附屬醫院皮膚科鐘江教授治療足癬、手癬、頭癬、體癬的經驗方，其臨床療效良好，且無明顯不良反應［1］。凈癬洗劑由土荊皮、功勞木、蛇床子、白鮮皮、地膚子、苦參、廣藿香等中藥組成，具有清熱解毒、消炎止痛、消腫殺蟲止癢等功效；尤其是在皮膚病滲出期不宜使用外用藥膏階段，可使用凈癬洗劑收斂殺菌，提高臨床治愈率。為保證臨床安全用藥，本實驗采用薄層色譜法鑒別處方中功勞木、苦參中藥材，并采用高效液相色譜法對苦參堿進行含量測定，現報道如下。

1 實驗材料

1.1 儀器YOKO-CS紫外線透射反射成像儀（武漢藥科新技術開發有限公司）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；GH-252電子分析天平（日本A&D公司）；CD-UPT超純水機（成都越純科技有限公司）；KQ5200DB超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；pHS-3E pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；HH-2水浴鍋（金壇市科研儀器有限公司）；G型薄層層析硅膠板（規格為20cm×20cm，青島海洋工廠）；毛細管（國藥控投有限公司）。

1.2 試劑和對照品功勞木對照藥材（批號：121461-201503）、鹽酸小檗堿（批號：110713-201212）、苦參對照藥材（批號：121019-201006）、苦參堿對照品（批號：110805-200508，供含量測定用）均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇（分析純，西隴科學股份有限公司）；磷酸（色譜純，上海展云化工有限公司）；三乙胺（色譜純，成都市科隆化學品有限公司）；三氯甲烷（分析純，成都市科隆化學品有限公司）；濃氨水（分析純，西隴科學股份有限公司）；純化水為實驗室自制。

1.3 樣品凈癬洗劑（批號：20191110、20191202、20191226）及陰性樣品均由廣西中醫藥大學第一附屬醫院制劑室制備。

2 方法與結果

2.1 功勞木的薄層鑒別［2］

2.1.1 對照品溶液的制備取功勞木對照藥材0.1 g，加10 ml甲醇超聲處理15 min，濾過，蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為對照藥材溶液。另取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備取凈癬洗劑10 ml，置寬口錐形瓶中，蒸干，殘渣加甲醇10 ml，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 缺功勞木陰性溶液的制備取缺功勞木藥材制成的陰性樣品10 ml，同2.1.2項供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

2.1.4 薄層層析照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，分別吸取供試品溶液、陰性對照溶液各2 μl，對照品溶液、對照藥材溶液各1 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）為展開劑，展開，展距約8.0 cm，取出，晾干，紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，而陰性無此斑點。結果見圖1。

圖1 功勞木薄層色譜圖

2.2 苦參的薄層鑒別［2］

2.2.1 對照品溶液的制備取苦參對照藥材0.2 g，置磨口錐形瓶中，加25 ml氯仿、0.3 ml濃氨水，超聲處理15 min，濾過，蒸干，殘渣加氯仿1 ml使溶解，制成對照藥材溶液。另取苦參堿對照品，加乙醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備取凈癬洗劑5 ml，置磨口錐形瓶中，蒸干，殘渣加25 ml氯仿、0.3 ml濃氨水，超聲處理15 min，放置過夜，濾過，濾液蒸干，殘渣加氯仿1 ml使溶解，作為供試品溶液。

2.2.3 缺苦參陰性溶液的制備取缺苦參藥材制成的陰性樣品5 ml，同2.2.2項供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

2.2.4 薄層層析照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，分別吸取供試品溶液、陰性對照溶液各2 μl，對照藥材溶液5 μl、對照品溶液3 μl，點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮-甲醇（8∶3∶0.5）為展開劑，展開，展距8 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1）10℃以下放置的上層溶液為展開劑，展開，展距8 cm，取出，晾干，依次噴以碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同的橙色斑點，而陰性無此斑點。結果見圖2。

圖2 苦參薄層色譜圖

2.3 苦參堿的含量測定參照文獻［3］方法，采用高效液相色譜法對苦參中苦參堿進行定量測定。

2.3.1 色譜條件色譜柱：Inertsil ODS-3柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（10∶90），用三乙胺調pH值至6.5；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μl；檢測波長：220 nm；理論塔板數以苦參堿峰計算不小于4 000；苦參堿分離度大于1.5。

2.3.2 對照品溶液的制備精密稱定苦參堿對照品5 mg，加入甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中，搖勻，制成每1 ml含0.5 mg苦參堿的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備精密量取凈癬洗劑5 ml，轉移至分液漏斗，加入2 ml濃氨水，輕輕搖勻。用氯仿提取3次，每次10 ml，收集3次氯仿液，于60℃水浴鍋上蒸干，將得到的殘渣先加入適量的甲醇溶解，再轉移定容至50 ml容量瓶中，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3.4 陰性對照溶液的制備按處方稱取除苦參以外的各味藥材，并參考“2.3.3”項下的方法制成陰性對照溶液。

