數字PCR技術在國門生物安全保障領域的應用

王藝凱 齊 瑋 楊 詣 王占坤 王勝利 陳芊如 孔維恒 芮 孝 邱 燁 劉 鑫*

（1.中國海關科學技術研究中心，北京 100026；2.南佛羅里達大學，佛羅里達州 33620；3.新羿生物科技（北京）有限公司，北京 102299；4.清華大學醫學院生物醫學工程系，北京 100084）

1 前言

國門生物安全是人民健康、社會安定、國家利益的重要保障。當前，國門生物安全已成為我國面臨的重大安全問題和重要挑戰。隨著我國出入境人員和進出口貨物的逐年增加，海關檢驗檢疫的工作量也急劇增加。此外，對進出口食品檢驗、飼料中的動物源成分檢測，轉基因植物檢測需求也逐年增加，同時還要求檢測時間更短、檢測結果更加精準。核酸檢測以其靈敏度高、特異性好、操作簡便、時間短的特點已經被廣泛用于各種病原體的檢測和動植物來源物質的鑒別等領域，而數字PCR作為第三代PCR技術，以其靈敏度高、絕對定量、耐抑制好等特點受到生物檢測領域業內人士越來越多的關注。

“ 數字PCR ”的概念最早于1999年由霍普金斯大學的Kenneth Kinzler 與 Bert Vogelstein 明確定義，他們在論文中描述了通過分割樣品于96孔板和384孔板中進行一系列的PCR來定量檢測樣品中的Kras突變的方法[1]。數字PCR技術的核心概念是將熒光定量PCR反應體系分割為大量獨立的PCR子反應，每個子反應單元中包含或不包含1個或多個拷貝的目標核酸分子，每個子反應單元進行平行的PCR擴增，擴增結束后，對每個子反應單元的終點熒光信號進行分析。由于目標核酸分子的分散符合泊松分布，通過統計陰性和陽性子反應單元的數目和統計學方法分析就能計算出原始樣品中目標核酸分子的拷貝數[2]。數字PCR中最常見的微小反應單元形式包括液滴和微孔，其中液滴數字PCR采用基于微流控的液滴技術實現PCR反應體系的分割[3]；微孔數字PCR采用基于微納米加工技術的微孔芯片形成大量獨立的反應單元[4]。

數字PCR相較于傳統PCR技術和熒光定量PCR技術，具有絕對定量、靈敏度高、精度高、對抑制劑容忍度高的優勢。根據上述的數字PCR原理可知，此技術可以直接計算目標核酸分子的拷貝數，無需如熒光定量PCR一般依賴于對照樣品和標準曲線進行定量，因此數字PCR能夠提供更準確可靠的定量結果，理論上可以達到定量單個分子的效果。此外，由于樣品被分散在大量隔離的微反應單元中，目標模板受到背景模板的競爭和干擾減少，因此數字PCR的靈敏度更高，能夠在野生型模板的背景下檢測罕見的突變[5]。同時，大量分散也使得數字PCR對樣品中存在的抑制劑有更高的容忍度。

由此可見，數字PCR這一新興的核酸檢測技術能夠“ 滿足 ”海關檢驗檢疫精準定量的需求。本文將對數字PCR技術在國境衛生檢疫、動物病原菌檢疫、植物病原菌檢疫、動物源性成分檢測及轉基因產品檢測等方向的研究進展和應用前景進行介紹和論述。

2 數字PCR技術在國境衛生檢疫中的應用

2.1 高靈敏度新冠病毒核酸檢測

目前被廣泛用于COVID-19診斷的RT-qPCR檢測技術為疫情防控提供了很大的幫助，但其存在假陰性率高的問題[6,7]。引物和探針靶區域突變、樣本中的病毒量不足、采樣過程不規范、運輸不當和樣本中存在擴增抑制劑等多種因素都可能造成假陰性結果[8]。而數字PCR技術因其靈敏度高和耐抑制較好的特性，能夠有效的減少檢測SARS-CoV-2時出現的假陰性結果。在比較基于數字PCR和RT-qPCR的 SARSCoV-2檢測方法的最低檢測限（LoD）的研究工作中，科研人員發現數字PCR的方法具有更低的LoD和更高的靈敏度[9-11]。對比臨床樣本的陽性檢出率，部分RT-qPCR檢測為疑似或陰性的COVID-19 樣本，數字PCR都成功檢測出陽性[9,11-15]。其中，在Suo等人[9]的研究中，26例COVID-19確診患者的樣本被數字PCR成功檢 出，而這些樣本的RT-qPCR檢測結果均為陰性。此外， Falzone等人[10]的研究也顯示數字PCR對擴增抑制劑的作用較不敏感。由此說明，數字PCR在低病毒載量樣本的檢測 中具有優勢，能夠作為RTqPCR的補充。

