基于類器官培養的艱難梭菌毒素B損傷結腸上皮機制的初步研究

呂 婷， 王 莉， 趙 冰， 黃海輝

艱 難 梭 菌（Clostridioides difficile） 是 革 蘭陽性厭氧產芽孢桿菌， 25%～33%的抗生素相關性腹瀉以及90%的偽膜性腸炎都由艱難梭菌所致，此類感染統稱為艱難梭菌感染（Clostridioides difficileinfection， CDI）[1]。目前認為艱難梭菌主要通過分泌毒素而引發感染，其中艱難梭菌毒素B（Clostridioides difficiletoxins B，TcdB）在致病過程中占據主要地位，體外機制研究主要在細胞模型如Caco2細胞、NCM 460細胞中進行[2-3]。類器官是體內的多能干細胞在體外培養形成的三維細胞集合，模擬體內器官的空間結構和功能。腸道類器官模型比傳統的體外細胞模型具有明顯優勢，模擬了腸道的復雜細胞結構特性，提供了在體外系統中探索宿主與病原體相互作用的獨特平臺。盡管結腸類器官模型取得了很大進展，并且已經使用這種類器官系統開展了結腸癌發病機制及藥敏方面的研究，但用于CDI研究較為少見[4]。本研究擬通過構建小鼠結腸類器官模型，對艱難梭菌毒素損傷結腸上皮的致病機制進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料來源 實驗動物為6～8周雄性野生型C57BL/6 SPF級小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。表達重組TcdB（recombinant TcdB，rTcdB）的巨大芽孢桿菌菌株由美國馬里蘭大學馮漢平教授惠贈。

1.1.2 主要儀器與試劑 乙二胺四乙酸（EDTA）（美國ThermoFisher Scientific公司）、基質膠（美國corning公司）、總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]、GoScriptTM試劑盒（美國Promega公司）、SYBR Green qPCR Master Mix（美國Bimake公司）。

3D類器官培養組分：Advanced DMEM/F12、penicillin/streptomycin、glutamax、N2 supplement和 B27 supplement均購自美國Gibco公司，N-acetylcysteine 和Nicotinamide 均購自美國Sigma-Aldrich公司，A83-01、 Rho kinase （ROCK）inhibitor （Y-27632））和前列腺素E2（PGE2）均購自美國MedChemExpress公司，重組 Wnt 3a 蛋白 、重組 R-Spodin 1 蛋白和重組 Noggin 蛋白均購自中國德州奧格銳生生物科技有限公司，表皮生長因子重組蛋白（EGF）（美國ThermoFisher Scientific 公司），Primocin（美國 Invivogen 公司）。

rTcdB表達用試劑：LB培養基（胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、5 mg/L四環素，均購自上海生工公司）；木糖（上海生工公司）；HisTrap HP柱（美國General Electric Company公司）；透析卡（美國ThermoFisher Scientific公司）；100 kDa超濾管（美國Millipore公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 鼠結腸類器官培養體系 在Miyoshi等[5]建立的培養體系上略作修改，將N2 supplement（1×）、B27 supplement（ 1×）、glutamax（1×）、penicillin/streptomycin（1×）、N-Acetylcysteine（1.25 mmol/L）、EGF（50 μg/L）、Noggin（100 μg/L）、Wnt-3a（50 μg/L）、R-Spodin-1（1 mg/L）、A83-01（1 μmol/L）、Y-27632（10 μmol/L）、PGE2（10 nmol/L）、Nicotinamide（10 mmol/L）、Primocin（ 100 mg/L）加至1L Advanced DMEM/F12中，混勻后經0.22 μm除菌濾器過濾后備用。

1.2.2 小鼠結腸上皮隱窩分離和培養 頸椎脫臼處死C57BL/6小鼠，75%乙醇噴灑消毒，“Y”字剪開腹腔將回盲部后的6～8 cm的結腸腸段取出；剪開并刮除結腸黏膜面的糞便和黏液；清洗鼠結腸組織5～10 min至洗滌液澄清，用剪刀剪成大約2～3 mm的腸塊，置于5 mmol/L EDTA溶液中，4℃消化35 min。將結腸組織碎片置于含有5 mL DPBS的15 mL離心管中，劇烈搖晃，用基質膠重懸，鋪至48孔細胞板中，37℃10～30 min后加入鼠結腸類器官培養體系，37℃、5% CO2細胞培養箱培養，每2～3 d換新的培養體系，連續培養5～7 d，觀察、拍照并記錄倒置顯微鏡下類器官生長情況。

