超導體包被免疫熒光試紙法同時測定玉米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮適用性研究

單曉雪，馬 志，唐顏蘋，楊穎康，顧雨熹，王 錦，陳晉瑩?

（1. 中儲糧成都儲藏研究院有限公司，四川 成都 610000；2. 深圳市賽泰諾生物科技有限公司，廣東 深圳 518108）

真菌毒素是真菌在食品或飼料中滋生所產生的次級代謝產物，是農產品的主要污染物之一[1-2]，可導致急、慢性中毒，嚴重時會危及人類和動物的生命安全[3-4]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)又稱嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮（ZEN）是最常見的真菌毒素之一，在全世界的谷物及其副產品污染廣泛，主要存在于小麥、玉米和大麥等谷物之中[5-6]。玉米是世界上最重要的食糧之一，同時也是動物飼料必不可少的主要原料[7-8]。據研究發現，我國飼料用玉米及原料中這兩種毒素檢出率較高，在抽調樣品中檢出率常在 80%以上[9-11]。故研究建立同時檢測DON和ZEN的快速、穩定、科學的定量分析方法，對于糧食類食品中 DON、ZEN的暴露和風險評估與控制具有重要意義。

真菌毒素快速檢測在糧食倉儲、基礎生產等大量應用，大多以免疫層析法為主要檢測方法，現有的免疫層析法由于單抗的應用，一張試紙只能針對一種真菌毒素實現快檢應用，成本較高且效率較低。多毒素試紙條一般價格較高或在其中一種毒素的檢出限較高，毒素含量低時，檢測結果不穩定。在此基礎上，我們研發了高特異性免疫識別真菌毒素快檢試紙條如圖1，在發光物與抗體構建偶聯過程中，利用超導體材料進行半包被，超導體有極高的導電特性，將發光物與抗體間靜電荷聚集在抗體側向吸附，電荷對抗體中雜質及蛋白酶產生邊緣控制吸附效應，從而提高單抗或者多抗的純度，增加抗體穩定度，同時突破性改變免疫法對溫度的耐受，實現了真菌毒素檢測耗材常溫儲存及運輸轉變，避免了低溫儲存等苛刻條件帶來的檢測準確度下降及數值偏差的風險。方便在田間地頭或倉儲糧庫現場應用。在提高檢測精準度、平行性的同時，大大的提高了便利性；超導體包被免疫熒光試紙法可實現玉米中DON、ZEN的快速、定量檢測，在真菌毒素監測和各環節監管中可以快速、高效、準確的反饋數據，為各方決策、導向提供了強有力的理論依據與技術支撐。

圖1 超導體包被免疫熒光試紙條Fig.1 The superconductor coated immunofluorescence test strips

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究選取的是天然收獲玉米。

嘔吐毒素快速定量檢測卡（2～30 ℃密封儲存）：深圳市賽泰諾生物技術有限公司；嘔吐毒素免疫親和柱、玉米赤霉烯酮毒素免疫親和柱：美國 ROMER公司；低濃度嘔吐毒素玉米質控品（472±80 μg/kg）、中濃度嘔吐毒素玉米質控品（990±130 μg/kg）、高濃度嘔吐毒素玉米質控品（1 845±277 μg/kg）、低濃度玉米赤霉烯酮毒素玉米質控品（46.5±6.3 μg/kg）、中濃度玉米赤霉烯酮毒素玉米質控品（70.0±11 μg/kg）、高濃度玉米赤霉烯酮毒素玉米質控品（108.6±18.8 μg/kg）：青島普瑞邦生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

QD-Infinity系列霉菌毒素快速定量免疫熒光分析儀：深圳市賽泰諾生物技術有限公司；1260Ⅱ高效液相色譜儀，配DAD和FLD檢測器：美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 超導體包被免疫熒光試紙法

取玉米待測樣品500 g，經粉碎（研磨）機進行充分粉碎，過20目篩混勻樣品，稱取樣品5 g于50 mL離心管中，加入55%甲醇溶液25 mL，混勻，渦旋震蕩5 min，選擇5 000 r/min離心2 min，收集上層甲醇提取液，移取提取液100 μL與ST緩沖液400 μL振蕩混勻，從中移取75 μL待檢液垂直滴入毒素檢測卡的加樣孔中，靜置反應10 min后，檢測卡經QD—Infinity快速免疫熒光分析儀檢測分析。

