光照強度對美花石斛試管苗生長及光合特性的影響*

王尚濤,朱成豪,江 媛,張遠帆,王彥珺,張淑睿,孫志蓉

(北京中醫藥大學中藥學院,北京 102488)

美花石斛(Dendrobiumloddigesii),又稱粉花石斛、環草石斛,為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生附生草本植物,以新鮮或干燥莖入藥,在中國傳統藥用石斛應用中具有悠久的歷史,其加工品在中國臺灣、香港以及東南亞等地享有很高的聲譽[1]。多糖類成分是美花石斛中的主要成分,現代藥理學研究證明其具有抗腫瘤、增強免疫力的作用[2-4]。美花石斛廣泛分布在我國兩廣地區、海南、云南南部、貴州西南部,歷史上又以我國貴州省興義市所產美花石斛質量優、產量高,但由于長期不合理的采收利用,加之喀斯特地貌的環境變化,導致其野生資源瀕臨枯竭[5],1987年被列為中國三級珍稀瀕危保護植物,2021年被列為國家二級重點保護野生植物[6]。美花石斛的種子中不含胚乳,球狀原胚直接被一層透明種皮包裹,自然狀態下種子因缺乏營養物質難以萌發,繁殖率極低,與其他藥用石斛種類相比,植株生長更加緩慢,更新恢復周期長,野生資源分布稀少[1]。通過多年的試驗研究,雖然現已經成功培育出美花石斛試管苗[7-9],但是還存在著試管苗的數量、質量難以保證和移栽成活率低等問題[10],因此保護野生資源,加強美花石斛人工栽培技術的研究非常迫切[11],如何提高美花石斛試管苗質量仍需深入研究。

光照是植物組織培養的關鍵因素,光照強度對組培植物的形態、光合作用、內源激素及葉片結構具有顯著影響[12,13]。研究表明,不同強度的光照能通過調節不同類型的、與光合作用有關的葉綠體蛋白質復合物的形成,以及光系統Ⅰ(PSⅠ)和光系統Ⅱ (PSⅡ)間的電子傳遞來影響植株的生長[14,15]。植物所表現出的生長現象、發育規律和生理生化特性是遺傳基因和環境因子共同作用的結果[11,16],植物對不同調控措施所做出的形態和生理等反應會決定生產目標的數量和質量。國內外已有學者對不同光照處理的菊花(Chrysanthemummorifolium)[17]、文心蘭(Oncidiumflexuosum)[13]、黃瓜(Cucumissativus)[18]、番茄(Solanumlycopersicum)[19]和金娃娃萱草(Hemerocallisfulva‘Golden Dolli’)[20]等進行研究,并取得初步成果,但有關光照強度對美花石斛試管苗生理生化特性影響的研究尚未見報道。本文通過研究不同光照強度處理下美花石斛試管苗的生長發育、多糖含量、光合特性和熒光特性等變化,探索美花石斛試管苗對光照強度的需求特性,為美花石斛優質種苗培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

成熟的美花石斛種子由貴州吉仁堂藥業公司提供。種子經消毒后,在無菌條件下播種于種子萌發生長培養基[MS+0.2 mg/L萘乙酸(NAA)+3%白砂糖+15%馬鈴薯提取液+0.8%瓊脂粉,pH值為5.8]表面,萌發生長2個月后,將其轉接到分化生長培養基上(MS+0.5 mg/L NAA+3%白砂糖+20%馬鈴薯提取液+0.8%瓊脂粉,pH值為5.8),培養條件均為光照強度18 μmol·m-2·s-1,光照時間12 h/d,溫度為(25±2) ℃[21]。2個月后,選苗高約0.5 cm,長有1-2片真葉、1-2條短根的試管苗轉接至生根壯苗培養基(MS+0.5 mg/L NAA+3%白砂糖+20%馬鈴薯提取液+0.8%瓊脂粉,pH值為5.8)。分別設置18 μmol·m-2·s-1(G1)、36 μmol·m-2·s-1(G2)、54 μmol·m-2·s-1(G3)的光照強度處理試管苗,光照時間12 h/d,溫度為(25±2) ℃。接種玻璃瓶規格為直徑7 cm,高9 cm,接種密度10株/瓶,每處理接種20瓶。光照處理2個月(播種生長6個月)和光照處理4個月(播種生長8個月)時分別取樣,測定美花石斛試管苗生長指標、多糖含量、光合特性和熒光特性指標。

