土壤濕度對番茄青枯病侵染進程和光合特性及根系生長的影響

袁澤南,周 潔,李甜竹,杜 越,張俊威,李建明

(西北農林科技大學 園藝學院,陜西 楊凌 712100)

番茄青枯病是由青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的爆發性病害，是世界上危害最大、分布最廣，造成損失最嚴重的植物病害之一。青枯勞爾氏菌是一種革蘭氏陰性細菌，可侵染50多個科的200多種植物，其中茄科作物番茄、辣椒和煙草等受害最為嚴重[1]。青枯病一旦發生，對植株就是毀滅性的危害[2]。目前關于青枯病的研究主要集中在抗病品種選育、生防菌選育、土壤消毒、化學藥劑研發和土壤微生物互作等方面[3]，我國已經篩選出多種防治青枯病的方法，但仍存在許多瓶頸，任何一種防治手段都無法保證百分之百的防效，這也說明番茄青枯病防治在世界范圍內的重要性[4]。

關于環境因子對青枯病發生的影響，前人已經進行了一些研究，發現空氣溫度、濕度、降水和日照時數等都會影響青枯病的發生[5]；烤煙青枯病發生流行最適溫度在30～35 ℃，相對濕度90%以上[6]。劉憲臣[7]研究發現，接種后第5天在30和35 ℃以下，土壤濕度80%室內煙草青枯病發病率高于土壤濕度40%，但隨著時間延長，發病率逐漸趨于一致。當土壤中病原菌數量為106.82CFU/g、土壤溫度為30.55 ℃、相對濕度為81.42%以上時，煙草青枯病的病情指數最高為91.13%[8]?？梢姖穸仁怯绊懬嗫莶“l生的一個關鍵因素，當溫度基本滿足青枯病發生的需求時，濕度就成為起決定性作用的氣候因子，適宜的土壤溫度和濕度有利于青枯菌在田間存活[9]，但國內外關于土壤濕度對番茄青枯病發生影響的研究報道較少。

青枯菌通過寄主根的機械損傷部位侵染寄主植物的根，在無機械損傷時，側根是青枯菌繁殖和侵入的優先位點[10-11]，青枯菌的傳染是從根部向頂部逐漸擴散的[12]。感染青枯菌后，致病菌株侵染原生木質部導管降解細胞壁，約25%的木質部導管定殖足以引起番茄植株的部分萎蔫[13]。電鏡觀察發現，青枯菌強致病力菌株能以游離形式存在于番茄感病品種根部細胞間隙，降解細胞壁，破壞原生質膜[1]。關于采用掃描電鏡觀察植株莖部青枯菌數量及侵染進程的研究較少。為此，本研究以番茄青枯病為對象，設置4個土壤濕度處理，借助掃描電鏡觀察各處理番茄植株不同高度莖部的青枯菌侵染情況，明確各處理青枯菌侵染情況的差異，解析溫室番茄種植中土壤濕度-青枯菌-番茄植株之間的互作關系，以及接種青枯菌后番茄植株根系和葉片的響應，通過控制土壤濕度抑制病害的發生，為番茄青枯病的防治提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試番茄品種為金鵬14-8，經致病性測試，發現其為番茄青枯病易感品種；供試青枯菌菌株為P380，由中國農業科學院農業資源與農業區劃所魏海雷教授惠贈。

1.2 試驗處理

試驗于2021年5-9月在陜西省楊凌揉谷鎮千玉鄉土風情園(108°07′ E，34°28′ N)的不對稱大跨度溫室大棚中進行。試驗設接種青枯菌(處理組)與不接種青枯菌(對照組)，分別和4個土壤濕度水平耦合處理。土壤濕度(用土壤相對含水量表示，即土壤濕度=土壤含水量/土壤田間持水量×100%)處理分別為高濕(T1,85%～100%)、中濕(T2,70%～85%)、低濕(T3,55%～70%)和干旱(T4,40%～55%)，采用完全隨機區組設計。采用盆栽方式，栽培介質為V(當地土壤)∶V(有機肥)∶V(商品基質)=5∶1∶1，植株種植方式為單壟雙行，大行距為120 cm，小行距為30 cm，每個濕度處理番茄植株分別選未接種對照6株和接種處理22株，各重復3次，共種植番茄植株336株，小區總面積約96 m2。