2.2 流感病毒的定量和分型

流感病毒目前仍然是對公共衛生具有巨大威脅的呼吸道病原體[16]。通過每年注射疫苗的方法，我們可以最大程度的降低季節性流感造成的危害，而疫苗是否有效取決于對每年流感病毒的準確定型?，F在世界范圍內造成季節性流感的流感病毒主要有兩個型別，4種亞型，分別是甲流H1、甲流H3、乙流Victoria和乙流Yamagata[17]，在流感病毒感染者中有0.5%～3%的是雙重感染。熒光定量PCR法可以對甲乙流病毒進行分型，也可以對乙流病毒的兩種亞型進行區分，但還沒有用熒光定量PCR法對流感病毒的4種亞型進行同時分型檢測的報道。香港大學Leong等人開發的數字PCR流感病毒六重聯檢方法，可以在一管內同時檢測區分流感病毒的4種亞型[18]。與多管分別檢測相比，單管多重聯檢在降低試劑成本、減少樣品消耗、縮短操作時間和降低移液誤差等方面有明顯優勢。Leong等人開發的方法中另外兩重檢測是對甲乙流病毒分別進行精確定量。對流感病毒的精確定量可以方便醫生評估病情和對臨床準確預測臨床結果。而熒光定量PCR法由于對病毒定量要依賴外部標準品，對信噪比有較高的要求，造成不同實驗室的檢測結果存在較大差異，可重復性較差。

2.3 HIV感染者治療效果的評估

現在全球大約有七千萬HIV感染者，我國的HIV感染者也有逐年增加的趨勢。隨著抗病毒藥物的發展，目前的抗逆轉錄病毒療法（ART）通過抑制病毒復制可以有效地抑制HIV感染者血漿中的病毒量。很多感染者的血漿病毒血癥被抑制在目前可用的診斷方法的檢測限以下[19]。然而，即使在最佳治療的情況下，很大一部分患者仍處于低水平病毒血癥狀態[20,21]，在體內形成所謂的HIV庫。量化具有復制能力的HIV庫對評估治療策略至關重要。加州大學圣地亞哥分校的Strain等人以HIV的pol基因和2-LTR為靶點開發了一種數字PCR檢測方法[22]。經過對300多份臨床樣本的檢測分析，與qPCR相比，這個方法的檢測精度有顯著的提高，特別是病毒載量較低的樣本。實驗結果顯示pol拷貝數的變異系數平均下降了5倍，2-LTR的檢測精度提高了20倍。哈佛醫學院Henrich等人的研究得出了類似的結果[23]。比利時根特大學和根特大學醫院的Kiselinova等人以細胞相關HIV RNA為靶點，對比了數字PCR和巢式qPCR法，數字PCR在檢測病毒載量較低的樣本時有明顯的優勢[24]。在2013年對一個因母嬰傳播而感染HIV的嬰兒進行抗病毒治療時，采用了數字PCR檢測病毒載量[25]。嬰兒出生18個月后HIV檢測不到后停止了治療，嬰兒30個月大時復診仍保持HIV檢測不到，實現了對HIV感染的治愈。整個治療過程中數字PCR對HIV病毒的高靈敏檢測起了至關重要的的作用。

2.4 登革熱病毒檢測

登革熱病毒是一種通過蚊蟲傳播的病毒，每年造成約3.9億人感染。它會引起登革熱、出血性登革熱和登革休克綜合征，是所有熱帶國家和地區的一個主要的公共衛生問題[26,27]。目前，還沒有針對登革熱病毒的特效藥和疫苗[28]，對登革熱、出血性登革熱和登革熱休克綜合征只能進行對癥治療?？焖贉蚀_的確診登革熱病毒感染可以幫助醫護工作者提供有效合理的治療措施?，F有的基于免疫學的檢測方法可以快速得到檢測結果，但靈敏度有限[29,30]，qRT-PCR法雖然有較高的靈敏度，但因為需要標準曲線進行校正，而配制標準品和繪制標準曲線受人為等外界影響較大，增加了檢測結果錯誤的幾率，也造成不同實驗室間的檢測結果差別較大，無法互相參考。泰國國家科學技術發展局的Mairiang等人以登革熱病毒的保守序列為檢測靶點，開發了數字PCR登革熱病毒檢測方法，可以對4種亞型的登革熱病毒實現準確檢測[31]。相較于qPCR法，數字PCR法具有更低的檢測下限和定量下限，不同實驗室間的檢測結果的一致性也更好，為藥物和疫苗的多中心臨床實驗提供了保障。此外，利用了數字PCR絕對定量的特點，Mairiang等人還發現登革熱病人和出血性登革熱病人樣本中病毒載量有明顯差別，證實了病毒載量與病情輕重之間的關系。由于登革熱病毒有4種亞型，所以在疫苗研發的過程中要對一個樣本中的4種登革熱病毒同時定量。法國巴斯德公司的研發人員利用數字PCR適合做多重檢測的特點，開發了在一管中同時定量4種亞型的登革熱病毒的方法[32]。整個方法的檢測結果與qPCR法單獨亞型檢測具有很好的一致性，但大大降低了對工作量和樣品量的要求。

