枸櫞酸托法替尼脂質體的制備與初步評價

錢洋偉，舒 幻，方宇鐿，沈奇英

(杭州師范大學藥學院，浙江 杭州 311121)

0 引言

類風濕性關節炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種全身性的自身免疫性疾病，具有病因不明、持續反復發作的特點[1-3]，嚴重影響患者的運動和生活質量.RA高發于30～50歲，全球發病率為1%，我國發病率約3%～5%[4-5].目前臨床上治療RA以藥物治療為主，在降低全身及局部炎癥水平、緩解癥狀、延緩疾病進展等方面取得了一定效果，但仍有患者無應答，或因發生不良反應而不能應用[6].

枸櫞酸托法替尼(tofacitinib citrate，TOF)適用于中至重度的活動性RA患者[7].目前TOF的上市劑型為片劑，缺乏病變部位的特異性靶向作用，導致用藥后往往出現胃腸道反應、上呼吸道感染等不良反應，因而有必要改變其劑型以彌補以上缺點.脂質體制備方法簡單，生物相容性好.因此，我們將TOF制成脂質體，一方面解決了TOF口服帶來的不良反應，另一方面提高了TOF靶向RA病變部位的能力，有利于RA的藥物靶向治療.

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料

枸櫞酸托法替尼(上海博氏醫藥科技有限公司)，磷脂(Lipoid GMBH)，膽固醇(國藥集團化學試劑有限公司)，DMEM高糖培養液(杭州啟真湖生物科技有限公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，弗氏完全佐劑(Sigma)，噻唑藍溴化四唑(阿拉丁).

1.2 實驗儀器

旋轉蒸發儀(RE-52AA，上海亞容生化儀器廠)，Anton paar litesizer 500型Zeta電位粒徑分析儀(奧地利安東帕中國有限公司)，全自動酶標儀(Biotek Instruments，美國伯騰儀器有限公司北京代表處)，透射電子顯微鏡TEM (JEM2100,日本電子株式會社)，高效液相色譜儀(High Performance Liquid Chromatography，HPLC).

2 TOF脂質體的工藝研究與評價

2.1 TOF脂質體的工藝研究

HPLC色譜條件：色譜柱為Technologies, Diamonsil(鉆石) C18(200 mm × 4.6 mm,5μm)柱；流動相為乙腈-水(體積比為30∶70)；流速為1.0 mL/min，檢測波長為285 nm；柱溫為25 ℃；進樣量為20 μL.

選用pH梯度法制備載藥脂質體.首先采用薄膜分散法制備空白脂質體，在茄形瓶中放置一定比例的卵磷脂和膽固醇，加入適量無水乙醇溶解，經旋蒸形成薄膜，加入pH3.5檸檬酸-檸檬酸鹽緩沖液水化，冰浴下探頭超聲20 min(600 W，工作3 s/間隔3 s)，得到空白脂質體.然后用Na2CO3溶液調至一定pH后加入TOF溶液，于60 ℃水浴中孵育10 min，得到TOF脂質體(TOFL).

在單因素的基礎下，探究藥脂比、膜材比、外水相pH對TOFL的包封率的影響，采用HPLC法測定藥物峰面積，從而篩選優勢處方.包封率與載藥量計算公式如下：

其中A超濾前：超濾前超濾管內管液體的峰面積；A超濾后：超濾后濾下的液體的峰面積.

2.2 TOF脂質體的評價

2.2.1 粒徑分布及其電位、電鏡

按優勢處方制備TOFL，使用電位粒徑分析儀測定其粒徑、多分散性指數和Zeta電位；取少量脂質體滴于覆有碳膜的銅網上，濾紙吸干后，再用醋酸雙氧鈾負染30 s，自然晾干后于透射電鏡下觀察其形貌特征.

2.2.2 體外釋放

根據優勢處方制備TOFL，采用透析袋法評價該脂質體的體外釋藥性能.釋放條件：釋放介質pH7.4 和pH5.5的磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)，溫度(37±0.5) ℃，速度100 r/min.在預定時間取樣，取樣量為1 mL，每次取樣后補充等量新鮮釋放介質，樣品離心后取上清進樣,采用HPLC法測定，并記錄峰面積(A)，計算實際濃度(C)，計算累計釋放百分率.

