基于傳感/信號分離的雙極電極-電化學發光酶傳感器檢測膽固醇

劉利陽 黃聲秀 姚清達 楊偉強 倪建聰

（閩南師范大學化學化工與環境學院，漳州 363000）

膽固醇（Cholesterol，CHOL）也稱膽甾醇，是多種疾病診斷的重要生理指標[1-2]。體內高水平的CHOL是誘發高血壓[3]、動脈硬化[4]和心肌梗塞[5]等多種疾病的主要因素，而低水平的CHOL 也可能會導致低脂蛋白[6]、敗血癥[7]、甲亢[8]和肝病[9]等疾病。因此，準確、靈敏地檢測體內CHOL 含量對臨床診斷和疾病預防非常重要。目前，常用的CHOL 檢測方法包括酶法[10]、比色法[11]、高效液相色譜（HPLC）法[12]、熒光法[13]、電化學法[14]、電化學發光（Electrochemiluminescence，ECL）法[15]等。其中，ECL 法是在電極表面施加一定的電壓，使發光體電激發形成激發態，在回到基態過程中以光的形式釋放能量，從而獲得ECL 響應信號[16-17]。ECL 具有高靈敏、低背景、簡單可控等特點，在臨床分析診斷領域廣泛應用[18-19]。但是，在檢測生物樣本時，ECL 傳感過程易受到復雜基質的干擾，產生非特異性檢測信號。雙極電極（Bipolar electrode，BPE）是在外加電場驅動下導體兩端發生極化的現象，將其與ECL 結合可以構建傳感端和信號端分離的雙極電極-電化學發光（BPE-ECL）檢測方法[20]。如Lu 等[21]在印刷電極上設計一段碳基雙極電極，其陰極端修飾的核酸探針在靶標赭曲霉毒素A 的存在下引發雜交鏈式反應并結合辣根過氧化物酶，催化苯胺/過氧化氫的聚合反應；陽極端信號池中的釕聯吡啶/三正丙胺（Ru（bpy）32+/TPrA）發光體系的信號受陰極端催化過程的電子轉移調控。通過構筑分離的傳感檢測池和信號收集池，可以避免樣本基質對發光體系的直接干擾。BPE-ECL 傳感模式近年來受到了廣泛關注，并已被開發用于DNA[22]、癌癥標志物[23]和細菌[24]等靶標的檢測，但尚無將BPE-ECL 體系用于人體內CHOL 含量檢測的報道。

本研究開發了一種酶催化的BPE-ECL 傳感平臺用于測定人血清中CHOL 的含量，此傳感器具有傳感/信號分離的特點。如圖1 所示，利用光刻法在氧化銦錫（Indium tin oxide，ITO）導電玻璃電極上刻蝕出導電ITO（綠色部分）的雙極電極及外接驅動電極，并在驅動電極負極和BPE 陰極電沉積納米金（AuNPs，黃色部分）；利用聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）在BPE 的陰極端和陽極端分別構筑獨立的傳感檢測池和信號收集池（白色部分）。在BPE 陰極端電聚合殼聚糖（CS）并固定膽固醇氧化酶（Cholesterol oxidase，CHOx），在信號池中加入Ru（bpy）32+/TPrA 作為發光信號源。當檢測池中存在CHOL 時，CHOx催化氧化CHOL 分解并生成H2O2；在外電壓的驅動下，BPE 保持電荷守恒但兩端發生極化[25]，陰極端的H2O2發生還原反應，并將電子轉移至BPE 陽極端，引發信號池中Ru（bpy）32+/TPrA 的氧化反應，從而產生較強的ECL 響應。隨著檢測池中CHOL 濃度增大，BPE 陰極端的CHOx 催化產生更多的H2O2，從而使信號池的ECL 信號更強，由此建立了一種傳感/信號分離的CHOL 檢測新方法。

圖1 雙極電極-電化學發光膽固醇酶傳感器的構建及傳感原理示意圖Fig.1 Schematic of construction and sensing mechanism of BPE-ECL enzymatic biosensor for detection of cholesterol

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI 660E 電化學工作站（上海辰華儀器公司）；BPCL-1-T 微弱發光儀（北京亞泊斯儀器公司）；FR224CN 電子天平（上海奧斯豪儀器有限公司）；JSM-IT510 掃描電子顯微鏡（日本電子株式會社公司）；DZF-6050 真空干燥箱（上海馳唐實業有限公司）；KDC-40 高速離心機（美國瓦里安公司）；ITO 電極（華南湘城科技有限公司）；Direct-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）。

