一種基于光交聯明膠-聚丙烯酰胺的神經組織工程構建物

安玉川，成 榮，孫 蕾，桑勝波

(1.太原理工大學 a.微納傳感與人工智能感知山西省重點實驗室，b.新型傳感器與智能控制教育部重點實驗室，太原 030024；2.山西省六維人工智能生物醫學研究院，太原 030031)

時至今日，神經損傷引發的神經功能障礙仍嚴重影響人類的健康與生活[1]。在過去的幾十年中，許多天然聚合物(如膠原[2]、絲素蛋白[3])及合成聚合物[4]被開發并成功用于周圍神經損傷的修復。但效果仍然不如自體移植物，這是由于未達到周圍神經修復的黃金標準[4-5]。因此，開發用于神經再生的組織工程構建物仍具有很大的研究和臨床價值[6]。

在20世紀80年代，有研究者將硅膠管成功應用于臨床修復，但是它不可降解的特性，降低了神經修復效果，不利于神經組織的生長。因此，人們開始使用可降解的生物材料來制造神經組織工程構建物，如明膠、殼聚糖和海藻酸鈉等，這類材料被廣泛應用，但是其在機械性能方面仍有缺失。近年來，SOUCY et al[7]使用光固化明膠(GelMA)和甲基丙烯酰胺取代的彈性蛋白原(MeTro)的合成制備可調節的機械性能神經組織工程構建物，具有良好的實驗結果，但該材料制作成本高，機械性能調節范圍較小，仍具有一定的局限性。因此，研究可調節機械性能的復合生物材料仍有價值。

GelMA是一種以明膠為基底，通過接枝反應使得甲基丙烯酸酐基團接入，進而生成可由藍光引發聚合凝膠的生物合成材料[8]，具有良好的生物相容性和生物降解性，被廣泛應用于生物組織再生，包括關節組織[9]、心肌組織[10]等。但是，這種水凝膠在體內降解速率過快[11]，且機械性能較弱[12]，不利于神經組織細胞長期的黏附。

聚丙烯酰胺(PAM)是一種親水性好且柔韌強的生物合成材料[13]，具有良好的機械性能和可控的降解性能[14]，現已廣泛應用于生物化學及醫藥[15-18]領域。通過添加催化劑可激發PAM本身的光固化特性，提高復合水凝膠的可塑性，并且改變PAM的比例，可實現復合水凝膠的彈性調節[19-21]。然而，純PAM水凝膠材料生物相容性較差，不適合作為組織工程神經構建物。

綜上所述，本文根據兩種材料的特點，制備了 GelMA-PAM復合水凝膠作為雪旺細胞的體外三維生長環境，并表征了不同比例GelMA-PAM復合水凝膠的形貌、理化性能和機械性能，同時測試了雪旺細胞在復合水凝膠上的體外生長狀況，評估了支架對雪旺細胞生長、分化的影響，優化了復合水凝膠的混合比例，制備出機械性能強且生物相容性好的組織工程神經構建物。

1 實驗

1.1 材料制備

1.1.1GelMA制備

由文獻[22]可知，明膠與甲基丙烯酸酐(MA)能夠發生接枝反應，將甲基丙烯基團引入到明膠上，得到可由紫光引發聚合的GelMA.具體操作方法如下：稱取5 g明膠加入到50 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS溶液)中；將溶液整體移至50 ℃水浴鍋中使明膠完全溶解，配成10%的明膠溶液；將8 mL的MA以1 mL/min的速度加入到10%的明膠溶液中，并且將上述溶液在50 ℃水浴鍋中攪拌反應3 h；隨后加入200 mL的PBS溶液(預熱至50 ℃)，用于稀釋MA與明膠的反應溶液；4 h后將反應液裝入12～14 ku的透析袋中；6 d后將反應液離心，取上清液冷凍干燥得到GelMA.

1.1.2GelMA-PAM復合水凝膠制備

首先將5 mg藍光引發劑溶于超純水1 mL中配置成質量濃度為0.5%的溶液；加入100 mg GelMA配置成10%的光交聯明膠溶液。然后向溶液加入預定比例的丙烯酰胺(AM)單體，攪拌均勻后，倒入直徑為100 mm的圓形模具中，在紫外燈下照射1 min，固化聚合成GelMA-PAM復合水凝膠支架。GelMA-PAM混合比例如表1所示。

表1 GelMA和PAM的混合比例Table 1 Ratio of PAM and GelMA

1.2 GelMA-PAM復合水凝膠的性能測試

1.2.1傅里葉變換紅外光譜

使用紅外光譜儀(德國，布魯克光譜，Tensor 27)分析水凝膠的紅外光譜。通過KBr壓片法得到樣品的傅里葉變換紅外光譜(FTIR).在4 cm-1分辨率下對每個樣品在400～4 000 cm-1范圍內進行掃描，每個樣品總共掃描了64次。

1.2.2溶脹率測試

先將GelMA-PAM復合水凝膠支架用天平稱重(記為w0)，再浸入37 ℃的PBS溶液中浸泡。分別在浸泡1，3，6，12 h后，將支架取出，吸出表面多余水分，測定此時的支架重量為w1，根據如下公式(1)

wS=[(w1-w0)/w0]×100% .

