基于色澤與多指標成分分析的川明參質量快速評價研究

向緬，胡平，張美，林娟，周霞，楊玉霞，周先建

（四川省中醫藥科學院，四川 成都 610041）

0 引言

川明參（ChuanminshenviolaceumSheh et Shan）為傘形科川明參屬草本植物［1］，主要分布于四川，具有和胃生津、祛痰止咳、解毒等功效，現代研究發現川明參中多糖類、香豆素類、三萜類等化學成分具有化痰鎮咳、提升免疫、抗氧化等藥效［2-8］。

中藥材品質與有效成分、浸出物等指標密切相關［9-10］。目前，對中藥材品質的判斷主要依靠高精度儀器進行檢測［11］，或利用傳統藥材評價方法“辯證論質”［12］，前者經濟成本高，不利于推廣；后者依賴經驗判斷，存在主觀差異，具有一定局限性。近年已有大量文獻報道利用現代色彩分析技術以及國際照明委員會（CIE）的L*、a*、b*色空間系統描述藥材色澤［13-17］，發現色澤與中藥材質量間存在相關性，并基于色澤建立藥材品質快速鑒定體系，提高藥材質量判斷的準確性，但關于川明參藥材色澤與品質之間的相關性及藥材品質快速鑒定體系未見報道。本研究通過對川明參的色澤、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、多糖和歐前胡素質量分數的測定，分析各指標成分與色度值之間的相關性，建立快速準確鑒別川明參質量的方法，為川明參臨床用藥安全及可持續發展提供科學依據。

1 材料、試劑與儀器

1.1 樣品材料

川明參藥材樣本共32份，來自四川省不同地區，四川省中醫藥科學院楊玉霞研究員鑒定為傘形科川明參屬植物川明參（ChuanminshenviolaceumSheh et Shan）的干燥根，利用多功能粉碎機將其打粉，過4號篩備用，樣品信息如表1所示。

表1 川明參藥材樣品信息

1.2 試劑

D（+）-無水葡萄糖對照品（批號：MUST-19032905）、歐前胡素對照品（批號：MUST-22112807）購自成都曼斯特生物制品有限公司；硫酸購自成都科龍化學試劑廠；苯酚、三氯乙酸、95%乙醇購自成都金山化學試劑有限公司；甲醇、乙腈購自賽默飛世爾科技公司，均為色譜純；超純水為實驗室自制。

1.3 儀器

Agilent1290超高效液相色譜儀（Agilent公司，美國）；UV-1800紫外分光光度計（島津公司，日本）；KQ2200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9245A電熱鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；CM-5分光測色計（柯尼卡美能達中國投資有限公司）；BSA224S型電子分析天平（Sartouris股份有限公司，德國）；TDL-4A離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；BJ-150多功能粉碎機（德清拜杰電器有限公司）。

2 方法

2.1 川明參藥材粉末色澤測定

2.1.1 檢測條件

參考王曉宇等［16］、吉光見稚代等［17］的方法，打開分光測色儀，先校正，取川明參樣品粉末約2 g，平鋪于玻璃測色皿，360～740 nm波長測量，波長間隔10 nm，測量類型為反射測量，測定口徑3 mm，測定視角10°，觀察光源D65（自然日光，色溫度 6 504 K），測得色度值L*、a*和b*，其中，L*表示明亮度，值越大顏色越亮，值越小顏色越暗；a*表示紅綠色軸，值越大顏色越偏紅，值越小顏色越偏綠；b*表示黃藍色軸，值越大顏色越偏黃，值越小顏色越偏藍。

2.1.2 方法學考察

取川明參S4號樣品粉末，按2.1.1的條件連續測量6次，色度值L*、a*、b*的相對標準差（relative standard deviation，RSD）分別為0.43%、2.91%、1.53%，表明儀器精密度良好，方法穩定可行。

2.1.3 色澤測定

按照2.1.1的條件，分別測定樣品粉末的色度值L*、a*、b*值，每個樣品重復測3次，取平均值，并計算ΔE*值，ΔE*表示兩顏色間的色差，值越小色差越小，值越大色差越大。