2.3.5 專屬性試驗分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀測定，記錄色譜圖。對照品溶液中苦參堿色譜峰的保留時間為20.574 min，在供試品溶液中，苦參堿色譜峰保留時間為20.012 min，兩者出峰時間對應。而陰性對照品中在對應的保留時間無色譜峰吸收，表明陰性樣品對測定無干擾。結果見圖3。

圖3 HPLC色譜圖

2.3.6 線性關系考察精密吸取上述對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件，分別進樣2 μl、4 μl、6 μl、8 μl、10 μl、12 μl、14 μl、16 μl、20 μl，測定相應的峰面積值，并記錄下來。以苦參堿進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為Y=74 133X-5 914.7（r2=0.999 7）。結果表明，苦參堿的進樣量在1～10 μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.3.7 精密度試驗精密吸取苦參堿對照品溶液（0.5 mg/ml）10 μl，按“2.3.1”項下色譜條件連續進樣6次，并記錄峰面積值，以峰面積計算苦參堿的RSD為1.73%（n=6）。結果表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩定性試驗選取同一供試品溶液（批號為20191108），分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣測定，并記錄峰面積值，結果苦參堿的峰面積RSD為1.40%（n=6），表明供試品溶液中苦參堿在24 h內基本穩定。

2.3.9 重復性試驗選取凈癬洗劑（批號為20191108）1份，按“2.3.3”項下方法平行制備成6份供試品溶液，再按“2.3.1”項下的色譜條件分別進樣測定，記錄峰面積值。結果苦參堿含量分別為：16.368 6 mg/ml、16.297 6 mg/ml、15.711 0 mg/ml、16.096 9 mg/ml、16.345 0 mg/ml、16.568 2 mg/ml，平均值為16.23 mg/ml，RSD為1.87%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗精密量取已知含量的樣品（批號為20191108，濃度為16.23 mg/ml）5 ml，共6份，再精密加入22.6 mg/ml的苦參堿對照品1.0 ml，按“2.3.3”項下方法制備成6份供試品溶液，分別按“2.3.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積值，計算加樣回收率。結果平均回收率為100.77%，RSD為0.60%（n=6），表明該方法準確度較好。結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果 （n=6）

2.3.11 樣品含量測定取3批不同批次的凈癬洗劑，每批各取3份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣，進行含量測定。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果 （n=3）

3 討論與小結

3.1 檢測波長的考察通過查閱《中華人民共和國藥典》2015版一部［4］203和相關文獻［5］記載，苦參堿在215～225 nm處有較大的吸收峰，為保證得到較好的檢測結果，故本次實驗中選擇220 nm作為檢測波長。

3.2 供試品提取方法的考察絕大多數的生物堿在水中的溶解度幾乎為0，但在一些有機溶劑中有著較高的溶解度。在本實驗的供試品制備中，經查閱有關文獻［6-7］，比較了乙醚與氯仿對苦參堿提取效果的影響，最終的實驗結果表明：使用氯仿的提取效果更佳，可較大程度地提取其中的有效成分，且相應色譜峰無干擾雜質，分離度較好。

3.3 流動相的考察在使用苦參堿對照品進行預實驗中，對甲醇-水-三乙胺（50∶50∶0.05）［6］、乙腈-甲醇-磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）-三乙胺（22∶22∶70∶0.1）［8］等多種流動相進行考察，結果發現基線不穩定，苦參堿色譜峰分離度和峰形較差，有拖尾現象，對峰面積值的數據準確性有影響，隨后選用乙腈-0.1%磷酸溶液（用三乙胺調pH值至7.6）［4］895。通過調整流動相乙腈-0.1%磷酸溶液的組成比例（10∶90、20∶80、25∶75、30∶70），發現當乙腈的組成比例增加時，苦參堿的出峰時間也隨之變短（分別為25.945 min、17.463 min、12.589 min、8.649 min），考慮到后期需通過調節流動相的pH值來改善峰形，為得到合適的保留時間，故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液的組成比例為10∶90。在對0.1%磷酸溶液的pH值進行優化時，發現流動相在pH=6.5時，苦參堿色譜峰與溶劑峰分離度好，無干擾，保留時間適中，且拖尾現象得到改善。

3.4 誤差分析從本次實驗數據來看，苦參堿的保留時間不完全一致對應，有較大的誤差。有可能是因為流動相中的0.1%磷酸溶液（用三乙胺調pH值至6.5）為實驗人員自行配制，存在過濾不全、流動相不均勻等問題，從而導致保留時間的提前或延后。

3.5 小結本文采用薄層色譜法，以專屬性好的對照品及對照藥材為對照，對功勞木、苦參進行定性鑒別研究。實驗結果表明，各供試品色譜中，在與對照品及對照藥材相應的色譜位置上有相同橙黃色的熒光斑點，相應藥材空白對照無干擾，專屬性良好。在含量測定項中，建立了HPLC法測定凈癬洗劑中苦參堿總含量的方法，通過方法學考察和含量測定，提示該方法可行性強、操作簡單、準確可靠，可為凈癬洗劑質量標準的制定和深入研究提供參考依據。