CHOL、CHOx、Ru（bpy）32+、TPrA、HAuCl4、K3Fe（CN）6、K4[Fe（CN）6、正性光刻膠（AZP4620）和PDMS 購自上海阿拉丁試劑有限公司；HNO3、HCl、HAc、NaOH、KCl、戊二醛（GA）、抗壞血酸（AA）、尿酸（UA）、檸檬酸（CA）、多巴胺（DA）、葡萄糖（Glu）、維生素E（VE）、CS 和磷酸鹽緩沖溶液（PBS）購自國藥集團化學試劑有限公司；人血清樣本由福建省漳州市醫院提供，患者知情同意，相關研究經過倫理委員會批準。所用試劑均為分析純；實驗用水均為超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 實驗方法

1.2.1 ITO電極的圖案化制備

參照文獻[26]，利用光刻法對ITO 電極進行圖案化處理。將ITO 電極粘附在甩膠機的旋轉圓盤上，并涂覆正性光刻膠，以3000 r/min 甩膠40 s 使之均勻；將ITO 電極置于110 ℃烤膠機上加熱3 min，冷卻至室溫后，將光刻掩版置于ITO 電極表面并在紫外燈下曝光4 min；將ITO 電極浸沒在0.7%NaOH 溶液中顯影；將光膠圖案化的ITO 電極浸入HNO3/HCl/H2O 刻蝕液（4∶5∶5，V/V）中，刻蝕掉暴露的ITO 層，超聲20 min 除去表面的光膠，即可得到導電部分圖案化的ITO 電極。

1.2.2 BPE傳感器的制備

在驅動電極負極和BPE 陰極電沉積AuNPs。在檢測池與信號池中分別加入100 μL HAuCl4溶液（2.4 mmol/L，含0.1 mol/L KCl），施加6.0 V 的外電壓300 s，然后用水將ITO 電極沖洗干凈。

將PDMS 預聚物和固化劑按質量比10∶1 進行混合，攪拌，真空脫氣30 min 后倒入模具，于60 ℃固化3 h。用打孔器將固化后的PDMS 制成方形池（直徑10 mm，孔深3 mm），并粘貼于ITO 雙極電極部分的兩端，即制得BPE 傳感器。

1.2.3 CHOx的固定

在檢測池中加入CS 的1%乙酸溶液，信號池中加入100 mmol/L PBS 緩沖液，施加?0.4 V 的外電壓200 s，即可在BPE 的陰極端電聚合上CS 薄膜。在BPE 陰極端滴加20 μL CHOx（1.0 mg/mL）與2 μL 戊二醛（1%）的混合溶液，待電極干燥后，重復該操作3 次。

1.2.4 CHOL的ECL檢測

在檢測池中加入100 μL 含不同濃度CHOL 的PBS 溶液（100 mmol/L，pH=7.0），在信號池中加入100 μL 含1 mmol/L Ru（bpy）32+和5 mmol/L TPrA 的PBS 溶液（100 mmol/L，pH=7.0）。將傳感器在37 ℃孵育25 min 后進行ECL 測試，每個樣品均進行3 次重復測試。ECL 檢測條件：BPCL 工作電壓為800 V；循環伏安法（Cyclic voltammetry，CV）掃描電壓范圍為1.0～4.0 V，掃速為100 mV/s。采用本方法檢測血清中的CHOL，同時進行加標回收實驗，并與HPLC 檢測結果進行比較。

2 結果與討論

2.1 不同修飾電極的表征

BPE 陰極端位于檢測池內，其上負載的CHOx 催化CHOL 水解生成H2O2，其表面修飾情況對傳感器的性能有重要影響。利用掃描電鏡（SEM）對BPE 陰極端修飾過程進行了表征。由圖2A 可見，裸ITO 電極表面非常潔凈；由圖2B 可見，BPE 陰極端電沉積AuNPs 后，AuNPs 比較致密且基本覆滿電極表面。電沉積AuNPs 避免了ITO 電極在高負電位下損壞，并加快電子轉移速率。為了給CHOx 提供有效負載位點，在BPE 陰極端電聚合一層CS 薄膜得到CS/AuNPs/ITO，在電極的表面和截面（圖2C）均可見CS 薄膜均勻地覆蓋在BPE 陰極端。采用滴涂的方式將CHOx 固定在BPE 陰極端得到CHOx/CS/AuNPs/ITO，滴涂后的CHOx 呈圓球形且幾乎將電極表面覆滿，上層表面還具有凹陷的活性位點（圖2D），表明CHOx 成功修飾在BPE 陰極表面。

圖2 BPE 陰極端修飾電極表面的掃描電鏡（SEM）圖：（A）ITO；（B）AuNPs/ITO；（C）CS/AuNPs/ITO；（D）CHOx/CS/AuNPs/ITO。插圖為對應的電極截面圖Fig.2 Surface and cross-sectional scanning electron microscopy (SEM) images of modified BPE cathode:(A) Bare ITO;(B) AuNPs/ITO;(C) CS/AuNPs/ITO;(D) CHOx/CS/AuNPs/ITO.Insets are corresponding cross sections of different electrodes

