響應面法優化洋蔥中多酚的提取工藝研究

曹 穎，張子毓，戴楊帆，田霖丹，朱 芹，許明峰

(杭州師范大學生命與環境科學學院，浙江 杭州 311121)

洋蔥(AlliumcepaL.)是食藥兩用的蔥屬植物,風味獨特,含有豐富的營養成分和生理活性物質,被譽為“蔬菜皇后”[1-3].洋蔥在我國栽培范圍廣,產量高,既可作為鮮食食用，也可作為調味料使用[4-5].近年來,隨著人們保健意識的提高,人們對具有增強免疫能力等功能的植物食品需求大大增加[6]，其中洋蔥的研究也相對比較熱門.科學研究者們對洋蔥的總黃酮[7]等生理活性物質展開研究,明確了洋蔥具有抗氧化、降血糖血脂血壓、預防心血管疾病[8-9]等多種功效.此外，洋蔥提取液也具有清除亞硝酸鹽等作用[10].

植物多酚，是一類廣泛存在于植物中的酚羥基結構化合物,有許多功效，如抗氧化抗衰老、抗菌抗病毒、降血壓、降血脂等[11-12],因此在食品等領域都有廣泛的應用前景，其中也包括作為天然抗氧化劑進行應用[13].因此，選用洋蔥為多酚的提取原料，通過響應面[14]設計選定最佳工藝，提高多酚的提取量.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

洋蔥：市售；

沒食子酸：生工生物工程股份有限公司；福林酚試劑、無水乙醇、Na2CO3：國藥集團化學試劑有限公司.上述采用分析純級別.

1.2 儀器與設備

FA3204B分析天平：上海精科天美科學儀器有限公司；DK-S26 電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；722E 可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；EYEL4 型真空冷凍干燥機：上海愛朗儀器有限公司.

1.3 方法

1.3.1 乙醇萃取洋蔥多酚的工藝流程

洋蔥鮮果→迅速凍結→真空冷凍干燥→粉碎過篩→乙醇浸提→抽濾→濾液→乙醇定容→洋蔥多酚提取液.

1.3.2 福林酚比色法沒食子酸溶液標準曲線的制作

以沒食子酸為對照溶液，用福林-酚法測定多酚含量.分別取0,0.2 ,0.4,0.6,0.8,1.0，1.2 mL沒食子酸標準液于7支試管中，加入1.5 mL福林酚試劑，搖勻，靜置5 min，加入3 mL 10%Na2CO3，搖勻.加蒸餾水定容至10 mL,40 ℃避光反應1 h，在760 nm波長處測定吸光度值[15].

1.4 洋蔥總多酚得率的計算

取上述洋蔥提取液樣品1.5 mL， 如上方法測量吸光度值.依照所制標準曲線計算樣品多酚含量，進而計算洋蔥多酚得率：

洋蔥多酚得率(%)=(C×V×N)/M×100%[16].

式中：C為根據吸光度值計算出的洋蔥多酚溶液質量濃度，V為洋蔥多酚溶液體積，N為洋蔥多酚溶液稀釋倍數，M為洋蔥原料干質量.

1.5 工藝優化試驗說明

1.5.1 不同液料比對洋蔥多酚得率的影響

在浸提時間60 min、 浸提溫度60 ℃、乙醇濃度60%[17]的條件下，設計液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1對洋蔥多酚的得率進行單因素實驗.

1.5.2 不同浸提溫度對洋蔥多酚得率的影響

在浸提時間60 min、液料比30∶1、乙醇濃度60%的條件下，設計浸提溫度40、50、60、70、80 ℃對洋蔥總多酚的得率進行單因素實驗.

1.5.3 不同浸提時間對洋蔥多酚得率的影響

在液料比30∶1、浸提溫度60 ℃、乙醇濃度60%的條件下，設計浸提時間30、45、60、75、90 min對洋蔥多酚的得率進行單因素實驗.

1.5.4 洋蔥多酚提取的響應面試驗

以單因素試驗為基礎，對不同的浸提溫度、浸提時間、液料比進行響應面優化試驗[18]，用軟件分析后得到最佳的洋蔥多酚提取工藝， 共17個處理組.響應面試驗設計見表1.

表1 Box-Benhnken試驗設計因素與水平Tab.1 Box-Behnken test design factors and levels因素 水平-101溫度/℃ A506070時間/min B456075 液料比 C203045

圖1 不同液料比對洋蔥多酚得率的影響Fig.1 Effect of different liquid ratio on yield rate of polyphenol from onions

2 結果與分析

2.1 不同液料比對洋蔥多酚得率的影響

根據圖1分析可知，在只改變料液比、不改變其他條件的實驗中，隨著液料比的增大，洋蔥多酚的得率先較快上升而后略微下降.在10∶1到20∶1之間，得率呈較快上升趨勢，在20∶1～30∶1之間，得率緩慢上升，在30∶1～50∶1之間，得率呈現下降的趨勢.料液比的重要性對于多酚的提取毋庸置疑，如果提取劑過少，則原料中的多酚就很難充分提取出來，導致提取效率的降低；如果液體與原料的比例過大，則會增加不必要的生產成本，削弱了其生產價值.因此可知，料液比處于20∶1～40∶1范圍可獲得較高提取率.

