2017—2019年山東省臨床分離流感嗜血桿菌的耐藥性監測

孫彥蒙， 王夢園， 李 政， 王世富， 周衛萍， 李仁哲， 陳艷萍， 劉志偉， 孫淑紅，李艷華， 李宜雷， 李 艷， 滿思金0， 李 靜， 寇琳娜， 于文文， 張春艷

流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）是一種只侵犯人類的革蘭陰性桿菌，可引起成人和兒童社區獲得性肺炎、鼻竇炎和化膿性中耳炎等[1-2]，成人感染主要以下呼吸道為主，也可見菌血癥等全身癥狀，老年人則以流感后繼發感染居多（如氣管炎、肺炎等）；流感嗜血桿菌作為兒童時期細菌性腦膜炎、肺炎和菌血癥的主要細菌性病原體，還可導致化膿性關節炎和眼內炎等[3-4]。在世界范圍內，β型流感嗜血桿菌感染每年導致近40萬兒童死亡，其中95%以上的死亡發生在發展中國家，15%～35%的β型流感嗜血桿菌腦膜炎患兒可有智力低下、聽力喪失等嚴重后遺癥[5]。本研究對山東省50所醫院臨床分離流感嗜血桿菌進行了耐藥性監測，旨在了解流感嗜血桿菌感染隨年齡和季節變化的特點，監測其對常用針對性抗菌藥物的敏感率和耐藥率，為臨床有效診治提供數據支持，同時指導臨床醫師對藥物的合理應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 本研究依托于山東省兒童細菌&真菌耐藥監測研究協作網（SPARSS網），SPARSS網由山東省50所成員單位構成，其中三級醫院44所、二級醫院6所，涵蓋了山東省16個地市，監測數據具有區域代表性。收集2017年1月1日—2019年12月31日上述醫院分離的流感嗜血桿菌，剔除同一患者的重復菌株，共獲得18 057株。

1.1.2 實驗材料 流感嗜血桿菌菌株分離、鑒定和藥敏試驗，由各成員單位按照各實驗室質量控制標準進行嚴格的質量控制，頭孢硝噻吩試劑購自重慶龐通等公司，藥敏紙片氨芐西林（10 μg）、氨芐西林-舒巴坦（10-10 μg）、頭孢呋辛（30 μg）、頭孢他啶（30 μg）、美羅培南（10 μg）、亞胺培南（10 μg）、左氧氟沙星（5 μg）、阿奇霉素（15 μg）、甲氧芐啶-磺胺甲唑（25 μg）、氯霉素（30 μg）購自OXOID等公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離、培養與鑒定 樣本合格判定標準：痰液，低倍鏡下觀察每視野鱗狀上皮細胞＜10個；氣管灌洗液，鏡檢鱗狀上皮細胞1%總細胞數；所有樣本留取后均在2 h以內送檢，及時接種于流感嗜血桿菌選擇性培養基，5%的CO2孵箱中35℃培養18～24 h。自培養基挑取無色、透明、表面光滑、邊緣整齊、似露滴狀、濕潤可疑菌落，由Bruker質譜或細菌鑒定儀進行菌株鑒定。

1.2.2 藥敏試驗 采用紙片擴散法（K-B）進行流感嗜血桿菌10種藥物敏感性試驗，結果判讀依照CLSI 2021版M100抗微生物藥物敏感性試驗執行標準進行。以頭孢硝噻吩紙片檢測β內酰胺酶，10 min內變紅為陽性。質控菌株為流感嗜血桿菌ATCC 49247和 ATCC 49766。

1.2.3 統計學分析 采用WHONET 5.6和SPSS l5.0軟件進行數據處理和統計分析。

2 結果

2.1 菌株的來源與分布

2.1.1 樣本來源分布 2017—2019年SPARSS網分別分離到4 056株、6 211株和7 790株流感嗜血桿菌，共計18 057株納入統計分析，分離自兒童（＜18歲）和成人（≥18歲）的菌株分別為12 344株和5 713株，占比分別為68.4%和31.6%，分離自6歲以下兒童占總菌數的65.2%。菌株樣本分布：呼吸道樣本占96.1%（17 351/18 057），其中痰液標本16 523株，咽拭子543株，肺泡灌洗液285株；非呼吸道標本占3.9%（706/18 057），其中外陰分泌物占25.4%（179/706），此外耳分泌物111株、血液53株、膿液39株、腦脊液（CSF）9株、其他樣本315株。同時將患者分為學齡前兒童（0～6歲）、學齡期兒童（＞6～12歲）、青少年（＞12～＜18歲）和成年人（≥18歲）4個年齡段人群，并以此對臨床分離菌的樣本構成進行了分析，見表1。2017—2019年每年分離于痰樣本的流感嗜血桿菌分別占當年分離的流感嗜血桿菌總數的88.8%、91.5%、92.9%，呈增長趨勢；分離于咽拭子為5.2%、3.7%、1.3%，呈逐年降低趨勢；分離于肺泡灌洗液為1.7%、1.7%、1.4%；分離于外陰分泌物為1.2%、0.9%、1.0%；分離于血液為0.2%、0.4%、0.3%。