(1)

計算出不同時間間隔的溶脹率以及溶脹平衡狀態下的溶脹率。

1.2.3機械性能測試

通過電子材料試驗機(美國，Instron公司，Instron 3343)測定GelMA-PAM復合支架的應力-應變曲線。在室溫下，以0.5 mm/min的恒定速率壓縮樣品，采用變形5%～20%時的應力-應變曲線斜率來計算楊氏模量，每個樣品測量3次取平均值。

1.2.4支架形貌分析

用掃描電子顯微鏡(日本，高新公司，SU8000)分析不同混合濃度比例的復合水凝膠支架形貌。首先將復合材料支架冷凍干燥，再將支架進行噴金處理，最后在12～15 kV加速電壓下觀察支架的微觀形態。

1.2.5孔隙率表征

首先制作不同比例的水凝膠支架各3個，測量其體積V；放入PBS溶液中浸泡至完全溶脹后測量重量記為w3；將水凝膠放入無水乙醇中，完全析出水分后，測量重量為w2；根據公式(2)計算出孔隙率并取平均值，其中ρ為酒精的密度[23]。

wp=[(w3-w2)/(ρ×V)]×100% .

(2)

1.2.6細胞活性檢驗

在制作水凝膠支架時，將PBS溶液替換為Gibco高糖培養基DMEM，同時通過培養液中的酚紅指示劑來調節溶液的pH值，增加材料支架富含的營養；將溶液經過濾頭做除菌處理，制備成無菌的水凝膠支架；將水凝膠支架放入24孔板中用培養液浸泡24 h，去除未交聯的丙烯酰胺單體和催化劑；將第三代大鼠雪旺細胞以105 cm-2的密度接種在GelMA-PAM混合支架上，置于培養箱中培養；分別在1，3，5 d進行細胞活性檢測。細胞活性檢測實驗步驟如下：首先將支架用PBS沖洗兩次，加入活細胞染色試劑(Calcein-AM)染色孵育1 h；用PBS清洗3次，加入死細胞染料試劑(PI)染色0.5 h；將支架用PBS溶液清洗3次，放置于細胞成像多功能微孔板檢測系統(美國，伯騰儀器有限公司，Cytation 5)中觀察。

1.2.7細胞增殖檢驗

細胞接種過程與細胞活性實驗相同。在1，3，5 d分別檢測了CCK-8的光度值，觀察細胞增殖的情況。具體操作過程如下：首先將24孔板內的培養液吸出，同時用PBS溶液將細胞清洗3次；將配置好的CCK-8染色劑加入24孔板中；將孔板重新放入培養箱中孵育3 h；將孵育后的100 μL染色劑移入96孔板內并除去氣泡；放入細胞成像多功能微孔板檢測系統中測量其吸光度。

1.2.8細胞形態檢測

將接種到支架上的細胞進行細胞骨架染色實驗，觀察不同比例支架上的細胞形態，統計細胞的伸長情況。具體實驗步驟如下：將培養3 d的水凝膠支架與細胞用PBS清洗預處理后待用；在24孔板中加入體積分數為4%的多聚甲醛將支架固定20 min；加入TritonX-100通透液通透20 min；在避光條件下加入鬼閉環太染色試劑，并在室溫條件下孵育40 min；用PBS清洗后加入細胞核DAPI染劑避光孵育10 min；最后用PBS清洗干凈，置于細胞成像多功能微孔板檢測系統中拍照觀察。

1.2.9細胞免疫檢測

將接種到支架上的細胞進行細胞免疫檢測，觀察不同比例支架上的細胞分化的形態。將培養3 d后的復合材料支架進行預處理，過程如下：先用PBS清洗，再加入4%的多聚甲醛固定20 min，最后加入TritonX-100通透20 min.細胞免疫檢測實驗過程如下：首先在室溫條件下加入體積分數5%山羊血清封閉1 h；在4 ℃條件下加入S100B Rabbit pAb一抗溶液過夜；第二天在室溫條件下加入羊抗兔二抗溶液孵育1 h；用PBS清洗并加入DAPI染劑避光孵育10 min；最后用PBS清洗干凈，置于細胞成像多功能微孔板檢測系統中拍照觀察。