2.2 川明參藥材浸出物質量分數測定

2.2.1 水溶性浸出物質量分數測定

依據《中華人民共和國藥典（四部）》［18］中的熱浸法進行川明參水溶性浸出物測定，稱取川明參粉末2 g，倒入錐形瓶中，加蒸餾水100 mL，稱質量，靜置1 h；接冷凝管，放入水浴鍋，100 ℃微沸1 h；冷卻后，再稱質量，補足減失質量并混勻，過濾，取25 mL，于蒸發皿105 ℃干燥至恒重。按照式（1）計算水溶性浸出物質量分數。

式中：ω1為浸出物質量分數，%；m1為蒸發皿與浸出物總質量，g；m2為蒸發皿質量，g；m為樣品質量，g。

2.2.2 醇溶性浸出物質量分數測定

參考2.2.1水溶性浸出物測定方法，將蒸餾水換成95%乙醇溶液，恒溫水浴鍋的溫度改為80 ℃，微沸時間變為2 h。

2.3 川明參藥材總多糖質量分數測定

2.3.1 對照品溶液的制備

精密稱取無水葡萄糖對照品25 mg，蒸餾水溶解得1 mg/mL葡萄糖對照品溶液。

2.3.2 樣品溶液的制備

精確稱量川明參粉末0.5 g，用50 mL蒸餾水回流提取3次，每次90 min；提取液合并混勻，將其過濾，并濃縮成50 mL，取5 mL濃縮液加入1 mL 30%三氯乙酸混勻，4 ℃放置過夜，4 000 r/min離心20 min；取1 mL上清液置于50 mL容量瓶中，蒸餾水定容，得樣品溶液。

2.3.3 測定條件

參考雷曉莉等［19-20］的方法，采用硫酸-苯酚法測定川明參總多糖質量分數，精密吸取2.3.1的葡萄糖對照品溶液和2.3.2的樣品溶液各2 mL于10 mL試管中，各加1.5 mL 5% 苯酚試劑，混勻，加入6 mL濃H2SO4，混勻放置5 min，沸水浴20 min，立即轉入冰盒冷卻至室溫，490 nm波長下測吸光度。

2.3.4 線性關系考察

參考雷曉莉等［18］的方法制備標準曲線，分別精密吸取0.1、0.3、0.5、1、2、2.5 mL對照品溶液于50 mL容量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，參考2.3.3條件在490 nm波長處測定吸光度，以吸光度（Y）為因變量，葡萄糖質量濃度（X）為自變量，得回歸方程Y=45.712X+0.129 4，r=0.999 3，線性關系良好。

2.3.5 精密度試驗

按2.3.3的方法測定葡萄糖對照品溶液吸光度，重復6次，其吸光度值RSD=0.22%，表明精密度良好。

2.3.6 穩定性試驗

取川明參S4號樣品溶液，按2.3.3的方法，分別于0、30、60、120、240 min測吸光度，得到RSD=0.51%，溶液顯色穩定性良好。

2.3.7 重復性試驗

精密稱取川明參S4號樣品0.5 g，共6份。按2.3.2的方法配制樣品溶液，按2.3.3的方法測定，計算多糖質量分數的RSD=1.09%，表明重復性良好。

2.3.8 回收率試驗

稱取0.25 g川明參S4號樣品粉末，加入葡萄糖標準品適量，按2.3.2的方法制備樣品溶液進行檢測，平均回收率為99.00%，RSD=2.84%，方法準確性良好。

2.3.9 川明參多糖質量分數測定

按2.3.2的方法制備樣品溶液，依據2.3.3的條件檢測多糖質量分數，并按照2.3.4所得線性回歸方程Y=45.712X+0.129 4計算多糖質量分數。

2.4 川明參藥材歐前胡素質量測定

2.4.1 對照品溶液制備

稱取歐前胡素對照品3.43 mg，加入1 mL甲醇溶解，并稀釋得857.5 μg/mL對照品溶液。

2.4.2 樣品溶液制備

精確稱取川明參粉末0.5 g，加入5 ml甲醇，稱質量，超聲（40 kHz、50 ℃）2 h，將其冷卻到室溫，再稱質量并補足減失質量，搖勻，上清液過0.2 μm微孔濾膜，即得樣品溶液。