1.2 方法

1.2.1 生長指標的測定

光照處理2個月和光照處理4個月時分別取樣,每處理隨機抽取10瓶,再從中隨機取30株,用直尺測定株高和根長,用游標卡尺測量根與莖連接處的莖粗,并將鮮樣品置于50 ℃烘箱烘至恒重后用電子天平稱重。

1.2.2 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[22]。

1.2.3 葉綠素含量的測定

稱取0.5 g葉片,將其浸泡在12 mL 80%丙酮溶劑中,一定時間(約4 d,以葉片變白為宜)后用瑞士Kontron公司生產的UV810/812型紫外可見分光光度計,分別測定645 nm和663 nm處的吸收值,計算出葉綠素a、b的含量以及總含量[23]。每處理重復測定3株,每株3個葉片,計算平均值。

1.2.4 表觀光合速率的測定

參照Xu等[24]的方法并加以修改。采用英國Hansatech公司生產的Oxy-Lab氧電極自動測定系統測定,反應體積為2 mL,反應介質為100 mmol/L磷酸緩沖液、20 mmol/L NaHCO3,測定時每2 mL反應介質加入0.05 g葉片。當光照強度為300 μmol·m-2·s-1時,測定反應液中O2濃度的變化,單位時間內每克葉片的反應液中O2變化的摩爾數,即為表觀光合速率。每處理重復測定3株,每株3個葉片,計算平均值。

1.2.5 葉綠素熒光參數的測定

選擇光照處理2個月和光照處理4個月為測定時間點,于上午9:00-11:30進行測定。選取從上往下數完全展開的第1片葉。每處理重復測定3株,每株3片葉,計算平均值。所用儀器為德國Heinz Walz GmbH公司生產的PAM-2100脈沖調制式熒光儀,在室溫下進行熒光動力學曲線的測定。將葉片暗適應20 min,在弱調制測量光(650 nm,脈沖光時間0.8 s,0.1 μmol·m-2·s-1)下誘導產生初始熒光Fo,隨后用強飽和脈沖光(650 nm,脈沖光時間0.8 s,8 000 μmol·m-2·s-1)激發產生最大熒光Fm。當熒光從Fm降低至Fo水平時,用光化光(665 nm,脈沖光時間10 s,600 μmol·m-2·s-1)誘導美花石斛生成熒光動力學曲線,進行熒光參數測定。在測定過程中光化光-飽和脈沖光-遠紅光-黑暗交替作用,測定光適應下的穩態熒光Fs、最大熒光Fm′、最小熒光Fo′等參數,進而計算出PSⅡ的最大光化學效率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm,PSⅡ的實際光化學量子效率Y(Ⅱ)=ΔF/Fm′=(Fm′-Fs)/Fm′,光化學猝滅系數qP=(Fm′-Fs)/(Fm′-Fo′),非光化學猝滅系數qN=1-(Fm′-Fo′)/(Fm-Fo)。在完成熒光誘導曲線測定后,立即進行光合電子傳遞速率(ETR)-光化光(PAR)熒光光響應曲線的測定,測定過程與誘導生成熒光動力學曲線測定過程基本相同,有所不同的是PAR強度從11 μmol·m-2·s-1依次增加到483 μmol·m-2·s-1,每個強度的PAR持續時間為10 s,最后通過所得的各個熒光參數,利用公式ETR=Y(Ⅱ)×PAR×0.5×0.84 計算出光合電子傳遞速率ETR。

1.2.6 數據處理

使用GraphPad Prism 9軟件進行數據整理和制圖,采用SPSS 17.0統計軟件對試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 光照強度對美花石斛試管苗生長發育的影響

由表1可知,隨著光照強度增大,光照處理2個月的試管苗苗高、葉片數、根長、莖葉干重及多糖含量均顯著增大,而光照處理4個月的試管苗除葉片數和根長外,其余各指標均隨著光照強度增大而顯著增加。

表1 光照強度對美花石斛試管苗生長指標及多糖含量的影響

2.2 光照強度對美花石斛試管苗光合特性的影響

2.2.1 光照強度對美花石斛試管苗葉綠素含量的影響

由圖1可知,光照處理2個月時,試管苗的葉綠素總含量隨著光照強度的增大而減弱;不同光照強度處理間,葉綠素a/b的值均在2.0-2.1范圍內浮動,變化較小。光照處理4個月時,G2、G3處理的試管苗葉綠素總含量較高,分別為25.7 μg·g-1和23.0 μg·g-1,與G1處理(16.8 μg·g-1)相比差異顯著;不同光照強度處理間,葉綠素a/b的值均在2.0-2.5范圍內,且G1、G2處理的葉綠素a/b的值顯著高于G3處理。光照處理2個月時,中、低光照強度處理的試管苗葉綠素總含量高于高光照強度處理的試管苗;光照處理4個月時,中、高光照強度處理的試管苗葉綠素總含量高于低光照強度處理。隨著試管苗生長時間的延長,各處理間葉綠素a/b比值的差異增大,光照處理4個月試管苗的葉綠素a/b比值均高于對應光照強度處理2個月試管苗的水平。

Significant differences were denoted by different letters.