2.2.3 細胞活性評價

巨噬細胞(RAW264.7)培養在含有體積分數10%的胎牛血清的DMEM培養基中(含青霉素、鏈霉素質量濃度各為0.1 mg/mL)，孵育條件為37 ℃,體積分數為5% CO2.

采用四甲基偶氮唑藍(Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT)法檢測細胞活性[8].將對數生長期的RAW264.7細胞以5 000每孔的密度接種于96孔板上，孵育過夜貼壁，不同濃度空白脂質體處理48 h后，于各孔內加入質量濃度為5 mg/mL的MTT 33 μL并放置于培養箱內繼續培養4 h后倒出孔內液體，每孔內分別加入200 μL 二甲亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)，采用酶標儀在570 nm處測量各孔吸光度，并計算細胞存活率.

2.2.4 RA部位初步靶向性考察

為了較直觀地觀察脂質體在RA小鼠關節部位的分布情況，選用整體器官熒光成像方法進行評價.以ICR小鼠為實驗對象，將0.1 mL弗氏完全佐劑皮下注射至小鼠右后爪中，構建類風濕關節炎小鼠模型[9].以近紅外熒光染料吲哚菁綠(Indocyanine green, ICG)替代TOF制備脂質體，設立游離ICG和ICG脂質體組，經尾靜脈注射6 h后處死(ICG劑量為1 mg/kg)，收集其關節，比較不同制劑給藥后關節處的熒光強度.

2.2.5 小鼠體內初步藥效學評價

將15只RA小鼠隨機分成3組，每組5只，設立PBS組、游離TOF組、TOFL組，經小鼠尾靜脈注射給藥(TOF劑量為1.8mg/kg)，每2天給藥1次，連續給藥7次，并以正常組為對照.治療結束后，采用游標卡尺測量各組后爪足掌的厚度，評估其腫脹程度，以初步評價治療效果.

3 結果

3.1 膜材比對包封率的影響

圖1 膜材比對包封率的影響Fig.1 The effect of membrane material ratio on EE

膜材比(卵磷脂∶膽固醇)對包封率影響如圖1所示，由圖可知，當膜材比為1∶1和2∶1時包封率相對較高，達到50%以上，膜材比為2∶1時的載藥量比1∶1時高，且膜材比1∶1時旋蒸成膜后極難振蕩脫落，細胞粉碎機超聲脂質體幾乎沒有乳光，且外觀形態較差，所以選擇卵磷脂∶膽固醇比為2∶1作為最優膜材比.

3.2 外水相pH對包封率的影響

外水相對包封率的影響結果見圖2，由圖可看出，在外水相pH為8時有較高包封率達到75.78%.所以選擇外水相pH為8作為最優外水相pH.

圖2 外水相pH對托法替尼脂質體包封率的影響Fig.2 The effect of exterior pH on EE of TOFL

圖3 藥脂比對包封率的影響Fig.3 The effect of drug to lipid ratio on EE

3.3 藥脂比對包封率的影響

藥脂比對包封率影響結果如圖3所示，可見在TOF∶SPC比例為4∶100時有較高包封率達到88.40%，所以選擇藥脂比為4∶100作為最優藥脂比.

綜上所述，我們得出的最優條件為：脂質體的內水相為檸檬酸-檸檬酸鈉水溶液(pH3.5)時,藥物與磷脂的質量比為4∶100，膽固醇與磷脂質量比為1∶2，外水相用Na2CO3最終調至pH8.0.

3.4 粒徑分布電位、電鏡

脂質體粒徑分布圖及透射電子顯微鏡下的結果見圖4.由粒徑分布圖(圖4A)可知，TOF脂質體的平均粒徑56 nm，多分散指數20.1%，說明脂質體粒徑分布均勻.由透射電鏡圖4B可見TOF脂質體粒徑50 nm左右，外觀接近球形，分布較為均勻，與粒徑分布結果相吻合.

圖4 托法替尼脂質體的粒徑分布圖(A)及電鏡圖(B)Fig.4 (A) The size distribution and (B) TEM of TOFL

3.5 體外釋放

TOF的累積釋放百分率如圖5所示，由實驗結果可知，托法替尼在pH5.5PBS中釋放速度較快，可見TOF脂質體更傾向于在較低pH值下釋藥.TOF脂質體在生理條件下顯示出一定的緩釋效果，有利于其在體循環中保持相對穩定，靶向至弱酸性的RA部位再釋藥.

