1-磷酸鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇受體2在急性主動脈夾層患者外周血中的表達及其與預后的關系

王期峰，路 霖

（青海省心腦血管病?？漆t院心外科，西寧 810000）

急性主動脈夾層（acute aortic dissection，AAD）是臨床較為常見的心血管急危重癥，其起病急、病情兇險、進展快、預后差，嚴重威脅患者生命安全［1］。目前，AAD 發病機制尚未完全解釋清楚，但學者認為其發病與外傷、免疫調節、原發性高血壓（高血壓）、動脈粥樣硬化、血管發生、血管炎癥反應等密切相關［2-3］。有關報道顯示，1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）是一種具有多效性的脂質分子，其可能在動脈粥樣硬化發病過程中起重要作用，S1P 可能是減輕動脈粥樣硬化疾病的新靶標［4］。另外，1-磷酸鞘氨醇受體2（sphingo?sine-1-phosphate receptor 2，S1PR2）屬于G 蛋白耦聯受體家族成員之一，其在冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┗颊哐逯斜磉_失調，S1PR2 通過微小RNA-126 負調控，進而在冠狀動脈粥樣硬化進展中發揮重要作用［5］。但S1P、S1PR2 在AAD中的表達及其與預后的關系尚未發現有關報道，基于此，本研究通過檢測AAD 患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中S1P、S1PR2 表達，分析其與預后的相關性，以期為臨床診斷、評估AAD患者預后提供一定參考價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年1 月至2018 年1 月青海省心腦血管病?？漆t院收治的AAD 患者85 例進行研究，稱AAD組，其中男57例，女28例；年齡（47.85±6.97）歲。并選取同時間段內本院體檢健康者85 名進行對照研究，稱對照組，其中男53 例，女32 例；年齡為（48.32±7.89）歲。兩組性別比例、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

診斷標準：參考《2014 年歐洲心臟病學會主動脈疾病診治指南解讀》相關AAD 判定標準進行診斷［6］。納入標準：（1）患者均符合AAD 有關診斷標準，均結合患者臨床體征、癥狀、磁共振成像等影像學確診；（2）入院前無視聽障礙、無精神系統疾病，意識清楚，無溝通障礙者；（3）患者病理檢查資料齊全、可靠；（4）無嚴重臟器、肢體缺血癥狀者。排除標準：（1）合并急、慢性感染或炎癥性風濕病、自身免疫性疾病的患者；（2）入院前3 個月內服用免疫抑制劑、非甾體抗炎藥的患者；（3）合并結締組織疾病、惡性腫瘤的患者；（4）合并肝及腎功能不全的患者；（5）近半年內行外科手術、創傷者。

患者預后情況：本組85 例AAD 患者均進行深低溫停循環+單側或雙側腦灌注技術的手術治療，2 d 內共死亡29 例，存活56 例，存活定義為預后良好，死亡定義為預后不良。

所有患者及其家屬對本研究均知情同意，并簽署知情同意書，本研究符合《赫爾辛基宣言》，報經本院倫理委員會審核、批準后實施。

1.2 主要試劑與儀器

Ficoll 淋巴細胞分離液（貨號：P8900）購買于上海恒斐生物科技有限公司；Trizol Reagent（貨號：15596-026）購買于上海聯碩生物科技有限公司，PrimeScript RT Master Mix（貨號：RR036A）購買于廣州威佳科技有限公司，SYBR Green PCR Mas?ter Mix（貨號：YDM6206）購買于上海羽朵生物科技有限公司。

紫外分光光度計（型號：DU-730）購買于上海普迪生物技術有限公司，qRT-PCR 儀（型號：LightCycler?480II）購自羅氏診斷產品（上海）有限公司。

1.3 樣本收集

收集所有受試者于晨起空腹狀態下外周靜脈血4 mL，置于含有肝素抗凝管中，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離各樣本PBMC，于-80℃冰箱中保存，用于檢測S1P、S1PR2、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）表達。

1.4 qRT-PCR法檢測PBMC中S1P、S1PR2、MMP-9表達

于-20 ℃冰箱中取出PBMC 樣本，冰上溶解，依照TRIzol 試劑盒說明書添加TRIzol 裂解液，從PBMC 樣本中提取總RNA。采用紫外分光光度計測定抽提RNA 樣本在260 nm、280 nm 波長處的吸光度（Absorbance，A），并以抽提RNA 樣本A260/A280比值在1.8～2.1 之間為合格檢測樣本，繼續下一步操作。以2 μL 總RNA 為模板，按照PrimeScript RT Master Mix 說明書進行反轉錄，得cDNA。參考SYBR Green PCR Master Mix 說明書配制擴增反應體系，將cDNA 擴增、檢測。S1P、S1PR2、MMP-9 及內參GAPDH 引物序列見表1。以2-ΔΔCT法計算S1P、S1PR2、MMP-9 相對表達。