采用電化學方法研究BPE 陰極端的傳感性能。[Fe（CN）6]3–/4–探針在不同修飾BPE 陰極上的CV 曲線如圖3A 所示，與裸ITO（曲線a）相比，電沉積AuNPs 的電極界面（曲線b）具有更高的電化學信號，說明AuNPs 的沉積增強了電極的導電性；電聚合CS 后，CS/AuNPs/ITO（曲線c）的電化學響應信號降低，這是由于CS 導電性較差，阻礙了電極表面的電子傳遞；滴涂CHOx 后，CHOx/CS/AuNPs/ITO（曲線d）的電化學信號進一步降低，說明CHOx 成功固定在電極表面。電化學交流阻抗譜（EIS）表征結果如圖3B 所示，裸ITO（曲線a）的Nyquist 曲線在高頻區呈現較小的半圓，表明電極的電子傳遞阻抗（Ret）較小，探針[Fe（CN）6]3?/4?在該界面的電子傳遞速率較快；電沉積AuNPs 后，阻抗譜圖中半圓直徑減?。ㄇ€b），表明AuNPs 有利于促進電子傳遞；由于CS 導電性差，CS/AuNPs/ITO 的半圓直徑明顯增大（曲線c）；CHOx/CS/AuNPs/ITO的半圓直徑進一步增大（曲線d），表明大量不導電的酶固定在電極表面。以上EIS 結果表明，BPE 陰極傳感端已成功構建。

圖3 BPE 陰極端不同修飾電極在含1.0 mmol/L 的[Fe（CN）6]3–/4–的0.1 mol/L KCl 溶液中的（A）循環伏安（CV）圖和（B）交流阻抗（EIS）圖：（a）ITO；（b）AuNPs/ITO；（c）CS/AuNPs/ITO；（d）CHOx/CS/AuNPs/ITOFig.3 (A) Cyclic voltammetry (CV) and (B) electrochemical impedance spectroscopic (EIS) characterization of different BPE cathodes in 100 mmol/L KCl solution containing 1.0 mmol/L [Fe(CN)6]3–/4–: (a) Bare ITO;(b) AuNPs/ITO;(c) CS/AuNPs/ITO;(d) CHOx/CS/AuNPs/ITO

2.2 實驗條件的優化

為了使傳感器性能達到最佳，對檢測池BPE 陰極端的CHOx 的固載量、酶催化反應的溫度、緩沖液pH 值和反應時間進行了優化。首先考察了BPE 陰極端CHOx 固載量對傳感器性能的影響。如圖4A 所示，隨著滴加的CHOx 酶固定液濃度增加，ECL 信號逐漸增大，表明CHOx 固載量增多，能夠有效催化CHOL 并產生大量的H2O2，使陽極端的ECL 信號增強；當酶固定液濃度超過1.0 mg/mL 時，ECL 信號基本維持穩定。因此，后續實驗中選擇CHOx 酶固定液濃度為1.0 mg/mL。催化反應溫度的影響如圖4B 所示，ECL 信號隨著催化反應溫度上升而增強，并在37 ℃時達到最大值，之后隨溫度增加而逐漸下降。這是因為酶催化反應通常有一個最適溫度。本研究中CHOx 催化反應的最適溫度為37 ℃。檢測池中溶液pH 值對傳感器的ECL 信號的影響如圖4C 所示，隨著檢測池溶液pH 值逐漸升高，ECL 信號先上升，在pH ＞7.0 后下降。因此，選取pH=7.0 的PBS 緩沖溶液進行后續實驗。酶的催化反應時間也是影響電極ECL 信號的重要因素，如圖4D 所示，在5～25 min 的時間范圍內，隨著酶催化反應時間延長，ECL 信號不斷增大，這是因為催化反應時間越長，CHOx 催化CHOL 生成的H2O2越多；但是，酶催化反應時間超過25 min 后，ECL 信號反而減弱，這可能是一部分H2O2分解所致。綜合考慮響應信號和檢測時效，選擇25 min 作為CHOx 最佳催化反應時間。

圖4 （A）CHOx 濃度、（B）催化反應溫度、（C）pH 值和（D）催化反應時間對傳感器ECL 信號強度的影響；檢測池：1 mmol/L CHOL 溶液;信號池：1 mmol/L Ru（bpy）32++5 mmol/L TPrAFig.4 Effects of (A) concentration of CHOx,(B) temperature,(C) pH value and (D) incubation time on ECL signal intensity.1 mmol/L cholesterol in sensing cell;1mmol/L Ru(bpy)32++5 mmol TPrA in reporting cell