1.3.2 超導體包被免疫熒光的制備

配置質控線C、檢測線DON、ZEN的劃線液，C劃線液為0.7 L的0.4 mg/mL兔抗體加上3. 5μL的10%海藻糖和30.8 L的PBS緩沖液的混合液；DON劃線液為2.33 μL的0.8 mg/mL抗DON抗體與32.67 μL PBS的混合液；ZEN劃線液為2.33 μL的0.8 mg/mL抗ZEN抗體與32.67 μL PBS的混合液。再將硝酸纖維素膜貼到 PVC快檢試紙條上，再將貼有PVC板的硝酸纖維素膜放至金標劃膜儀上標記的指定位置，啟動劃線至貼有PVC板的硝酸纖維素膜上，完成 C-DON劃線環節。然后再ZEN劃線，完成后在37 ℃烘箱中烘干12 h，待用。

分別將0.44 μL 18.18 mg/mL羊抗兔抗體、11.11 mg/mL抗DON抗體、抗9.09 mg/mL抗ZEN抗體用0.1 mol/L碳酸鉀調整pH為7.4按3∶1∶1進行配置，再放入配置好的金顆粒于旋轉盤上旋轉混勻15 min。將BSA封閉劑按每1 mL加100 μL的量加入標記好的金顆粒中渦旋15 min。再放至冷凍離心機中離心 4 ℃，5 min。取上清液，棄沉淀；再4 ℃離心20 min，棄去上清液，取沉淀物復溶，用復溶液按每標記1 mL復溶100 μL的量進行復溶?；旌蠘擞浐玫膹腿芙痤w粒，羊抗兔抗體、抗ZEN抗體、抗DON抗體混合金顆粒按1∶1∶1進行混合后，取金標墊放到金標儀標記好的指定位置，用磁鐵壓住，以4.5 μL/cm進行噴金。完成后在37 ℃烘箱中烘干12 h。

1.3.3 免疫親和柱液相色譜法

按照國標GB 5009.111—2016《食品安全國家標準食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》[12]第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法進行試樣提取、凈化、上機。

按照國標 GB 5009.209—2016《食品安全國家標準 食品中玉米赤霉烯酮的測定》[13]第一法液相色譜法進行試樣提取、凈化、上機。

1.4 數據分析

各組實驗重復3次，采用SPSS18.0進行統計分析，Origin 9.0軟件進行作圖處理，P＜0.05為在統計學上顯著性差異，結果以x±s來表示。

2 結果與分析

2.1 最低檢出限和最低定量限

超導體包被免疫熒光試紙法檢出限與定量限的確定是用連續獨立測定20份空白樣（天然的陰性玉米樣本），分別按照 IUPAC推薦的公式s+3× b、s+ 10× b計算檢出限與定量限[14]，式中：s為20份空白樣品檢測值的平均值；b為標準偏差，數據分布見圖2、表1和表2。

圖2 超導體包被免疫熒光試紙法檢測20份玉米空白樣品的DON和ZEN的數據分布圖Fig.2 DON and ZEN data distribution of 20 blank maize samples detected by superconductor coated immunofluorescence test strip method

表1 超導體包被免疫熒光試紙法和液相色譜法測DON的最低檢出限和定量限對比數據Table 1 Superconductor coated immunofluorescence test strip method and HPLC method for the measurement of DON’s LOD and LOQ data

表2 超導體包被免疫熒光試紙法和液相色譜法測ZEN的最低檢出限和定量限對比數據Table 2 Superconductor coated immunofluorescence test strip method and HPLC method for the measurement of EZN’s LOD and LOQ data

由圖2中數據可知超導體包被免疫熒光試紙法檢測20份玉米空白樣品中DON的測定值幅度在 14.1～45.8 μg/kg范圍內，ZEN的測定幅度在0～5.6 μg/kg范圍內，DON和ZEN的測定平均值分別是30.6 μg/kg和1.1 μg/kg，標準偏差分別為7.96%和1.38%。由表1和表2，可以看出超導體包被免疫熒光試紙法 DON、ZEN雙聯檢測中DON檢出限和定量限上是低于國家標準液相色譜法的規定，ZEN檢出限和定量限略高于國家標準液相色譜法的規定。說明超導體包被免疫熒光試紙法在稱取樣品量減少，檢測時間大大縮短的情況下，檢測限量水平同液相色譜法相近。

2.2 準確性測定

用超導體包被免疫熒光試紙法快速定量檢測系統在相同實驗條件下，使用不同檢測卡檢測同一樣品，分別測定3個毒素含量梯度的玉米質控樣，每個樣品平行檢測3次，結果見表3和表4。