表1 S1P、S1PR2、MMP?9 及內參GAPDH 的引物序列

1.5 統計學分析

本組所得實驗數據均利用SPSS 25.0 軟件進行統計學分析。經正態性檢驗，計量數據均符合正態分布，以（）的形式表示，組間數據比較，進行獨立樣本t檢驗。計數資料以［n（%）］表示，組間數據比較，采用卡方（χ2）檢驗。以Pearson 相關性分析法分析AAD 患者PBMC 中S1P、S1PR2 表達與MMP-9 的相關性。以Logistic 回歸分析法分析AAD 預后的影響因素：以AAD 預后是否良好（預后良好=0，預后不良=1）為因變量，以冠心?。ǚ?0，是=1）、S1P（連續變量）、S1PR2（連續變量）、MMP-9（連續變量）為自變量。采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）評估PBMC 中S1P、S1PR2、MMP-9 表達對AAD 患者預后的的診斷效能。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者PBMC 中S1P、S1PR2、MMP-9 表達比較

與對照組相比，AAD 組患者PBMC 中S1P 表達明顯降低，S1PR2、MMP-9 表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表2。

表2 兩組受試者PBMC中S1P、S1PR2、MMP-9表達比較 ［n=85，±s］

表2 兩組受試者PBMC中S1P、S1PR2、MMP-9表達比較 ［n=85，±s］

2.2 AAD 患者PBMC 中S1P、S1PR2 表達與MMP-9的相關性

Pearson 相關性分析結果顯示，AAD 患者PBMC中S1P 表達與MMP-9 均呈負相關（r=-0.477，P＜0.05），S1PR2 表達與MMP-9 呈正相關（r=0.487，P＜0.05），詳見圖1、2。

圖1 AAD 患者PBMC 中S1P 表達與MMP-9 的相關性散點圖

圖2 AAD 患者PBMC 中S1PR2 表達與MMP?9 的相關性散點圖

2.3 兩組不同預后AAD 患者臨床資料及PBMC中S1P、S1PR2、MMP-9 表達比較

與存活組相比，死亡組AAD 患者冠心病比例、S1PR2、MMP-9 表達均顯著升高，S1P 表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表3。

表3 兩組不同預后AAD 患者臨床資料及PBMC 中S1P、S1PR2、MMP-9 表達比較 ［n（%），±s］

表3 兩組不同預后AAD 患者臨床資料及PBMC 中S1P、S1PR2、MMP-9 表達比較 ［n（%），±s］

2.4 Logistic 回歸分析分析主動脈夾層患者預后的影響因素

以AAD 預后是否良好為因變量，以冠心病、S1P、S1PR2、MMP-9 表達為自變量，行Logistic 回歸分析，結果顯示，S1PR2、MMP-9 為AAD 預后的危險因素（均P＜0.05），S1P 為AAD 預后的保護因素（P＜0.05），詳見表4。

表4 影響AAD 患者預后的Logistic 回歸分析

2.5 PBMC 中S1P、S1PR2、MMP-9 表達對AAD 患者預后的評估價值

ROC 分析結果顯示，PBMC 中的S1P、S1PR2表達預測AAD 不良預后的曲線下面積（area undercurve，AUC）分別為0.866、0.875，兩者診斷價值高于MMP-9，血清S1P、S1PR2 聯合預測AAD 不良預后的AUC（0.927），其靈敏度、特異度分別為90.6%、83.5%，詳見表5、圖3。

表5 各項指標對AAD 不良預后的診斷效能

圖3 PBMC 中S1P、S1PR2、MMP-9 表達對AAD 患者預后的ROC 圖

3 討論

AAD 主要是由主動脈破裂引起的心血管疾病，以主動脈中層彈力纖維變性斷裂、平滑肌壞死為病理基礎，以急性胸痛為主要臨床癥狀，可導致死亡［7-8］。目前，臨床多采用影像學診斷AAD，但影像學診斷費用較高，且搬動患者過程中易使動脈瘤破裂，造成嚴重后果。因此，尋找可有效診斷AAD、評估患者預后的生物標志物，對改善AAD患者生存質量有一定積極意義。