1.2.3 鼠結腸類器官傳代和培養 棄去原培養體系，用1 mL槍頭將基質膠吹打成碎片，1 400 r/min離心2 min，取沉淀加入含2 mmol/L EDTA的DPBS混勻再1 200 r/min離心5 min，沉淀即為類器官; 用基質膠重懸類器官沉淀后，垂直接種于48孔培養板中，待膠凝固后加入新培養體系培養。

1.2.4 rTcdB制備 將表達rTcdB的巨大芽孢桿菌接種于LB培養基中，經木糖誘導12～14 h后超聲破菌，獲得的菌體裂解液經HisTrap HP柱純化；純化后得到的蛋白使用透析卡磁力攪拌過夜，透析卡中的蛋白用100 kDa超濾管超濾濃縮，得到高純度的蛋白。

1.2.5 建立TcdB損傷結腸類器官模型 取穩定傳代培養的結腸類器官接種于48孔板，設置rTcdB的濃度為：5 pmol/L、10 pmol/L，每個濃度設置3個復孔，然后分別加入含上述rTcdB濃度梯度的鼠結腸類器官培養液，以不含rTcdB處理的結腸類器官作陰性對照，置于37°C、5 %CO2培養箱中培養。12 h、24 h后在倒置顯微鏡下觀察類器官的生長情況。

1.2.6 采用總RNA提取試劑盒 提取對照組和損傷組RNA，提取產物的D260/D280比值1.8～2.0； 采用反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA；以編碼磷酸甘油醛脫氫酶的GAPDH 基因作為內參基因（GAPDH 正向引物序列為5'-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3'， 反 向 引 物 序列 為 5'- CCTGCTTCACCACCTTCTTGAT-3'），Lgr5基因正向引物序列為5'- CGGGACCTTGAAGATTTCCT-3'，反向引物序列為5'-AGCAGGCCGTTCACAACATC-3'，Axin2基因正向引物序列為5'-GCTCCAGAAGATCACAAAGAGC-3’， 反 向引物序列為5'-AGCTTTGAGCCTTCAGCATC-3'，Bmi1基因正向引物序列為5'-AAATCCCCACTTAATGTGTGTCC-3'，反向引物序列為5'-CTTGCTGGTCTCCAAGTAACG-3'。

取稀釋后的反轉錄產物1 μL，采用 SYBR Green 試劑盒對cDNA進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR），引物序列同上。qRT-PCR 體系包括 SYBR?Premix Ex Taq（2×）5 μL、cDNA 1 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、去離子水3 μL，條件為95 ℃預變性 3 min，95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 34 s（40個循環）、72℃ 30 s。重復3次取平均值。采用 2-ΔΔCt法計算上述基因相對表達量。

1.2.7 類器官RNA-seq測序和生物信息學分析 選取對照組和rTcdB 5 pmol/L處理12 h后的艱難梭菌毒素損傷組的類器官樣本，提取RNA后將樣本送至北京貝瑞公司進行RNA-seq測序。edgeR軟件篩選差異基因，DAVID網站進行基因本體論（Gene Ontology， GO） 和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG） 通路富集分析，對篩選出的差異基因導入到STRING數據庫（https：//stringdb.org/）中進行蛋白互作網絡（Protein Protein Interaction Network， PPI）分析，將得出的結果導入Cytoscape（3.9.1）得到可視化網絡，分別利用Cytoscape中的MCODE和CytoHubba插件對網絡進行拓撲分析，篩選關鍵基因（Hub gene），MCODE算法取得分最高的集合，CytoHubba中我們采用最常用的MCC算法，取前10位的基因集合，兩種算法的集合作為最終Hub gene的選擇。

1.3 統計學分析

樣品基因表達量采用t檢驗分析，P值＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原代鼠結腸3D類器官構建成功及可穩定傳代培養