青枯菌菌株P380先在TTC固體培養基上于28 ℃恒溫培養2～3 d后，挑單菌落至NA液體培養基中，于28 ℃、200 r/min恒溫搖床振蕩培養2 d，再將菌液轉入裝有NA液體培養基的錐形瓶中大量培養2 d。用無菌水將青枯菌配成OD600=0.4的菌懸液，待番茄長至7～8葉1心時，采用傷根灌根法接種，每株接種150 mL菌懸液。

土壤濕度控制通過設置不同灌水量的方式進行，采用烘干稱重法進行監測。其他試驗條件相同，按常規管理方式進行日常管理。

1.3 番茄植株發病率及病情指數監測

接種青枯菌后，從植株出現青枯病癥狀時開始監測，隔天進行植株發病率統計，并計算病情指數。番茄青枯病的發病癥狀根據方中達[14]的方法分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 5個等級，具體分級標準為：0級，葉片正常沒有病癥發生；Ⅰ級，1%～25%的葉片發生萎蔫；Ⅱ級，26%～50%的葉片發生萎蔫；Ⅲ級，51%～75%的葉片發生萎蔫；Ⅳ級，76%～100%的葉片發生萎蔫。發病率與病情指數計算公式如下：發病率=(感病株數/調查總株數)×100%；

病情指數=∑(各級病葉數×相對級數值)/(調查總葉數×最高級數值)×100。

1.4 番茄莖段青枯菌的掃描電鏡觀察

接種青枯菌后，分別在接種后第3，5，7，9天對各處理植株進行掃描電鏡取樣，每處理隨機取1株植株，將植株根系從莖基部剪去，葉片剪掉，自下而上分別在植株莖高度為10，20，30 cm處取一小塊莖段，依次記為SL1、SL2和SL3(圖1)。按照掃描電鏡的取樣要求，用刀片將莖段切成長×寬×高約為7 mm×7 mm×3 mm的小塊，之后放入體積分數4%戊二醛中固定12 h以上，4 ℃冰箱保存。

掃描電鏡觀察之前用0.1 mol/L pH 6.8 PBS緩沖液漂洗4次，每次10 min；再依次用體積分數10%，30%，50%，70%，80%，90%的乙醇溶液梯度脫水1次，每次10～15 min；接著用體積分數100%的乙醇脫水3次，每次30 min；再進行CO2干燥、粘臺、噴金，最后上樣，采用西北農林科技大學北校大型儀器平臺的掃描電鏡觀察并拍照，每處理至少統計5個視野。

如圖1所示，觀察番茄植株莖段橫切面的髓部，計算每個莖段對應掃描電鏡圖片中的青枯菌數量，再根據比例尺換算成每平方厘米內青枯菌的數量。

青枯菌數量(CFU/cm2)=圖片中青枯菌數量/(掃描電鏡圖片長/比例尺×掃描電子顯微鏡圖片寬/比例尺)。

1.5 植株光合作用指標測定

接種后第4天，選取植株新葉下完全展開、長勢良好的第4片葉，處理組和對照組各重復測5株，采用Li-6800便攜式光合作用儀測定番茄植株的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)和氣孔導度(Gs)。

1.6 植株根系形態指標測定

接種后第6天，處理組和對照組各隨機取4株長勢一致的番茄植株，從莖基部將植株地上部剪去，將植株根系盡可能完整地洗干凈，裝入已編號的自封袋中，測定植株的總根系長度、總根表面積、總根系體積、平均直徑、根尖數等指標。采用LA-S植物根系分析儀系統對根系進行掃描并分析。

1.7 數據處理

試驗數據以“平均值±標準差”表示，用Excel 2016和Origin 2021軟件進行試驗數據的統計分析和繪圖，采用SPSS 23軟件進行單因素方差分析，差異顯著水平為α=0.05。

2 結果與分析

2.1 不同土壤濕度下接種青枯菌對番茄植株發病率和病情指數的影響

由圖1可知，接種青枯菌后第3天，T1、T2、T3處理番茄植株開始出現青枯病患病癥狀，T4處理未出現患病癥狀；之后隨著時間推移，T1處理發病率和病情指數迅速增加，T2處理次之，其中T1處理從接種后第5天到第7天發病率提高了1.97倍，從接種后第9天到第11天發病率提高了25.00%，接種后第11天發病率高達96.67%，植株幾乎全部發??；T2處理從接種后第5天到第7天發病率提高了1倍，接種后第11天發病率達57.67%。T3和T4處理發病率和病情指數隨著時間推移增加極其緩慢，T3處理發病率從接種后第3天到第11天提高了11.98倍，但接種后第11天發病率和病情指數分別為21.67%和13.92；T4處理第11天發病率和病情指數僅為10.00%和5.92。