3 數字PCR技術在動物檢疫中的應用

3.1 非洲豬瘟病毒檢測

非洲豬瘟病毒（ASFV）會引起嚴重的跨界傳染病——非洲豬瘟，給養豬業造成了巨大的經濟損失。為預防和控制非洲豬瘟，一旦出現可疑癥狀，應立即停止動物和豬肉制品的流動，然后通過實驗室檢測進行診斷。鄭州大學的Jia Rui等人和四川農業大學的Wu Xulong等人分別在不同的數字PCR平臺上開發了非洲豬瘟病毒檢測方法[33,34]。相較于qPCR，數字PCR法展現了更好的可重復性和耐抑制性，其中四川農業大學開發的數字PCR方法的檢測下限達到了10拷貝/測試，檢測靈敏度是qPCR的10倍。 廣西大學的Shi Kaichuang 等人開發了一種數字PCR多重聯檢方法，可以在一管內同時檢測非洲豬瘟病毒、普通豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒。與多重qPCR相比，該方法具有更高的陽性檢出率[35]。

3.2 豬流行性腹瀉病毒檢測

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）于1971年在歐洲首次發現，傳遍歐洲后又先后傳播到了東亞和美國，這種疾病給全球養豬業造成了巨大的經濟損失。豬流行性腹瀉病毒的檢測方法包括臨床觀察，組織學觀察，中和試驗， 免疫熒光和免疫組織化學，但這些方法都耗時太長而且不適合做高通量檢測。而qPCR法因為需要建立標準曲線容易引起檢測結果的偏差。暨南大學和河北農業大學的研究人員聯合開發了一種數字PCR方法來檢測豬流行性腹瀉病毒，檢測下限達到了0.26 拷貝/微升，檢測靈敏度是qPCR法的5.7倍[36]。

3.3 偽狂犬病毒檢測

偽狂犬病病毒[PRV]是一種常見的皰疹病毒，它可以導致豬的流產、呼吸窘迫、神經系統紊亂和仔豬死亡，對中國養豬業具有重要的經濟影響[37]。傳統的偽狂犬病病毒檢測方法包括病毒的分離培養和抗體的血清學檢測，這些方法結果可靠但耗時長而且對操作的要求高[38,39]。四川農業大學的Ren, Meishen等人開發的雙重數字PCR檢測方法可以同時檢測野生型毒株和注射疫苗后產生的基因缺陷型毒株[40]，實驗結果顯示，該方法的靈敏度是qPCR法的16倍并且具有很好的可重復性和穩定性。這個雙重數字PCR偽狂犬病毒檢測方法不但可以高靈敏的檢測到偽狂犬病毒，而且可以準確評估注射疫苗后的效果，為疫苗的開發和施打策略提供參考依據。

4 數字PCR技術在植物檢疫中的應用

4.1 瓜類果斑病菌檢測

瓜類果斑病菌可以引發瓜類的細菌性果實斑點病[41]，自1987年首次在西瓜中發生細菌性果實斑點病以來，它已成為瓜類作物生產的嚴重威脅[42]。瓜類果斑病菌主要通過種子傳播[43]，因此，種子的檢測對病害管理具有重要意義。北京農林科學院的Yu Lu等人開發了基于數字PCR的檢測方法[44]，他們以培養的病菌和提取的DNA為樣本比較了數字PCR和qPCR法的檢測下限的，數字PCR法的靈敏度是qPCR的10倍。然后他們又以201份未知的西瓜和香瓜、商業種子為待測樣本，對比了兩種分子方法和平板培養法的檢出陽性樣本數，結果顯示數字PCR是平板培養法檢出陽性樣本數的2.6倍；是qPCR檢出陽性樣本數的12倍。