小鼠C57BL/6的結腸隱窩包埋在基質膠培養，第0天為長條形，次日可形成單層細胞球結構，在連續 7 d的培養過程中隱窩逐漸閉合，體積逐漸增大，形成圓球狀的復雜立體結構，鼠結腸類器官體外構建成功[5-6]。構建的類器官可連續增殖傳代10代（圖1）。

圖1 鼠結腸類器官構建和傳代Figure 1 The construction and passage of mice colon organoid

2.2 TcdB損傷結腸類器官模型

借鑒Tao等[6]、Saavedra等[7]的實驗方案，100 pmol/L rTcdB加入到結腸類器官中，導致類器官全部死亡，后采用5 pmol/L和10 pmol/L rTcdB分別處理結腸類器官24 h和48 h，結果發現二者在作用24 h時均可使類器官生長緩慢及部分死亡，10 pmol/L rTcdB 作用48 h時類器官死亡最為明顯，此系列濃度的選擇也與Alonso等[8]發表的人結腸內TcdB毒素濃度相近（圖2）?？紤]到rTcdB為5 pmol/L時即可損傷類器官，為此我們選擇5 pmol/L為后續實驗濃度，并將作用時間設置為12 h和24 h，結果顯示相較于對照組，損傷組類器官體積相對較小，狀態相對較差，作用12 h類器官狀態好于24 h（圖2）。同時收取類器官樣本檢測數個代表性的干性基因表達情況，結果顯示損傷組Lgr5、Axin2、Bmi1表達顯著上調（圖3）。為了進一步研究TcdB作用機制，我們選取5 pmol/L rTcdB組和對照組作用12 h時的樣本進行RNA-seq分析。

圖2 rTcdB （5 pmol/L、10 pmol/L）損傷鼠結腸類器官12 h、24 h、48 hFigure 2 Injury of mice colon organoids after addition of rTcdB （5 pmol/L， 10 pmol/L） for 12 h， 24 h， and 48 h

圖3 rTcdB （5 pmol/L）感染鼠結腸類器官12 h和24 h基因表達Figure 3 Relative expression of genes in mice colon organoids after being infected by rTcdB （5 pmol/L） for 12 h and 24 h

2.3 差異基因表達水平分析

根據樣本基因表達水平不同，篩選出損傷組和對照組之間的差異表達基因，以|log2Fold Change|＞1，P＜0.05為篩選條件，共篩選出差異基因3 140個，與對照組相比，損傷組表達上調基因有1 936個，下調基因有1 204個，使用火山圖展示差異基因的分布情況（圖4A）。

2.4 差異基因的GO分析

根據差異基因的結果，利用GO富集分析對轉錄組數據進行功能注釋，GO分析結果表明，在生物過程（biological progress， BP）中富集了244個功能，在細胞組成（cellular component， CC）中富集了54個功能，分子功能（molecular function，MF）中富集了72個功能。其中損傷組上調基因主要涉及的BP通路有低氧應答、跨膜轉運和上皮細胞分化等，圖4B列出了BP、CC和MF的前10個富集通路。損傷組下調基因涉及的BP通路包括細胞增殖正向調控、免疫系統過程、對γ干擾素的細胞應答、對β干擾素的細胞應答和細胞遷移的正向調節等（圖4C）。

圖4 差異基因的火山圖和GO分析Figure 4 Volcano plot and GO analysis of differentially expressed genes

2.5 差異基因的KEGG分析

KEGG分析結果表明，共有47條通路顯著富集，其中損傷組上調基因涉及通路主要與視黃醇代謝、膽汁分泌、花生四烯酸代謝和ABC轉運體等相關（圖5A）；損傷組下調基因涉及通路主要包括Wnt信號通路、細胞黏附模塊、腫瘤壞死因子信號通路和轉化生長因子-β信號通路等（圖5B）。其中，細胞黏附模塊中CLDN1和CLDN10為黏膜屏障的代表性基因，二者表達在損傷組中均顯著下調。