表1 2017—2019年不同年齡段臨床分離流感嗜血桿菌的標本構成Table 1 The sample source of H. influenzae strains in terms of age group from 2017 to 2019 （%）

2.1.2 兒童患者的年齡分布 2017—2019年臨床分離流感嗜血桿菌的兒童年齡以＞6月齡～3歲居多，其次是＞1～6月齡，再次為＞3～6歲（圖1）。嬰幼兒期（＞1月齡～3歲）為流感嗜血桿菌感染的高發階段，學齡前期兒童（＞3～6歲）亦是不可忽視的流感嗜血桿菌感染的高發人群。

圖1 2017—2019年兒童12 344株臨床分離流感嗜血桿菌的年齡分布Figure 1 Age distribution of 12 344 strains of H. influenzae isolated from children from 2017 to 2019

2.1.3 流感嗜血桿菌分離的月份分布 每年的2、4、5和12月份流感嗜血桿菌的分離率較高，7～10月份分離率較低（圖2）。流感嗜血桿菌感染具有一定的季節性，冬春季高發而夏秋季感染較少。

圖2 2017—2019 18 057株兒童和成人臨床分離流感嗜血桿菌的季節性分布Figure 2 Seasonal distribution of 18 057 strains of H. influenzae isolated from children and adults from 2017 to 2019

2.2 β內酰胺酶檢測

根據β內酰胺酶的檢測結果，2017—2019年產β內酰胺酶的流感嗜血桿菌占比分別為63.0%、72.1%、76.6%，呈逐年上升趨勢；β內酰胺酶陰性氨芐西林耐藥的流感嗜血桿菌（BLNAR）的三年檢出率分別為9.7%（241/2 473）、7.9%（237/3 000）和7.3%（328/4 518），均值為8.1%（806/9 991）。見表 2。

表2 2017—2019年18 057株臨床分離流感嗜血桿菌的β內酰胺酶檢測陽性率及變遷Table 2 Changing prevalence of β-lactamase-producing strains in 18 057 clinical isolates of H. influenzae from 2017 to 2019

2.3 藥敏試驗

這三年，山東地區分離的流感嗜血桿菌對氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢呋辛耐藥率均呈逐年上升趨勢；對頭孢他啶保持較高的敏感率，三年分別是95.6%、93.4%和95.3%，均值為94.8%；對美羅培南、左氧氟沙星、氯霉素的耐藥率有所下降。見表3。

表3 2017—2019流感嗜血桿菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 3 Susceptibility of H. influenza isolates to antimicrobial agents from 2017 to 2019 （%）

2.4 兒童分離株藥敏試驗

兒童患者分離的流感嗜血桿菌對氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢呋辛、阿奇霉素、甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率明顯高于新生兒和成人的分離株。見表4。

表4 2017—2019年兒童患者流感嗜血桿菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 4 Susceptibility of the H. influenza strains isolated from children to various antimicrobial agents from 2017 to 2019 （%）

表4（續）Table 4（continued）

3 討論

流感嗜血桿菌是人體鼻咽部的共生菌，可黏附并定植于呼吸道上皮細胞且具有遷移到宿主其他生態位的能力[5]。據北京兒童醫院臨床研究報道，急性下呼吸道感染兒童患者2000—2002年及2010—2012年的流感嗜血桿菌攜帶率分別為26.1%和16.3%[6]，而高攜帶率是易發生該菌感染的前提。與之一致，本研究分離的流感嗜血桿菌，主要來自人體呼吸道樣本，且該菌感染多見于6歲以下的兒童，這與該年齡段幼兒免疫系統尚未發育完全，對攜帶的流感嗜血桿菌抵抗力弱，較易在呼吸道病毒感染后繼發流感嗜血桿菌感染有關。本文監測數據結果顯示，山東省流感嗜血桿菌的感染以冬春季高發、夏秋季低發，這與大多數報道一致[7-8]，可能與北方地區冬春季節交替、天氣寒冷，人體易感風寒致使呼吸道感染疾病整體高發有關。

本研究呼吸道樣本以痰液居多，其次為咽拭子、肺泡灌洗液樣本，其中兒童肺泡灌洗液的樣本占比低于成人。除呼吸道樣本之外，外陰分泌物（占25.4%）是非呼吸道樣本的主要類型，且兒童患者樣本占比高于成人。兒童外陰炎最常見的病原體為化膿鏈球菌和流感嗜血桿菌，真菌和病毒少見[9]，而化膿鏈球菌引發的外陰感染常伴口咽炎及皮疹等癥狀，未伴有其他部位癥狀的兒童外陰炎則多由流感嗜血桿菌引起。我國珠三角地區和聊城地區由流感嗜血桿菌所致的小兒細菌性外陰炎占比分別為24.9%和31.49%[10-11]，鑒于兒童與成人陰道炎病原體構成的迥異，流感嗜血桿菌所致的兒童外陰炎病的精準診斷和抗生素合理應用值得臨床醫師重視。