4.2 馬鈴薯病毒檢測

植物病毒的量化對于監測感染的進展，以及病毒在一個季節的時間內不同植物組織中的滴度變化非常有用[45]，它為流行病學研究和優化診斷抽樣提供了重要信息依據。此外，病毒量化在研究植物對病毒感染的反應中涉及的代謝途徑的基因功能方面也很重要[46]。然而，馬鈴薯病毒這類RNA病毒有較高的突變率，造成引物探針對不同序列的模板的擴增效率不同，這給病毒的核酸檢測特別是準確定量帶來了困難。數字PCR是對單個微滴中的單個模板進行擴增和終點法計數，定量結果不受擴增效率的影響?；谶@個原理，斯洛文尼亞國家生物研究所的Mehle等人開發了數字PCR馬鈴薯病毒檢測方法，他們以3種不同基因型的毒株為模板比較了數字PCR和qPCR法的檢測靈敏度[47]。結果顯示，這兩種方法對其中一種基因型毒株的檢測靈敏度接近。對于其它兩種基因型的毒株，數字PCR的檢測靈敏度都是qPCR的10倍。此外，研究者還以數字PCR定量的核酸為標準品，比較了3組qPCR的引物探針，結果證明數字PCR可以用來校準qPCR法的檢測結果。

5 數字PCR技術在動物源檢測中的應用

肉類摻假已經成為了一個世界范圍的問題，涉及食品和飼料行業，此外，皮毛、奶酪等動物制品也是摻假的高發區。它雖然不會對消費者的健康直接造成危害，但用廉價原材料進行替代或摻假，為不法食品提供了一條誘人的捷徑并且帶來了潛在的公共健康風險。因此,發展一種準確可靠的測定特定肉類成分含量的方法 在食品方面具有重大的經濟意義和深遠的社會意義。相比蛋白，脂類等其它生物物質，DNA更加穩定，即使經過加工，形態發生變化，部分樣本受損，DNA序列信息也不會改變，不會影響檢測結果；而且DNA存在于生物的任何組織部位，取樣更加方便，也具有更高的種屬特異性，這使得包括分子雜交、PCR、熒光定量PCR（qPCR）、多重PCR、數字PCR和等溫擴增等技術被廣泛應用于肉類的動物源檢測中。其中數字PCR以其精準可靠、對樣本類型適應度高、適合開發多重檢測的特點，不僅可以準確判斷動物源成分是否存在摻假還可以對摻假成分進行精確定量。

5.1 區分牛、馬和豬源成分

線粒體基因CYTB廣泛存在于所有哺乳動物細胞中并且有較高的拷貝數，因此在很多研究中被用來作為物資鑒定的靶標[48-50]。德國哥廷根大學的Floren等人在開始開發數字PCR動物源檢測方法時也選擇了CYTB基因作為靶標，但實驗結果顯示CYTB基因在不同組織（脂肪和肌肉）之間至少有5倍的差異，不適合用來作為動物源檢測和定量的靶標。因此，他們選擇以核基因F2為靶點的開發了數字PCR動物檢測方法，以小牛肝香腸、肉制品、冷凍肉為樣本檢測了靈敏度。結果顯示，這個方法區分牛、馬和豬源成分的定量下限達到了0.01%，檢測下限達到了0.001%[51]。

5.2 開發檢測鴨源成分標準品

因為鴨肉的價格相對較低，經常被不法商販摻入或者直接當作其它肉類銷售。市場上非常需要靈敏可靠的檢測產品。浙江省農科院和中國農科院的研究人員以interleukin 2基因為靶點，在數字PCR平臺上開發了檢測鴨源成分的標準品[52]。在標準品的開發過程中，8個獨立的診斷實驗室通過數字PCR對這些鴨子的基因組標準物進行了檢驗和認證，結果具有很好的一致性，確認IL2基因的平均拷貝數為5.78±0.51×103拷貝/μL。同質性和穩定性測試表明，在-20℃存儲和冷鏈交付條件下，標準品在至少6個月內是均勻和穩定的。這個標準品可作為肉制品中鴨含量分析方法的驗證和性能測試的必要工具。這個研究也為其他動物源性參考物質的開發提供了技術基礎。數字PCR絕對定量、重復性好的特點發揮了至關重要的作用。