圖5 差異基因的KEGG分析Figure 5 KEGG analysis of differentially expressed genes

2.6 差異基因編碼蛋白質的PPI分析

蛋白之間通常通過相互作用結合成復合物行使相應的功能，具有相互作用的差異基因通常具有相似的功能。采用Cytoscape的MCODE和CytoHubba（MCC算法）分別篩選出重要基因作圖，結果見圖6。二者模塊的基因集取交集得到的基因作為關鍵基因，分別編碼IFI44、IFIT3、IFIT1、RTP4、CXCL10、GBP3、GBP2、RSAD2 和 IFI47的基因，關鍵基因的表達在損傷組中均為下調。其中IFIT3、IFIT1、GBP3和GBP2與α/β干擾素、γ干擾素的細胞應答相關。

圖6 關鍵基因Figure 6 Hub genes

3 討論

本研究運用結腸類器官構建了TcdB損傷結腸上皮的模型，TcdB可以導致結腸類器官生長緩慢及死亡，多個代表性干性基因（stemness-related genes）表達發生顯著改變。并利用RNA-seq技術從整體水平上研究正常結腸類器官組和損傷組的基因轉錄水平，結果顯示正常結腸類器官組和損傷組之間存在著多種差異基因的上調和下調，涉及多種細胞信號和生物學過程。

GO富集分析發現，兩組在多個通路中均富集了大量的差異基因，說明TcdB對結腸類器官的作用是多條途徑相互作用的結果。上調基因富集通路有低氧應答，與以往臨床報道CDI導致腸道內缺氧、低灌注相符[9]。下調基因富集的通路有對β、γ干擾素的細胞應答。同時，PPI分析中得到的9個關鍵基因，其中的Ifit3、Ifit1、Gbp3和Gbp2參與了α/β干擾素以及γ干擾素等信號通路的調節，在TcdB對結腸上皮細胞的作用中起到了關鍵作用。除了細菌因素外，宿主免疫反應也是CDI嚴重程度的關鍵因素[10]，目前對干擾素研究主要集中在γ干擾素上，Abt等[11]報道了γ干擾素在小鼠CDI中具有保護作用，McDermott等[12]隨后報道了γ干擾素是通過獨立于炎性細胞因子表達和粒細胞募集的機制在艱難梭菌結腸炎中起保護作用，但其詳細機制仍未完全闡明。近期Hamo等[13]通過測定CDI患者血清樣本細胞因子和趨化因子的濃度，首次報道了α干擾素與嚴重CDI密切相關。本研究同樣發現除了γ干擾素外，α/β干擾素也參與了艱難梭菌的致病過程，且與α/β干擾素相關的基因在整個致病過程中低表達，這為后續探索艱難梭菌致病機制提供了新方向。

在KEGG通路分析中特別引起注意的是花生四烯酸代謝通路相關基因表達上調。有文獻報道，TcdB通過上調磷脂酶A2（Phospholipase A2）的表達，促進14-碳-花生四烯酸的表達[14-15]。雖然目前研究者僅報道了TcdA對腸道的損傷可能由內源性大麻素花生四烯酸乙醇胺介導[16]，但鑒于TcdA和TcdB結構上一定相似性，TcdB對上皮的損傷也可能與花生四烯酸相關。在下調基因涉及的通路富集中，Wnt通路和細胞黏附模塊中富集的基因表達明顯。Tao等[6]提出TcdB與結腸上皮細胞的Wnt信號通路受體Frizzleds結合起作用，Wnt信號通路的減弱直接損害結腸上皮細胞的增殖，另外，細胞黏附模塊中的CLDN1和CLDN10為黏膜屏障的代表性基因，其在損傷組中的表達較對照組顯著下調，研究顯示TcdB會破壞腸道緊密連接，導致黏膜屏障受損[17]。

綜上所述，本研究通過構建TcdB感染鼠結腸類器官模型，篩選出了與感染密切相關的通路，發現TcdB可能通過調節干性基因表達，增強低氧應答通路，減弱α/β干擾素、γ干擾素的細胞應答通路，調節花生四烯酸代謝通路和Wnt信號通路來介導毒素損傷結腸上皮細胞。為深入探究艱難梭菌致病機制提供了新思路。后期將針對差異基因的篩選結果驗證后開展進一步研究，探討艱難梭菌毒素損傷結腸上皮細胞的機制。