圖2 接種青枯菌對不同土壤濕度下番茄植株發病率及病情指數的影響

2.2 不同土壤濕度下接種青枯菌對番茄莖段細菌分布的影響

掃描電鏡觀察顯示，視野中青枯菌的大小為(0.5～0.7) μm×(1.5～2.5) μm，呈兩端鈍圓的短桿狀，多分布于木質部組織縫隙中，分布方式多樣。如圖3所示，接種后第3天，在T1和T2處理SL1(10 cm)和SL2(20 cm)莖段以及T3處理的SL1莖段中均可觀察到青枯菌，且青枯菌數量較少；各處理SL1莖段青枯菌數量為T1>T2>T3，SL2莖段青枯菌數量為T1>T2；SL3(30 cm)莖段均未觀察到青枯菌；T4處理各莖段均未觀察到青枯菌。

A.接種后第3天掃描電鏡結果(比例尺=5 μm)；B.不同土壤濕度處理各莖段的青枯菌數量；SL1、SL2、SL3分別代表植株高度為10，20，30 cm莖段；圖柱上標不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)；圖4、圖5和圖6同

由圖4可知，接種后第5天，各處理番茄SL1莖段青枯菌數量為T1>T2>T3>T4，與T1處理相比，T2、T3、T4處理SL1莖段青枯菌數量分別下降了0.98×106，1.49×106，1.61×106CFU/cm2。T1、T2、T3和T4處理SL2莖段青枯菌數量分別為1.20×106，0.11×106，0.11×106和0 CFU/cm2，SL3莖段青枯菌數量分別為0.34×106，0.23×106，0和0 CFU/cm2，可知青枯菌數量隨土壤濕度降低總體呈下降趨勢。

A.接種后第5天掃描電鏡結果(比例尺=5 μm)；B.不同土壤濕度處理各莖段的青枯菌數量

如圖5所示，接種后第7天，各土壤濕度處理番茄SL1莖段青枯菌數量為T1>T2>T3>T4，其中T1、T2、T3、T4處理SL1莖段青枯菌數量分別為3.30×106，0.75×106，0.46×106，0.23×106CFU/cm2，T1處理細菌數量顯著高于其他3個處理。各處理SL2莖段青枯菌數量為T1>T2>T3>T4，SL3莖段青枯菌數量為T1>T4>T2>T3。相同處理不同莖段高度處，青枯菌數量隨著植株高度升高逐漸降低，T1、T2、T3處理中，青枯菌數量均為SL1>SL2>SL3，但T4處理為SL1>SL3>SL2。

A.接種后第7天掃描電鏡結果(比例尺=5 μm)；B.不同土壤濕度處理各莖段的青枯菌數量

如圖6所示，接種后第9天，同一土壤濕度處理的番茄植株，青枯菌數量隨著植株高度的增加呈降低趨勢，即SL1>SL2>SL3。T1處理SL1莖段中青枯菌數量為10.79×106CFU/cm2，分別是T2、T3、T4處理此莖段處細菌數量的3.08，62.70，62.70倍。T3和T4處理各莖段青枯菌數量差異不顯著，且數量較少。

A.接種后第9天掃描電鏡結果(比例尺=5 μm)；B.不同土壤濕度處理各莖段的青枯菌數量

綜上所述，隨著接種時間推移，與接種后第3天相比，接種后第5，7，9天，T1和T2處理番茄SL1莖段青枯菌數量急劇增加，分別增加了2.34，5.34，19.90倍和2.25，2.25，14.25倍；T3處理SL1莖段青枯菌數量增加緩慢；T4處理SL1莖段青枯菌數量在接種后第3天為0，之后隨接種時間推移增速極其緩慢。各處理SL2莖段處青枯菌數量隨接種時間推移變化趨勢不盡相同，T1、T2處理變化較大，T3、T4處理變化較小。SL3莖段青枯菌數量以T1處理變化較大，侵染后期增加迅速,在接種后第9天達到2.93×106CFU/cm2， T2、T3、T4處理SL3莖段處青枯菌數量隨接種時間推移變化不大。