S1P 是一種膜磷脂類代謝產物，可通過與細胞表面的S1PR2 等受體作用，進而參與免疫調節、心肌缺血再灌注損傷、血管舒張、血管生成及內皮保護等生物學過程［9-10］。近期研究顯示，S1P 通過與特異性G 蛋白偶聯受體結合介導心臟炎癥等反應，其可能是治療缺血再灌注損傷及冠心病的潛在靶標［11］。此外，Kitano 等［12］研究認為S1P 可調節血管平滑肌細胞增殖及遷移，進而引起血管重建，造成動脈粥樣硬化和再狹窄，且S1P 信號通路在血管損傷后的新內膜增生中起重要作用。以上研究表明，S1P 表達異?？赡芘c血管異常疾病關系密切。本研究中AAD 組患者PBMC 中S1P 表達明顯低于對照組，提示S1P 可能在AAD 病理進展中具有重要作用，推測低水平S1P 可能通過與其受體相結合，進而調節血管炎癥反應、血管新生，從而促進AAD 發展。S1PR2 在調節血管舒張度、血管通透性等方面起重要作用，S1PR2 可通過影響血管平滑肌細胞遷移功能、血管內皮細胞屏障通透性及血管發生、發育等過程，進而影響血管穩態，促進炎癥反應，從而影響心血管系統疾病進程［13］。既往研究認為，S1PR2 在動脈粥樣硬化內皮病變中濃度顯著升高，其可通過影響信號傳導進而影響內皮炎癥反應，從而在心血管疾病發生、發展中發揮重要作用［14］。本研究中AAD 組患者PBMC 中S1PR2 表達明顯高于對照組，提示S1PR2表達異?？赡芘cAAD 病變過程有關，究其原因，高濃度S1PR2 可能通過影響血管穩態，促進血管炎癥反應，從而在AAD 發展中發揮促進作用。

MMP-9 是造成主動脈中層彈力纖維變性、平滑肌壞死的重要酶類之一，其在AAD 患者血清中濃度顯著上升，具有診斷AAD、評估患者預后的潛在價值［15］。本研究中AAD 患者PBMC 中MMP-9表達顯著上調，與孟少志等［15］研究一致，提示MMP-9 可能在AAD 疾病進展中起重要作用，推測高濃度MMP-9 可引起主動脈彈力蛋白及膠原纖維降解，導致血管壁薄弱，進而造成主動脈持續擴張至破裂，促進AAD 病情發展。本研究顯示，AAD 患者PBMC 中S1P 表達與MMP-9 均呈負相關，S1PR2 表達與MMP-9 呈正相關，提示S1P、S1PR2 可能與MMP-9 相互作用，進而影響AAD 發展，但具體作用機制有待深入探究。

本研究中死亡組AAD 患者冠心病比例、S1PR2、MMP-9 表達均顯著高于存活組，S1P 表達明顯低于存活組，提示冠心病、S1P、S1PR2、MMP-9 均可能影響AAD 患者預后情況。進一步研究顯示，S1PR2、MMP-9 為AAD 預后的危險因素，S1P為AAD 預后的保護因素，提示PBMC 中S1P 表達濃度、S1PR2、MMP-9 濃度升高均可能會增加AAD患者發生不良預后的風險，早期監控S1P、S1PR2、MMP-9 濃度，有利于改善AAD 患者預后情況。研究發現，PBMC 中S1P、S1PR2 濃度預測AAD 不良預后的AUC 分別為0.866、0.875，當S1P 相對表達量＜0.54 或S1PR2＞1.97 時，AAD 患者發生不良預后的風險較高，提示S1P、S1PR2對AAD不良預后有一定的評估價值，且兩者診斷價值高于MMP-9；S1P、S1PR2 聯合預測AAD 不良預后的AUC 為0.927，其靈敏度90.6%，特異度為83.5%，提示S1P、S1PR2聯合診斷AAD 不良預后的靈敏度高于單獨診斷，兩者聯合可提高AAD 不良預后的預測價值。

綜上所述，AAD 患者S1P 表達降低，S1PR2 表達升高，兩者可能與AAD 發病過程相關，兩者聯合可有效提高對AAD 不良預后的預測價值，可更好地評估AAD 患者預后情況。但本研究未深入探討S1P、S1PR2 在AAD 發病中的機制，后期將增加樣本量進行研究。