2.4.3 色譜條件

Shim-packVelox C18色譜柱（2.7 μm，2.1×100 mm），流動相為甲醇-水（70∶30）；流速0.3 mL/min；檢測波長248 nm；柱溫30℃；進樣量1 μL。

2.4.4 線性關系考察

配制22.500、11.250、5.625、2.813、1.406、0.703、0.352、0.176 μg/mL的對照品溶液，按2.4.3的色譜條件，分別吸取1 μL對照品溶液測定峰面積，以進樣量（X）為自變量，峰面積（Y）為因變量，得回歸方程為Y=28 963X-5.360 5，r=0.999 7，線性關系良好。

2.4.5 精確度試驗

按2.4.3的方法吸取對照品溶液，連續進樣6次，歐前胡素峰面積的RSD=1.08%，說明該儀器精確度高。

2.4.6 重復性試驗

取川明參S4號樣品粉末6份，按2.4.2的方法制備樣品溶液，在2.4.3的條件下測定，歐前胡素質量分數的RSD=2.86%，說明該方法重復性良好。

2.4.7 穩定性試驗

按2.4.3的方法，分別于0、2、4、8、12、24 h吸取川明參S4號樣品溶液進樣，歐前胡素峰面積RSD=0.16%，樣品溶液在24 h內穩定。

2.4.8 加樣回收率試驗

精確稱取6份已知歐前胡素質量分數的川明參S4號樣品粉末0.25 g，每份加入質量濃度為0.29 μg/mL的歐前胡素對照品溶液5 mL，按2.4.2的方法配制樣品溶液，按2.4.3的條件進樣，平均加樣回收率為97.16%，RSD=0.56%，表明該分析方法準確性良好。

2.4.9 樣品歐前胡素質量分數測定

按2.4.2的方法配制川明參樣品溶液，在2.4.3的色譜條件下檢測，根據式（2）計算歐前胡素質量分數。

式中：W為歐前胡素質量分數，μg/g；A1為標準品峰面積；A2為待測樣品峰面積；C1為標準品溶液質量濃度，mg/mL；V1為待測樣品進樣體積，mL；m3為待測樣品質量，g。

2.5 結果與分析

2.5.1 川明參色澤測定結果分析

從表2可以看出，L*范圍為67.86～87.40，b*范圍為9.72～23.56，均為明顯正值；a*范圍為-0.66～4.71，大小在0左右，表明川明參藥材粉末顏色大多偏黃色或乳白色，且鮮亮，與表1中肉眼觀察顏色基本相符。

表2 川明參粉末色度值

2.5.2 川明參各成分質量分數

由圖1和式（2）得出歐前胡素的質量分數。

圖1 對照品（A）及S4號川明參樣品（B）超高效液相色譜（UPLC）圖

川明參的水溶性浸出物、醇溶性浸出物、多糖和歐前胡素的質量分數不一致（表3、表4），可能跟產地、采收期、儲存、運輸、加工方式等有關。

表3 川明參浸出物質量分數%

表4 川明參多糖和歐前胡素質量分數

2.5.3 川明參色度值與各成分質量分數相關性分析

利用IBM SPSS Statistics 26.0軟件對川明參色度值與各主要指標成分質量分數進行相關性分析，結果如表5所示。L*、ΔE*與醇溶性浸出物、水溶性浸出物和歐前胡素質量分數呈極顯著負相關（P<0.01），與多糖質量分數呈顯著負相關（P<0.05）；a*、b*與醇溶性浸出物、水溶性浸出物、歐前胡素質量分數呈極顯著正相關（P<0.01），與多糖質量分數呈顯著正相關（P<0.05）。表明L*及ΔE*的值越小，川明參各指標成分質量分數越高；a*與b*的值越大，各指標成分質量分數越高。由表5還可以看出，a*與各指標成分質量分數的相關系數較高，表明與川明參各指標成分相關性更顯著，因此選擇a*與各指標成分質量分數建立回歸方程。