早年文獻報道流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥的主要機制是由質粒攜帶tem和rob基因編碼的TEM及ROB型β內酰胺酶，并以TEM型為主[12-13]。自2000年至2012年，由于產β內酰胺酶的流感嗜血桿菌檢出率逐年增加，我國兒童分離的流感嗜血桿菌對氨芐西林的敏感率由96%下降至61%[6]，且近年來耐藥率呈逐年持續上升趨勢。據2017—2019年的CHINET耐藥監測網報告，流感嗜血桿菌對氨芐西林的耐藥率呈現逐年增加的趨勢；且兒童和成人的耐藥率差異顯著，其中2019年的數據顯示兒童的耐藥率（70.2%）明顯高于成人（59.7%）[14-16]。本組資料顯示山東省兒童流感嗜血桿菌對氨芐西林的耐藥率亦遠高于成人，兒童和成人菌株對氨芐西林的耐藥率均呈逐年遞增趨勢，且耐藥率遠高于全國平均水平[7-8,12-14,17]。此外，近年來關于由ftsI基因編碼的轉肽酶導致青霉素結合蛋白PBP3的構象變化從而導致其與β內酰胺類抗生素親和力降低的報道日漸見多[18]。這種非產酶機制所致的氨芐西林耐藥菌被稱之為BLNAR。本組資料同樣顯示具有BLNAR現象的菌株三年間的平均檢出率為8.1%，與ISPED通過對13 810株流感嗜血桿菌監測報告的8.22% BLNAR檢出率相近[19]，但近年來日本流行（＞40%）的β內酰胺酶陰性的高水平氨芐西林耐藥流感嗜血桿菌（high-BLNAR）[20]，是否有向國內播散的趨勢，值得進一步監測。

本組監測資料顯示山東省臨床分離流感嗜血桿菌的一個重要特征是耐藥率顯著高于同期全國及其他地區的報道。如本組流感嗜血桿菌對氨芐西林、頭孢呋辛、甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率及對阿奇霉素的不敏感率逐年上升，同期兒童分離株的耐藥率顯著高于成人株，這與CHINET報道的結果一致[14-16]。CHINET報道的2017—2019年流感嗜血桿菌對氨芐西林的耐藥率和阿奇霉素的非敏感率亦呈現出逐年增加的趨勢，且其中兒童菌株對氨芐西林的耐藥率亦高于成人菌株的耐藥率。山東地區流感嗜血桿菌對上述4種抗菌藥物的耐藥率均顯著高于全國同期水平，且兒童流感嗜血桿菌的耐藥率遠高于成人[14-16]。推測可能是由于兒童較成人易發生呼吸道感染，本地區使用上述4種抗菌藥物進行經驗治療的頻率較高，使定植于上呼吸道的流感嗜血桿菌在抗菌藥物的選擇壓力下，不斷被選擇篩選出耐藥菌株，因此亟需加強抗菌藥物在醫療機構的合理使用。

本組資料顯示，第三代頭孢菌素（頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶）對流感嗜血桿菌一直保持著較高的抗菌活性，細菌對其一直保持著較高的敏感性。此外，流感嗜血桿菌對美羅培南、左氧氟沙星、氯霉素的耐藥率也均在10%以下，且在2017—2019年無顯著變化趨勢。許多僅涉及單一醫院或地區的報道顯示流感嗜血桿菌對美羅培南和頭孢曲松全敏感[7-8]，而全國性的綜合報道顯示流感嗜血桿菌對美羅培南和頭孢曲松不敏感率分別為2%和8%[16]，這種差異表明不同地區間流感嗜血桿菌的耐藥性存在著較大差異，中國東部和西部兒童醫院美羅培南的非敏感率分別為0.13%和1.89%[19]。盡管流感嗜血桿菌對左氧氟沙星和氯霉素顯示較高的敏感性，但由于兒童對其的不良反應較大，因此在用于兒童流感嗜血桿菌感染的治療時需謹慎。此外，碳青霉烯類藥物同樣不推薦作為治療的首選藥物，以避免誘導菌株產生耐藥性，除非有危及生命的侵襲性流感嗜血桿菌感染或頭孢菌素類藥物治療失敗的患者[21]。2019年的《兒童流感嗜血桿菌感染診斷及治療專家建議》中指出，發生流感嗜血桿菌的一般感染時宜選用第三代頭孢菌素[22]。本組資料顯示的流感嗜血桿菌對抗菌藥物的耐藥率和非敏感率與2019年的《兒童流感嗜血桿菌感染診斷及治療專家建議》一致[22]。

綜上所述，目前山東省流感嗜血桿菌的耐藥形勢比全國更加嚴峻，尤其是在兒童流感嗜血桿菌感染患者中，產β內酰胺酶的菌株檢出率極高，氨芐西林已不能作為臨床一線用藥，因此，十分必要對流感嗜血桿菌的耐藥性進行持續監測和宣講，從而指導臨床合理使用抗菌藥物，以減緩耐藥流感嗜血桿菌的快速增長。

致謝：感謝50所山東省微生物組學研究中心兒童細菌&真菌耐藥監測研究協作網成員單位為本文提供的數據支持。