2.3 不同土壤濕度下接種青枯菌對番茄植株光合作用的影響

由圖7 可知，與未接種(對照)植株相比，接種青枯菌后第4天，T1、T2、T3、T4處理植株的Pn分別減弱3.78%，23.20%，10.23%，10.42%；除了T4處理植株葉片的Tr增加16.97%外，T1、T2、T3處理番茄植株葉片的Tr分別降低了11.42%，23.46%，4.96%。

由圖7還可知，接種后T1處理的Pn、Tr、Gs和Ci均顯著高于T2、T3、T4處理，T2與T3處理間無顯著差異，T4處理的各光合指標均顯著低于T1、T2、T3處理。與未接種(對照)植株相比，接種青枯菌后各土壤濕度處理植株的Pn、Tr、Gs和Ci均降低(除T4處理的Tr外)，說明接種青枯菌后植株的光合能力減弱，蒸騰作用減弱可能是因為受到青枯菌在維管束定殖的影響。

圖柱上標不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

2.4 不同土壤濕度下接種青枯菌對番茄植株根系形態的影響

如表1所示，與未接種(對照)植株相比，接種青枯菌后第6天，各土壤濕度處理番茄植株的總根系長度、總根表面積、總根系體積均有所下降，其中T1處理總根系長度為5 099.62 cm，較未接種植株下降了3.27%，T2、T3、T4處理的總根系長度分別為3 957.09，2 935.06和2 355.42 cm。與未接種植株相比，接種后第6天，T1、T2、T3、T4處理番茄植株根尖分別增加了22.57%，35.53%，3.90%，12.16%，其中T1、T2處理的根尖數顯著高于T3、T4處理。接種青枯菌第6天，T4處理植株的總根表面積顯著低于T1、T2處理，但各接種處理植株總根系體積和平均直徑差異均不顯著。

表1 不同土壤濕度下接種青枯菌對番茄植株根系形態的影響

3 討論與結論

3.1 土壤濕度對番茄青枯病發病率的影響

高濕環境下，有寄主存在時土體中青枯菌的存活量會顯著提升，這是因為土壤含水量高會導致寄主防御病菌的相關基因表達下調，進而使得寄主根表青枯菌的存活量增加，土壤中青枯菌的數量與植物青枯病發病率呈顯著正相關[15-16]。本研究中，高土壤濕度環境(T1)的青枯病發病率遠高于低濕(T3)和干旱(T4)環境，高土壤濕度條件下青枯菌11 d左右就完成了整株侵染，發病率高達96.67%；低土壤濕度(40%～70%)條件下植株的發病率較低，且隨著接種時間的推移發病率增加緩慢，因此降低土壤濕度可以抑制青枯病的發展。

3.2 土壤濕度對番茄青枯菌在莖稈中侵染進程的影響

王錚敏等[17]研究茄子體內青枯菌的分布發現，在不同發病期，青枯菌數量均隨著植株高度的上升而下降，這與本研究結果一致。劉波等[18]研究發現，番茄和茄子病株體內青枯雷爾氏菌的平均含量>100×108CFU/g，顯著高于煙草、花生和生姜(<70×108CFU/g)；青枯雷爾氏菌在番茄體內的分布依次為根部>中部以上莖>中部以下莖。本研究中，從植株開始出現癥狀后觀察莖部青枯菌數量，發現隨著接種時間推移，在同一土壤濕度處理下青枯菌數量分布表現為下部莖(SL1)>中部莖(SL2)>上部莖(SL3)；同一莖段內，各土壤濕度處理番茄青枯菌數量為T1>T2>T3>T4；高土壤濕度下植株體內的青枯菌數量顯著高于低濕和干旱處理，同一莖段青枯菌數量隨土壤濕度的下降而降低，因此降低土壤濕度可以抑制番茄青枯病在植株體內的蔓延。