2 結果與討論

2.1 GelMA-PAM水凝膠支架成分分析

圖1 GelMA-PAM、AM、GelMA的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of GelMA-PAM, AM, and GelMA

2.2 GelMA-PAM復合水凝膠形貌分析

通過掃描電子顯微鏡測試，觀察復合水凝膠支架的內部結構以及孔隙的大小。如圖2所示，純GelMA與3種不同比例的復合水凝膠都具有良好的通孔結構，這種通孔結構有利于細胞的黏附以及營養的交換，且孔徑的大小隨著PAM比例的增加而減小。純GelMA水凝膠的平均孔徑約為100～200 μm；而GelMA與PAM比例為1∶0.25時，水凝膠的平均孔徑略有減??；當兩者比例為1∶0.5時，水凝膠的平均孔徑減小為80 μm左右；當比例為1∶1時，水凝膠的平均孔徑只有50 μm左右。該現象是因為在GelMA-PAM水凝膠交聯的過程中，GelMA與AM單體、GelMA自身以及AM單體分別交聯成孔，形成雙網絡結構，且該結構會隨AM質量濃度的增加而加強，從而減小復合水凝膠的平均孔徑。

圖2 GelMA-PAM復合水凝膠支架不同比例的SEM圖Fig.2 SEM images of different scales of GelMA-PAM composite hydrogel scaffolds

2.3 GelMA-PAM水凝膠支架理化特性

檢測復合水凝膠的溶脹性和孔隙率，分析復合水凝膠的理化特性。圖3(a)展示了不同時間段內水凝膠的溶脹率，在1～3 h內，PAM濃度比例越高的支架，溶脹的速率越快。從整個時間段來看，GelMA-PAM復合水凝膠的溶脹率一直高于純GelMA水凝膠的溶脹率。當浸泡至12 h，所有水凝膠達到溶脹平衡保持不變。這表明了復合水凝膠支架對細胞營養液有較好的吸收作用。圖3(b)記錄了水凝膠在溶脹平衡時的溶脹率，純GelMA水凝膠的平衡溶脹比為5.6，而GelMA-PAM復合水凝膠的平衡溶脹比可達到11.1，接近于純GelMA水凝膠的兩倍，說明復合水凝膠具有更好的親水性。這是因為PAM鏈具有良好的親水性，而復合水凝膠中具有大量PAM鏈網絡，從而提高了水凝膠的保水性，可以更好地儲存細胞所需的培養液。

不同濃度比例的復合水凝膠孔隙率如圖4所示。從圖中可知純GelMA水凝膠的孔隙率為50%左右，且隨著PAM濃度的增加，水凝膠的孔隙率下降。這是因為PAM中AM交聯產生了PAM鏈網格，因此，水凝膠的交聯密度隨PAM濃度的增加而上升，從而導致孔隙直徑的縮小以及孔隙率的減小，這與支架的微觀內部結構分析結果相同。

2.4 GelMA-PAM復合水凝膠機械性能

純GelMA水凝膠與GelMA-PAM復合水凝膠的壓縮應力-應變曲線如圖5所示。圖5(a)為應力-應變曲線，在應變5%～20%范圍內應力曲線的斜率代表了復合水凝膠的韌性，斜率越大韌性越高。由此可以看出，混合比例為1∶1的GelMA-PAM混合水凝膠韌性最強，且隨著PAM比例下降，應力-應變曲線斜率下降，證明了PAM的引入提高了復合水凝膠的韌性。圖5(b)為水凝膠的楊氏模量，通過對比，1∶1的GelMA-PAM混合水凝膠表現了出了極高的強度，是純GelMA水凝膠的10倍以上。這是因為一方面PAM本身就具有良好的韌性與楊氏模量，它的加入使復合水凝膠機械性能提高；另一方面，根據2.2的討論可知，PAM質量濃度增加，水凝膠孔徑減小、孔壁增厚，從而提高了水凝膠的抗壓能力。這為神經細胞的黏附提供了良好的支撐環境。

圖中*表達p<0.01有顯著的統計學差異圖3 GelMA-PAM復合水凝膠支架不同比例濃度0～12 h溶脹率及最終溶脹率Fig.3 Swelling rate and final swelling ratios of GelMA-PAM composite hydrogel scaffolds at different proportions and concentrations from 0 to 12 h