2.2.2 光照強度對美花石斛試管苗表觀光合速率的影響

由圖2可知,3種光照強度條件下,處理2個月試管苗的表觀光合速率均比處理4個月試管苗的高。光照處理2個月時,各處理間的表觀光合速率差異顯著,并隨著光照強度增大表現出先升高再降低的趨勢,其中G2處理的表觀光合速率最大,為0.045 9 nmol·g-1·s-1。光照處理4個月時,3種光照強度下試管苗的表觀光合速率值的變化情況與光照處理2個月時的相反,以G2處理的表觀光合速率值最低,而G1與G3處理的表觀光合速率較為接近。上述結果說明不同光照強度下,美花石斛試管苗的光合能力不相同,且不同發育時期的試管苗對光照強度的適應性也有所不同。

Significant differences were denoted by different letters.

2.3 光照強度對美花石斛試管苗熒光特性的影響

由圖3可知,3種光照強度條件下,光照處理2個月試管苗的Fo在各處理間差異不顯著;而PSⅡ的Fv/Fm以G2處理最高,G3處理最低,各處理間差異顯著。光照處理4個月,G1、G2處理試管苗的Fo與G3處理差異較大,而PSⅡ的Fv/Fm以G1處理較高,但各處理間差異不顯著。從Fo、Fv/Fm的變化情況來看,不同生長發育時期,美花石斛試管苗對3種強度的光照的響應不同。

Significant differences were denoted by different letters.

從圖4可知,3種光照強度條件下,光照處理2個月和處理4個月試管苗的Y(Ⅱ)和ETR均以G3處理最高,且處理2個月的Y(Ⅱ) 和ETR均高于對應光照強度下處理4個月的。光照處理2個月和處理4個月試管苗的qN均以G2處理最高,但光照處理2個月的以G3處理最低,光照處理4個月的以G1處理最低。光照處理2個月和處理4個月試管苗qP均以G3處理最高。不同光照和處理時間下的Y(Ⅱ)和ETR的結果表明,G3處理的光照有利于PSⅡ實際光化學量子效率和非環式電子傳遞速率的提高,而這兩個參數是由Fv/Fm和碳循環速率共同決定的,表明隨著不同光照的光照強度和處理時間的增加,在所發生的、實際光化學量子效率提高這個過程中,碳循環的變化可能起主導作用。另外,qN的變化情況可反映兩個時期美花石斛試管苗熱耗散的變化,G2處理的光照對播種生長6個月試管苗的熱耗散系統的建立較為有利,而G2和G3處理的光照對播種生長8個月試管苗熱耗散系統的建立較為有利。qP的變化結果與Y(Ⅱ)的結果相似,表明G3處理的光照有利于PSⅡ反應中心將光能轉化為電勢能。

圖4 光照強度對美花石斛試管苗熒光參數Y(Ⅱ)、ETR、qN和qP的影響

3 討論

美花石斛試管苗移栽初期,是從無菌、溫度和光照強度恒定、濕度飽和的環境向有菌的、不穩定的自然環境過渡,因此,在移栽前對其進行壯苗培養尤為重要。故本研究設計的時間點選擇在美花石斛轉移到生根壯苗培養基上開始,以分析不同光照強度對美花石斛根上部生長的影響并探討碳同化作用。