5.3 羊肉中雞源成分的檢測

大量的研究用qPCR法來定量動物源成分[53-56]。然而，利用實時PCR的Ct值計算的拷貝數會受到擴增效率和DNA溶液中雜質的影響。與實際拷貝數的差異會導致不同物種重量比例的量化有較大偏差。中國農業大學和中國檢驗檢疫科學研究院的研究人員在數字PCR平臺上開發了雞源成分的檢測方法，并檢驗了該方法在羊肉樣本中檢測雞源成分的靈敏度、精確性和穩定性[57]。結果顯示，該方法的定量下限為1%，檢測下限為0.1%。與qPCR相比，在雞源成分比例5% ～ 80%范圍內的偏差降低9%。此外，雞肉的部位對定量的準確性沒有影響，而且在不同的壓力和溫度條件下，可以保持較高的精確度。

6 數字PCR在轉基因產品檢測中的應用

農作物轉基因技術在提高糧食產量、提高農作物抗性、改善農產品品質等方面發揮了巨大的作用，但同時也引起了生物安全和消費者安全的擔心。目前qPCR被用來檢測轉基因植物并展現了較好的靈敏度和特異性。然而，當轉基因靶點核酸在樣品中占比較小時，擴增檢測會被大量非靶點核酸干擾，對轉基因靶點的量化會受產生嚴重的偏差。另一個重要的限制是qPCR對從復雜基質中核酸提取物中抑制劑的高敏感性。數字PCR因為是把單個核酸模板隔離后進行擴增檢測，從而避免了其它非靶點核酸的干擾，同時也大大降低了核酸提取物中抑制劑對反應的干擾。因此，人們對在數字PCR平臺上進行轉基因植物檢測進行了充分的研究和開發。轉基因植物產品的數字PCR 檢測方法也被寫入了我國海關的行業標準。

6.1 雙重數字PCR定量轉基因克螟稻

中國農業科學院的Li Jun等人，以水稻中的單拷貝基因磷脂酶D基因為參考開發了檢測克螟稻的雙重數字PCR方法[58]。該方法的檢測下限達到了9拷貝，定量下限達到了34拷貝。研究者還對比了qPCR和單重數字PCR法，雖然三種方法都能在規定的范圍內檢出轉基因物質并給出合格的轉基因拷貝數，但雙重數字PCR法的不確定區間最窄，精準度最好。

6.2 轉基因玉米的絕對定量

各個國家判定農產品是否為轉基因產品的標準基本都以所轉的基因與內源性基因之間的拷貝數比為評判標準，因此需要一種靈敏度高并且可以精確定量的檢測方法給出評判的參考。qPCR法目前被用于轉基因生物的定量，但它在檢測低拷貝DNA靶點方面的局限性導致人們去開發新的檢測方法。歐洲標準局的Corbisier等人建立了一種數字PCR檢測MON810基因和內源性高遷移群蛋白A基因的方法[59]，數字PCR測定的絕對拷貝數之比和使用了質粒DNA校準的qPCR測定的絕對拷貝數之比相同。與qPCR法相比，數字PCR不需要質粒DNA進行校準，具有更好的可重復性，更適合用來檢測所轉的基因與內源性基因之間的拷貝數比。

7 總結和展望

數字PCR基于“ 模板有限稀釋 ”和“ PCR反應體系離散獨立擴增 ”的技術原理，為海關檢驗檢疫提供了一種能夠絕對定量且靈敏度、精度、特異性、抗干擾性更佳的核酸檢測技術。綜上所述，數字PCR技術的使用能夠進一步提高國境衛生檢疫、動物病原菌檢疫、植物病原菌檢疫、動物源性成分檢測及轉基因產品檢測等方向的結果的準確性與可靠性。

雖然數字PCR已被證實相比于傳統核酸檢測技術具有更多的優勢，但距離其真正廣泛應用于海關檢驗檢疫，還有以下挑戰需要克服（1）由于樣本量大及檢驗人員人數有限，海關對于操作的簡便性與技術自動化程度有一定要求，目前商用的數字PCR系統的自動化程度還需進一步提高；（2）數字PCR的儀器和耗材成本較傳統的PCR檢測技術高，因此制約了其進一步的使用，需要通過量產及原材料成本控制等手段來進一步降低使用成本；（3）由于海關檢驗檢疫的項目較多，這就要求數字PCR企業開發更多元的檢測試劑盒來滿足海關檢測各個項目的需求。

目前已有多家國內數字PCR企業投入研發自動化的一體機，相信隨著穩定、高性能、低成本的數字PCR系統的面市，能夠進一步推動數字PCR技術在海關系統的應用，提供更快速、準確的檢測結果。