表5 川明參粉末色度值與主要成分質量分數的相關性

2.5.4 色度值a*與各指標成分質量分數建立回歸方程

以川明參各主要成分質量分數（醇溶性浸出物質量分數（X1）、水溶性浸出物質量分數（X2）、歐前胡素質量分數（X3）、多糖質量分數（X4））為自變量，a*作為因變量，得到模型1；同時以川明參a*為自變量，分別以醇溶性浸出物、水溶性浸出物、歐前胡素及多糖質量分數作為因變量，得到模型2、3、4和5，回歸分析結果如表6所示，方差分析結果如表7所示，回歸系數結果如表8所示。

表6 回歸分析結果

表7 方差分析結果

表8 回歸系數結果

由表6可知，川明參醇溶性浸出物、水溶性浸出物、歐前胡素及多糖質量分數作為自變量時，a*有75.6%受這4個指標成分影響；當川明參a*為自變量時，醇溶性浸出物、水溶性浸出物、歐前胡素和多糖質量分數受a*影響分別為32.8%、36.5%、67.3%和13.8%。由表7可看出，模型1回歸方程顯著性F值為20.866，顯著性Sig.為0.000 1<0.01，表明模型1回歸方程極顯著（P<0.01）；同樣可看出，模型2、3、4回歸方程極顯著（P<0.01），模型4回歸方程顯著（P<0.05）。由表8看出，模型1回歸方程式為Y（a*）=-0.104-0.201X1+0.069X2+13.353X3-0.018X4，川明參醇溶性浸出物、歐前胡素質量分數與a*的回歸系數極顯著（P<0.01），水溶性浸出物質量分數與a*的回歸系數顯著（P<0.05），多糖質量分數與a*的回歸系數不顯著（P>0.05）；模型2、3、4、5回歸方程式分別為Y（醇溶性浸出物質量分數）=2.164+1.822X，Y（水溶性浸出物質量分數）=25.616+3.9X，Y（歐前胡素質量分數）=-0.033+0.065X，Y（多糖質量分數）=10.242+0.762X，醇溶性浸出物、水溶性浸出物及歐前胡素質量分數與a*的回歸系數極顯著（P<0.01），多糖質量分數與a*的回歸系數顯著（P<0.05）。

3 結束語

近年來針對川明參的研究多集中在其化學成分、藥理藥效及臨床應用等方面，關于藥材質量鑒定評價的研究涉及較少，藥材品質優劣及藥效是多個組分協同的結果，單一指標成分含量難以客觀反映中藥材品質，中藥材綜合品質如何評價已成為中醫藥重大科學難題。當下中藥材鑒定多以外觀性狀觀察區分為主，無客觀量化指標，有一定局限性。本研究利用分光測色儀客觀量化川明參藥材色澤，并與多個品質指標進行相關性研究，結果顯示川明參色度值與醇溶性浸出物、水溶性浸出物、歐前胡素及多糖質量分數均存在顯著相關性，色度值對各指標成分有一定影響，一定條件下色澤偏黃且鮮亮的川明參藥材的指標成分質量分數越高，藥材質量越優，色澤可作為川明參藥材品質評價依據之一。其中色度值a*對醇溶性浸出物、水溶性浸出物、歐前胡素和多糖質量分數的影響程度各32.8%、36.5%、67.3%和13.8%，對歐前胡素質量分數的影響最顯著，可通過色度值a*初步判斷川明參藥材綜合品質優劣，此方法簡單易操作，同時可減少主觀經驗判斷誤差。另外，試驗所有樣品均來自四川省金堂、都江堰、巴中等道地產區，大多數藥材為市場購買，針對非道地產區的藥材，以及前期藥材不同加工處理條件，需要進一步擴充研究，為通過色澤初步預測川明參藥材品質的快速鑒別方法提供科學依據，也為后期川明參的開發利用奠定基礎。