侵染前青枯菌能在環境中識別根系分泌信號，通過端生鞭毛的運動向寄主植物靠攏，利用植物凝結素和Ⅳ型菌毛將其細胞粘附在根部表面，通過根系分泌微點、根部伸長區或次生根節點進入植株體內[19-20]。青枯菌在莖木質部的運動十分復雜，木質部中的細菌數量達到109CFU/mL之前基本上是靜止的[21]。在番茄根中，即使植株沒有顯示萎蔫癥狀，也經常觀察到105～108CFU/g細菌的定殖[22]。本試驗結果與前人研究結果一致，T3和T4處理病情指數極低，在植株自下而上的莖部能夠觀察到少量青枯菌，但植株表型并沒有顯示出青枯病癥狀。結合取樣方法、觀察結果和植株青枯病患病情況可知，植株顯示青枯病癥狀與否可能與青枯菌侵染快慢和植株中青枯菌數量積累多少有關。本研究中，接種青枯菌時間越長，同一土壤濕度處理和同一高度莖段處青枯菌數量越多。高濕(T1)處理下各莖段處青枯菌數量呈明顯上升趨勢，尤其在接種后第7天到第9天，青枯菌數量增加迅速；在中濕(T2)處理中，青枯菌數量也呈增加趨勢；在低濕(T3)和干旱(T4)處理中，隨接種時間推移各莖段處青枯菌數量增加極其緩慢。因此可以推測降低土壤濕度能減緩青枯菌在植株莖中的侵染進程，使植株的發病率降低。

3.3 土壤濕度對接種青枯菌番茄植株光合特性和根系形態的影響

張紅衛等[23]研究發現，小麥的光合速率在土壤含水量偏低的狀態下較小，隨著土壤含水量增高光合速率增大，葉片氣孔傳導速率、胞間CO2濃度也隨著土壤含水量增大逐漸增高。冬小麥光合參數隨著土壤濕度的降低而降低，PAR<100 μmol/(m2·s)時，各水分處理的凈光合速率相差不大；PAR>100 μmol/(m2·s) 時，凈光合速率隨著水分脅迫程度的加重而顯著降低[24]。青枯菌隨蒸騰液流順著導管侵染到植株的莖部，同時青枯菌胞外多糖的富集阻斷了水分和營養物質的運動，阻塞了維管束，導致植物蒸騰作用減弱，從而出現萎蔫癥狀[25]。已有研究顯示，接種青枯菌后植株葉片的Pn、Gs、Ci、Tr均較未接種植株顯著下降[26]。本試驗結果顯示，接種青枯菌后第4天，各處理Pn、Gs、Ci、Tr隨土壤濕度降低而呈下降趨勢，可能是因為土壤濕度降低，植株木質化嚴重，植株的發育受到影響，光合作用受到抑制。與未接種青枯菌的植株相比，接種青枯菌后番茄植株的Pn、Gs、Ci、Tr總體降低，表明接種青枯菌可能抑制植株的光合作用，但接種青枯菌后植株光合效率與未接種(對照)植株相比差異基本不顯著，因此番茄青枯病與光合作用的關系還有待于進一步研究。

楊再強等[27]研究表明，不同水分處理番茄根系生長指標(根系總長度、總表面積、總平均直徑、根尖數)的最大值均表現為輕度脅迫>中度脅迫>正常灌溉>重度脅迫，表明輕度脅迫利于根系生長，中、重度土壤水分脅迫明顯抑制了番茄植株根系的生長。這與本試驗中土壤濕度對番茄根系影響的結果不一致，4種土壤濕度處理的番茄植株總根系長度、總根表面積和根尖數均為T1>T2>T3>T4，可能是T1、T2處理的高土壤濕度環境促進了番茄根系生長，而低土壤濕度環境則抑制了番茄根系生長，T4處理對番茄植株的生長造成脅迫，因此根系形態隨土壤濕度大小的變化有所不同。段曦[28]研究發現，接種青枯菌后番茄植株根系受損嚴重，側根和根毛明顯減少；曾東方等[29]研究發現，青枯菌侵染后花生的根系生長速度變慢。有研究表明，接種青枯菌7 d番茄植株根系形態，植株總根系長度、總根表面積、總根系體積均比未接種青枯菌的植株降低，根平均直徑變化不明顯[30]。本研究結果表明，在接種青枯菌后第6天，與未接種植株相比，接種青枯菌處理番茄植株的總根系長度、總根系體積、總根表面積降低，根尖數增加，根平均直徑變化無規律，因此青枯菌侵染可能對番茄植株根系生長存在抑制作用，這與前人研究結果一致。