2.3 傳感器的分析性能

在最優的實驗條件下，對不同濃度的CHOL 溶液進行了檢測。隨著檢測池中CHOL 溶液濃度增大，BPE 信號池ECL 信號逐漸增大（圖5A）。以ECL 信號強度為縱坐標、CHOL 濃度的對數值為橫坐標，繪制工作曲線，如圖5B 所示，ECL 強度與CHOL 濃度（1 μmol/L～10 mmol/L）的對數具有良好的線性關系，線性方程為I=2372.4×lg[C/（μmol/L）]+1081.4（R2=0.998），檢出限為0.13 μmol/L（S/N=3）。與文獻報道的其它CHOL 檢測方法相比（表1），本方法檢測時間短、檢出限低、線性范圍寬。本方法采用的BPE 傳感信號分離模式有效避免了發光試劑與待檢測溶液的干擾，可獲得靈敏且穩定的檢測信號。

表1 不同CHOL檢測方法性能比較Table 1 Comparison of analytical performances of different CHOL assays

圖5 （A）傳感器對不同濃度CHOL 的ECL 響應信號；（B）ECL 信號強度隨CHOL 濃度對數值變化的線性關系曲線。檢測池CHOL 濃度（a →l）：1、5、10、25、50、100、250、500、1000 μmol/L，2.5、5、10 mmol/L；信號池：1 mmol/L Ru（bpy）32++5 mmol/L TPrAFig.5 (A) ECL response of different concentrations of CHOL;(B) Linear relationship between ECL intensity and logarithmic concentrations of CHOL.Concentrations of CHOL (a →l) are 1,5,10,25,50,100,250,500,1000 μmol/L,2.5,5,10 mmol/L,respectively.1 mmol/L Ru(bpy)32++5 mmol TPrA in reporting cell

2.4 傳感器的抗干擾性、重現性與穩定性

為了考察此BPE-ECL 酶生物傳感器的選擇性，在檢測池中加入10 mmol/L 的AA、UA、CA、DA、Glu 和VE 等潛在干擾物，并與1 mmol/L CHOL 溶液的陽極ECL 信號進行對比。由圖6A 可見，此傳感器對CHOL 溶液具有良好的ECL 響應，而對上述干擾物無明顯ECL 響應，說明此傳感器對CHOL 具有良好的選擇性。在檢測池分別加入1、100 和1000 μmol/L CHOL 溶液，進行3 次重復檢測，結果如圖6B 所示，各濃度下ECL 響應信號的相對標準偏差（RSD）分別為2.2%、1.4%和1.8%，說明傳感器具有良好的重現性。如圖6C 所示，在檢測池中加入100 μmol/L CHOL 溶液，8 次連續掃描的ECL 信號的RSD 為2.3%，表明此傳感器具有良好的穩定性。

圖6 傳感器的（A）選擇性（CHOL 濃度為1 mmol/L，干擾物濃度為10 mmol/L）、（B）重現性（CHOL 濃度分別為1、100 和1000 μmol/L）和（C）穩定性（100 μmol/L CHOL）實驗結果，信號池中均為1 mmol/L Ru（bpy）32++5 mmol/L TPrAFig.6 (A) Selectivity (1 mmol/L CHOL,and 10 mmol/L each interferent),(B) reproducibility;(1,100 and 1000 μmol/L CHOL,respectively)and(C)stability(100 μmol/L CHOL)of the sensor.All reporting cells contain 1 mmol/L Ru(bpy)32++5 mmol/L TPrA

2.5 實際樣品分析

利用此傳感器對3 個人血清樣本中的CHOL 濃度進行測試，并進行加標回收實驗，評估此傳感器對實際樣品的檢測性能，結果如表2 所示，加標回收率在98.4%～104.0%之間，RSD ＜4.7%。將此傳感器檢測結果與HPLC 檢測結果進行比對，二者無明顯差異，表明此傳感器可準確測定復雜血清樣品中的CHOL 濃度。

表2 人血清樣品中CHOL的檢測結果Table 2 Detection results of CHOL in human serum samples

3 結論

基于BPE-ECL 技術構建了一種酶傳感平臺并用于CHOL 的檢測。構筑了空間獨立的傳感檢測池和信號收集池，將CHOx 固定在BPE 陰極端，催化CHOL 分解，由產生的H2O2在陰極端的還原過程誘導陽極端的Ru（bpy）32+/TPrA 發生氧化反應，從而產生ECL 檢測信號，實現了對不同濃度CHOL 的檢測。將此傳感器用于人血清中CHOL 的檢測，表現出良好的準確性和抗基質干擾能力。這種傳感/信號分離的模式避免了樣本基質對發光信號的直接干擾，在生物傳感檢測領域具有良好的應用前景。