光照強度直接影響植物的光合作用,進而影響植物的生長發育。較低光照強度會影響試管苗對培養基中氮素和磷素的吸收[25],同時影響葉片的氣孔發育[26],進而影響光合速率。在前期實地調查中發現,生產中組培室內美花石斛試管苗壯苗培養光照強度在27 μmol·m-2·s-1左右,但此壯苗培養條件下美花石斛試管苗生長發育狀況差,故本研究設置18-54 μmol·m-2·s-1的梯度變化來考察光照強度對美花石斛試管苗生長的影響。光合色素能夠吸收、傳遞和轉化光能,是植物進行光合作用的物質基礎[20],葉綠素的含量、比例是植物適應環境和利用環境資源的重要指標,葉綠素總含量高、葉綠素a/b的值小的植物具有較強的耐陰性。本研究結果表明,隨著光照強度加大和培養時間延長,G3處理的美花石斛試管苗的生長量如苗高、莖粗等,生物量積累如莖葉干重、根干重和多糖含量等均高于G1處理。不同生長時期、不同光照強度下美花石斛試管苗的葉綠素a/b的值均小于3,這符合陰生植物的特性[27]。隨著光照強度處理時間延長,美花石斛試管苗葉片葉綠素a/b的比值逐漸增大;光照處理2個月時,G1處理的光照比G2、G3處理的更有利于試管苗葉綠素的合成,而光照處理4個月時,G2處理的光照強度更有利于試管苗葉綠素的合成。根據課題組前期研究基礎,從美花石斛試管苗的氣孔發育考慮,可能與18 μmol·m-2·s-1的光照強度阻礙了美花石斛的試管苗氣孔發育有關[28],即18 μmol·m-2·s-1的光照強度下,生長前期的美花石斛試管苗已受弱光脅迫,當時該光照強度雖然能短暫滿足該階段試管苗的光合能力需求,但是隨著處理時間的增加,其未正常發育的氣孔便會影響后期試管苗的光合能力。

Krause等[29]研究表明,Fo來自葉綠素a,即在正常情況下,一定范圍內Fo的大小與葉綠素a的含量呈正相關。隨著光照處理時間延長,處理4個月時G1、G2處理的Fo與G3處理之間差異顯著。隨著光照處理時間從2個月到4個月,各處理間的PSⅡ最大光化學效率差異從顯著變為不顯著,這表明美花石斛試管苗的PSⅡ最大光化學效率在發育初期對光照的反應比較敏感,一旦光反應系統形態建成后,其受光照調節的幅度逐漸減小。從Fv/Fm的變化結果來看,播種生長6個月時36 μmol·m-2·s-1的光照強度有利于試管苗PSⅡ最大光化學效率的提高。隨著光照處理時間延長,試管苗的Y(Ⅱ)、ETR和qP值逐漸減小,但2次取樣均以G3最高;qP的變化結果與Y(Ⅱ)的結果相似,表明G3處理的光照有利于PSⅡ反應中心將光能轉化為電勢能;qN的變化進一步反映兩個時期美花石斛試管苗對不同強度的光照的響應不同,G2處理的光照有利于播種生長6個月試管苗熱耗散系統的建立。綜合熒光參數的變化,36 μmol·m-2·s-1光照強度有利于播種生長6個月試管苗PSⅡ最大光化學效率的提高和熱耗散能力的增強。播種生長8個月時的試管苗的qP值以54 μmol·m-2·s-1的光照強度處理下最高,這表明該光照強度有利于PSⅡ反應中心將光能向電勢能轉化?？紤]植物呼吸速率和熒光相關參數對光反應系統的影響,即54 μmol·m-2·s-1的光照強度處理下的試管苗的表觀光合速率顯著高于36 μmol·m-2·s-1光照強度處理下的試管苗,且Fo比36、18 μmol·m-2·s-1光照強度下高,這表明54 μmol·m-2·s-1的光照強度更有利于播種生長8個月的美花石斛試管苗光反應系統的完善。qN在G2、G3處理下都較高,且測定值較為接近,表明36、54 μmol·m-2·s-1光照強度對8個月試管苗的熱耗散系統的建立都很有利?？紤]植物呼吸速率對熱耗散系統的影響,即54 μmol·m-2·s-1光照強度處理下的試管苗的表觀光合速率顯著高于36 μmol·m-2·s-1下的試管苗,認為54 μmol·m-2·s-1的光照強度更有利于播種生長8個月的美花石斛試管苗熱耗散系統的能力增強。由于條件限制,本研究所設置的光照強度梯度有限,在G3與G2處理條件下所測得的美花石斛部分葉綠素熒光參數差異不顯著,是否更大的光照強度會顯著影響美花石斛試管苗的光合作用參數,還需后續進一步研究。

4 結論

光照強度對美花石斛試管苗的生長發育,尤其是光系統建成具有重要影響。在不同的生長發育時期美花石斛試管苗對光照強度的需求不同,隨著生長時間的延長其對光照強度的要求有所增大。培育過程中可根據試管苗的生長節律適度進行光照強度的調節,以促進優質壯苗的培育。