2.2 不同浸提溫度對洋蔥多酚得率的影響

圖2 不同浸提溫度對洋蔥多酚得率的影響Fig.2 Effect of different extraction temperature polyphenol yield rate from onions

圖3 不同浸提時間對洋蔥多酚得率的影響Fig. 3 Effect of different extraction on time on polyphenol yield rate from onions

由圖2分析得，只改變溫度不改變其他條件的實驗中，當浸提溫度在40 ℃～60 ℃內時，洋蔥多酚得率隨著實驗溫度上升而提高，在60 ℃時洋蔥多酚得率達到最高值 .猜測這是由于分子運動速率由于實驗浸提溫度升高而加快，這樣能幫助提出細胞中多酚類化合物.但當溫度上升到60 ℃～80 ℃時，洋蔥多酚得率轉而下降，猜測當溫度超過60 ℃后，發生了一些導致多酚含量下降的化學反應.由此單因素試驗的數據得出的結論是：提取洋蔥多酚效率高的浸提溫度為50～70 ℃，最佳提取溫度在60 ℃附近.

2.3 不同浸提時間對洋蔥多酚得率的影響

根據圖3分析可知，在控制其他條件不變時，隨著浸提時間的增加，在30～45 min的過程中，洋蔥多酚類化合物得率上漲速度較快，在45～60 min范圍中，總多酚的得率仍然上漲，但上漲速度趨于緩慢，而當浸提時間繼續增加，在60～90 min的范圍內，洋蔥多酚得率出現緩慢下降的趨勢.猜測隨著提取時間的增加，多酚產生降解或其他化學反應[19]，檢測含量由此出現下降趨勢.由此試驗初步推斷較為合適的浸提時間在45～75 min之間，最優浸提時間也出現在45～75 min內.

2.4 響應面試驗測定結果

以洋蔥多酚得率(Y)為響應值，以浸提溫度(A)、浸提時間(B)和液料比(C)為自變量.表2為響應面法優化試驗設計方案及結果.

表2 響應面法優化試驗設計方案及結果Tab.2 Response surface methodology optimization test design and results

表3 響應面回歸模型的方差分析結果Tab.3 Response variance analysis results of the regression model

2.5 雙因素對洋蔥多酚提取量的影響

根據回歸模型做出的交互作用響應面見圖4～圖6.浸提時間和浸提溫度交互作用對多酚提取量的影響見圖4.

由圖4可知，控制溫度不變時，隨著浸提時間增加，洋蔥多酚得率先上升而后慢速降低；同樣，當浸提時間固定時，隨著溫度的升高，洋蔥多酚得率出現前期增高而后緩慢下降的變化趨勢.

浸提時間和液料比交互作用對洋蔥多酚得率影響見圖5.

由圖5可知，當固定提取時間時，隨著液料比增大，洋蔥總多酚得率先上升，之后緩慢下降；同樣，當液料比固定時，隨著浸提時間增長，洋蔥多酚得率也先上升而后下降.

浸提溫度和液料比交互作用對洋蔥多酚得率的影響見圖6.

由圖6可知，洋蔥多酚得率受浸提溫度和液料比的交互作用影響不顯著，從圖中可以看出響應面較為平緩.當浸提溫度不變時，隨著液料比增大，洋蔥多酚得率上升，在到達一定高度后又出現了緩慢下降的趨勢；同樣，當不改變液料比時，隨著溫度上升，洋蔥多酚得率先增高，經過最大值后下跌.

以上3個響應面圖均能直觀體現出3個因素中的2個因素對響應值的影響 .分析計算后的實驗數據表明，洋蔥總多酚的最佳工藝提取條件為浸提時間64.2 min，浸提溫度58.5 ℃，液料比為31.8∶1.多酚得率理論預測值為26.482 3 mg/g.

2.6 預測及驗證實驗結論

以本次實驗中通過響應面法分析得出的最佳工藝條件處理，進行洋蔥多酚的醇提實驗，以驗證所得出的最佳工藝條件結果是否具有可靠性.實驗中考量到各因素條件的實際情況，為了增強可操作性，將最佳條件進行修改.以液料比31.8∶1、浸提溫度58.5 ℃和浸提時間64 min的條件重復進行3次實驗.最后洋蔥多酚得率為26.45 mg/g，與上述響應面法所分析的理論預測值差距較小，驗證了使用響應面法優化洋蔥多酚提取工藝參數的可靠性.

3 結論

本研究在得到溫度、時間、料液比的單因素實驗的數據之后，應用響應曲面設計軟件建立了浸提時間、浸提溫度和液料比的3因素3水平試驗，通過對結果的分析得出乙醇提取洋蔥總多酚的最優條件：浸提時間64.2 min，浸提溫度58.5 ℃，液料比31.8∶1.經過后續平行實驗驗證可知，最佳條件中洋蔥總多酚的得率達26.45 mg/g.