圖中**表達p<0.01有顯著的統計學差異圖4 GelMA-PAM復合水凝膠支架不同濃度比例的孔隙率Fig.4 Porosity of GelMA-PAM composite hydrogel scaffolds with different concentration ratios

圖中***表達p<0.01有顯著的統計學差異圖5 GelMA-PAM復合水凝膠支架不同濃度比例的應力-應變曲線及楊氏模量Fig.5 Stress-strain curves and Young’s modulus of GelMA-PAM composite hydrogel scaffolds at different concentration ratios

2.5 GelMA-PAM水凝膠支架生物相容性

為了研究復合水凝膠支架的生物相容性，筆者對復合水凝膠進行了生物活性檢測。圖6為細胞的活死染色圖，綠色代表活性細胞，紅色代表死細胞。筆者發現隨著復合水凝膠中PAM濃度增加，細胞的總體數量與密度均下降。但當PAM質量濃度為2.5%時，支架的細胞活性檢測與純GelMA水凝膠差距較小，這兩組支架上的細胞分布均勻，細胞族群呈分散性分布。而GelMA-PAM(1∶0.5)和GelMA-PAM(1∶1)的支架都呈現出了雪旺細胞的聚集。通常均勻分散的細胞群有利于細胞生存功能的表達。因此，上述結果表明，適宜的PAM濃度并不會影響復合水凝膠的生物相容性，對雪旺細胞的生長行為無不良影響。

細胞的活性圖如圖7所示，這是通過測量CCK-8吸光度量化細胞的數目。通過對比發現，隨著培養時間的增加，除了PAM質量濃度10%的復合水凝膠在第5 d時細胞數量減少，其余比例水凝膠中細胞數量均增加。這一結果與細胞活性檢測結果基本一致。綜上，兩組實驗結果說明在當PAM的質量濃度為2.5%時，GelMA-PAM復合水凝膠支架生物兼容性良好，可以促進雪旺細胞的附著與生長。對GelMA-PAM復合水凝膠支架上的細胞進行了細胞骨架染色，如圖8所示，綠色熒光代表了細胞骨架形態，藍色熒光代表了細胞核的形態。由圖8可以看出，所有水凝膠支架上的細胞均有不同程度的伸展，大部分細胞的形態由圓形變成梭形，這是雪旺細胞分裂期生長的典型特征。尤其在GelMA-PAM(1∶0.25)的支架上細胞的長度伸展到平均80 μm左右，證明了該復合材料支架對雪旺細胞有很好的黏附和支撐作用。

圖6 GelMA-PAM復合水凝膠上細胞活死染色圖Fig.6 Staining of live and dead cells on GelMA-PAM composite hydrogels

細胞的免疫熒光染色如圖9所示，通過S100B特定蛋白的染色表達，反映了雪旺細胞的分化蛋白表達情況。綠色熒光代表特定蛋白在細胞中的分布情況，藍色為細胞核的位置。圖中各比例支架上的細胞均有特定分化蛋白的表達，證明了復合材料支架能夠支撐雪旺細胞的分化。對比不同比例的復合水凝膠支架， GelMA-PAM(1∶0.25)支架比其他支架的雪旺細胞輪廓清楚，蛋白染色表達清晰，說明該支架具有更好的雪旺細胞相容性。

圖7 GelMA-PAM復合水凝膠上細胞活性Fig.7 Graph of cell viability on GelMA-PAM composite hydrogels

綜上所述，GelMA與PAM比例為1∶0.25的復合水凝膠在機械性能上優于純GelMA水凝膠，同時具有良好的細胞相容性，且雪旺細胞在該支架上的增殖和分化效果良好。因此，GelMA-PAM(1∶0.25)復合水凝膠可作為支撐雪旺神經細胞存活、生長、發育的基底材料。

3 結論

通過制備不同比例的GelMA-PAM復合水凝膠支架，并對其形貌、理化特性、機械性能及體外的生物相容性、神經細胞軸突的分化情況進行了測試。結果表明當GelMA與PAM比例為1∶0.25時，復合水凝膠支架具有良好的理化性能和機械性能，同時支架上的雪旺細胞可以進行良好的生長與分化。因此，本文構建的GelMA-PAM復合水凝膠材料兼顧了支架的機械性能和生物相容性，可作為一種理想的組織工程神經構建物。

圖8 GelMA-PAM復合水凝膠上細胞骨架染色圖Fig.8 Cytoskeleton staining on GelMA-PAM composite hydrogels

圖9 GelMA-PAM復合水凝膠上細胞的免疫熒光染色圖Fig.9 Immunofluorescence staining of cells on GelMA-PAM composite hydrogels