表3 超導體包被免疫熒光試紙法檢測玉米質控樣的DON含量Table 3 Determination of DON content in maize quality control samples by superconductor coated immunofluorescence test strip method

表4 超導體包被免疫熒光試紙法檢測玉米質控樣的ZEN含量Table 4 Determination of ZEN content in maize quality control samples by superconductor coated immunofluorescence test strip method

檢測結果均與質控樣的理論值符合率達100%，質控樣品的嘔吐毒素含量重復測定的變異系數范圍在1.00%～6.70%之間，玉米赤霉烯酮含量重復測定的變異系數范圍在4.87%～6.47%之間，嘔吐毒素平均變異系數為 3.70%，玉米赤霉烯酮含量重復測定的平均變異系數為 5.69%，檢測的準確度符合實驗要求。

2.3 回收率和方法精密度

在陰性玉米樣品中添加DON標準品和ZEN標準品制成三個含量梯度的樣品，樣品中DON理論含量分別為 500 μg/kg、1 000 μg/kg、2 000 μg/kg、ZEN 理論含量分別為50 μg/kg、100 μg/kg、150 μg/kg，進行回收率和精密度測定，每個梯度測定6次，數據分布見圖3。

圖3 超導體包被免疫熒光試紙法檢測加標玉米樣品DON和ZEN的回收率分布圖Fig.3 Recovery distribution of DON and ZEN in spiked maize samples detected by superconductor coated immunofluorescence test strip method

取6次結果的平均值得三個含量梯度的玉米樣品中DON加標回收率分別為107.45%、108.17%、103.72%，相對偏差分別為7.45%、8.17%、3.72%，ZEN加標回收率分別為 97.81%、111.27%、109.68%，相對偏差分別為2.19%、11.27%、9.68%，符合國標定量檢測標準要求。由圖2箱形圖可以看出，DON和ZEN回收率檢測結果波動范圍在20%以內，回收率范圍均在 80%～120%以內，符合加標回收要求。DON在三個含量梯度的檢測數據較 ZEN檢測數據要更集中。ZEN在檢測低含量樣品，理論含量為50 μg/kg時，檢測數據較分散，回收率檢測結果 81.72%～111.03%，在檢測理論含量為150 μg/kg時，檢測數據較集中，總體上DON和ZEN方法精密度，符合國標定量檢測標準要求。

2.4 與液相色譜法比較測定

將 30份玉米樣品同時用液相色譜法和超導體包被免疫熒光試紙法檢測DON和ZEN，并對結果數據進行比較，由于快檢卡數據 DON檢測結果低于100 μg/kg，ZEN檢測結果低于5 μg/kg的無法讀出，故不做統計，其他檢測數據比較見圖4。

圖4 液相色譜法和超導體包被免疫熒光試紙法檢測玉米樣品中DON和ZEN數據對比及相對偏差圖Fig.4 Comparison and relative deviation of DON and ZEN data in maize samples detected by HPLC method and superconductor coated immunofluorescence test strip method

由圖4可知在測定的30組數據中，去除儀器無法讀數的數據，液相色譜法和超導體包被免疫熒光試紙法檢測DON和ZEN的結果符合率達到100%。2種方法的DON檢測結果的相對偏差在–0.37%～9.04%之間，ZEN的相對偏差在–4.99%～6.54%之間，說明超導體包被免疫熒光試紙法的檢測數據與液相色譜法的檢測數據相一致，方法間偏差較小，精密度將近，結果可靠，符合國家標準偏差要求。

4 討論與結論

本研究表明超導體包被免疫熒光試紙法能夠同時快速定量檢測玉米中DON和ZEN兩種毒素的檢測方法，測定法準確、可靠。本方法與國家標準液相色譜法相比，具有快速、靈敏、方便、科學、檢測成本低的特點，與單聯快檢法相比，具有省時、節約成本、同時呈現2個毒素指標的特點?？梢栽跐M足農產品及其制品中真菌毒素快速檢測需求。此外，本方法為內置標準曲線，不需要在實驗中制作標準曲線，減少人為檢測誤差，保持每臺儀器的穩定性。試紙條和試劑耗材在2～30 ℃儲存的技術優勢，便于在各種溫度條件的運輸和使用，可用于不同檢測環境如田間調查，市場抽查等。隨著現代檢測技術迅猛發展，人們對食品、飼料安全日益重視，快速篩查、實時監控是檢測發展的趨勢，超導體包被免疫熒光試紙法同時快速定量檢測玉米中DON和ZEN兩種毒素的檢測方法具有現實意義。