圖5 托法替尼脂質體在pH7.4和pH5.5磷酸鹽緩沖液中的累積釋放百分率Fig.5 Cumulative percentage of TOFL released in PBS pH7.4 and pH5.5

圖6 不同濃度空白脂質體對RAW264.7細胞作用48 h后的細胞活性Fig.6 Cell activity of RAW264.7 treated with different concentrations of blank liposomes for 48 h

3.6 細胞活性評價

MTT實驗結果如圖6所示，由結果可知，空白脂質體在質量濃度不超過500 μg/mL條件下，細胞活性接近90%，說明空白脂質體對細胞活性基本無影響，毒性小，有利于利用其來載藥.

3.7 RA部位初步靶向性考察

圖7 RA小鼠分別注射游離吲哚菁綠、吲哚菁綠脂質體6 h離體關節熒光分布圖片Fig.7 Fluorescence distribution of isolated joints of RA mice 6 h after injection of ICG or ICGL

采用整體器官熒光成像方法初步考察游離ICG(Free ICG)和ICG脂質體(ICGL)在RA部位的靶向分布，實驗結果如圖7所示，在給藥6 h時，與Free ICG比較，ICGL組小鼠RA關節部位的熒光信號更強，說明經脂質體載藥后可以增加藥物在RA部位的富集，有利于RA的藥物靶向治療.

3.8 小鼠體內初步藥效學評價

治療結束后，各組小鼠足掌厚度情況如圖8所示.由圖8可知，與正常組相比，PBS模型組的足掌厚度顯著增加；與PBS模型組相比，經Free TOF和TOFL治療后小鼠的足掌厚度有不同程度減少，尤其是TOFL組的減少程度更明顯.這可能是TOFL被動靶向至RA部位后，在炎性關節部位釋放TOF實現其靶向治療，因此顯示出比Free TOF更好的緩解足掌腫脹的效果.

圖8 治療結束后各組小鼠的足掌厚度(**P<0.01,*P<0.05)Fig.8 Paw thickness of mice in each group after treatment

4 討論

RA引起關節腫脹、多關節受累、關節畸形以及關節周圍和全身的骨質疏松等病狀，嚴重影響患者生活質量和運動能力.RA發病機制較為復雜，世界衛生組織將RA列為疑難癥之一.目前臨床上RA治療的藥物有改變病情藥、糖皮質激素和非甾體抗炎藥，主要用于控制RA的進展[10].與傳統抗RA藥物相比，TOF不僅能夠緩解癥狀，還能緩解或直接停止RA的損害.但是，口服TOF治療RA的患者大多出現胃腸道反應，易引起上呼吸道感染等不良反應，因而有必要改變其劑型以彌補以上缺點.基于納米技術和醫學交叉研究的納米醫學近年來迅猛發展，為重大疾病的診療提供了新的機遇[11].研究表明，納米微粒在類風濕性關節炎的診斷、預防及治療等方面具有一定優勢[12].類風濕關節炎發生部位具有類似腫瘤血管的EPR效應，且血管新生伴隨著RA的整個病程[12-13].這些病理特征為納米微粒系統被動靶向RA病變部位提供了可能性.用于藥物遞送的納米載體種類繁多，其中脂質體是納米制劑中一種常用載體，自萊門等人[14]在1971年開始將脂質體用作藥物載體以來，該載體系統得到了廣泛的研究與應用.

實驗采用pH梯度法制備TOF脂質體，并采用單因素法篩選出TOF脂質體的優勢處方.體外釋放實驗表明，TOF脂質體在pH7.4 PBS釋放介質中具有一定的緩釋作用，有利于將藥物遞送至RA部位再釋放藥物.細胞活性實驗可看出，空白脂質體在實驗濃度范圍內對細胞活性幾乎沒有影響，有利于作為載體進行給藥.由整體器官熒光成像結果可知，ICG脂質體組小鼠RA部位的熒光信號顯著強于游離ICG組，說明脂質體可以增加藥物在RA部位的富集.初步藥效研究表明，與Free TOF相比，TOFL減少足掌厚度的能力更強，可能是TOFL具有靶向治療RA的作用，因此顯示出更好的抗RA效果.綜上所述，優勢處方制得的TOFL能較好減輕RA小鼠的足掌腫脹程度.