西昌某奶牛場乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗

楊克利，周美琪，張濤，鄒宏，何曉露，韋漢群，張文麗，郝桂英*

（1.西昌學院動物科學學院，四川 西昌 615013；2.涼山彝族自治州農業科學研究院，四川 西昌 615000；3.西昌市農業農村局，四川 西昌 615000）

0 引言

奶牛乳房炎（bovine mastitis）是奶牛乳腺組織受到物理、化學因素刺激或病原微生物感染后發生的炎癥反應，是奶牛常見的一種多發性疾病。該病可導致奶牛產奶量下降，影響乳制品品質，嚴重時可使奶牛泌乳機能喪失，最終使患牛淘汰，給奶牛養殖業造成巨大的經濟損失［1］。

引起奶牛乳房炎的病原菌達150余種，其中肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumonia）是腸桿菌科、克雷伯菌屬中常見的致奶牛乳房炎環境病原菌之一，其引發的乳房炎癥狀尤為嚴重，具有發病急、死淘率高、產奶量大幅下降、抗生素治療效果不佳等特點［2］。我國黑龍江、遼寧、山東、河南［3］、甘肅［4］、寧夏［5］、江蘇［6］、陜西［7］、上海［8］、廣東、安徽、山西、浙江［9］、河北［10］、內蒙古［11］、四川［12］、湖北［13］、云南［14］和湖南［15］多地均有從奶牛乳房炎病例或生牛乳中分離到該菌的報道，并且其造成的全身性感染甚至可以導致奶牛的急性死亡［16］。因此，肺炎克雷伯菌引起的動物感染及其潛在的公共衛生安全危害引起了科研人員越來越多的關注。

2023年4月，四川省涼山彝族自治州西昌市某奶牛場有3頭奶牛在產后7 d內出現了以乳房炎為主要特征的癥狀，病牛精神沉郁、喜臥、體溫升高、食欲不佳、呼吸加快、流少量濃稠鼻涕、排淡黃色稀便。觸摸其乳房有硬塊，乳房或乳頭腫脹，乳汁呈水樣，部分乳中帶血。癥狀嚴重的1頭奶牛在發病第2 天死亡。對死亡奶牛進行剖檢，可見肺臟、肋胸膜出血，肝臟、脾臟出血，真胃黏膜、腸黏膜出血，空腸有水樣黃色內容物。為查明導致該病發生的主要致病菌，本研究對該奶牛場發病未死亡的2頭奶牛的乳樣進行了細菌的分離培養和鑒定、藥敏試驗等，以期為該奶牛場科學防治奶牛乳房炎提供依據。

1 材料與方法

1.1 乳樣

采集西昌某奶牛場經臨床診斷為乳房炎的奶牛乳樣2份。清洗消毒病牛乳頭，棄去前3把奶，采集20~30 mL乳汁于滅菌離心管中，標記好采樣日期、牛號后置于帶冰盒的采樣箱內，迅速帶回實驗室4 ℃保存，24 h內分別進行細菌培養。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：麥康凱瓊脂培養基、營養瓊脂培養基、營養肉湯、革蘭氏染色試劑均購自北京索萊寶科技有限公司；細菌微量生化管、藥敏紙片（恩諾沙星、諾氟沙星、紅霉素、頭孢比肟、頭孢他啶、妥布霉素、氨芐西林、慶大霉素、阿莫西林和新霉素）均購自杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；2×Easy Taq PCR Super Mix、Trans2K DNA Marker、GelStain核酸染料購自北京全式金生物科技有限公司。

主要儀器：超凈工作臺（SJ-CJ-2D型，蘇潔醫療器械（蘇州）有限公司）；高速冷凍離心機（5810R，eppendorf）；PCR儀（Nexus GSX，eppendorf）；凝膠成像系統（Molecular Imager?Gel DocTMXR+，BIORAD）；核酸電泳儀（JY600E，北京君意電泳儀科技有限公司）；恒溫生化培養箱（LRH-250，上海一恒科學儀器有限公司）；顯微鏡（Motic BA200，麥克奧迪實業集團有限公司）。

1.3 實驗動物

體質量15~20 g的小白鼠8只，供致病性試驗使用。

1.4 細菌的分離純化

將1.1采集的2份待檢乳樣在超凈工作臺中分別取1 000 μL到滅菌的EP管中，8 000 r/min離心3 min，棄去上層800 μL液體，將剩余的乳液混勻后，吸取上述混懸液分別接種到麥康凱瓊脂培養基上，37 ℃培養24 h后觀察菌落生長情況［7］。挑取疑似菌落進行革蘭氏染色，觀察菌體形態及染色特性；然后挑取疑似單菌落接種于營養肉湯中純化培養。

1.5 生化鑒定

將純化培養后的菌液分別接種于葡萄糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露醇、硫化氫、尿素、枸櫞酸鹽、尿素酶生化管以及氧化酶試紙，37 ℃培養24 h，觀察其生化反應特性［13］。

1.6 分子生物學鑒定

1.6.1 細菌DNA的提取

無菌條件下吸取1.4中純化培養的菌液1 mL，10 000 r/min離心1 min，棄去上清液，參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌基因組DNA。

1.6.2 PCR檢測及送檢測序

先用khe基因特異性引物［5］進行PCR檢測，再用細菌16S rRNA通用引物對有目的條帶的陽性菌株進行PCR擴增。

khe基因引物序列分別為khe-F：5'-ATG AAA CGA CCT GAT TGC ATT CGC-3'，khe-R：5'-TTA CTT TTC CGC GGC TTA CCG TC-3'。16S rRNA通用引物序列分別為：27F：5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'，1492R：5'- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。引物序列均由生工生物工程（成都）股份有限公司合成。

PCR反應條件：（1）khe基因：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性25 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸5 min。目的條帶約480 bp。（2）16S rRNA基因：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環；72 ℃延伸5 min。目的片段約1 500 bp。ddH2O作陰性對照。

PCR擴增產物分別用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，待電泳結束后，通過凝膠成像系統觀察電泳結果。將PCR陽性產物送生工生物工程（成都）股份有限公司進行雙向測序。

1.6.3 序列分析

通過BLAST軟件比對確定待測細菌，同時檢索GenBank收錄的肺炎克雷伯菌khe基因序列和肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌（Klebsiellaoxytoca）與大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）16S rRNA基因序列并下載，用DNAstar中的MegAlign程序進行序列同源性分析。

1.7 藥敏試驗

采用K-B瓊脂平板擴散法對分離純化的菌株進行藥敏試驗。將純化培養的菌液加到營養瓊脂培養基上并涂布均勻，在超凈工作臺內晾2 min后，用鑷子無菌取藥敏紙片放置在涂布好細菌的培養基上，不同紙片相距15~20 mm。37 ℃培養24 h后用直尺測量抑菌圈的直徑，記錄數據。

依據馬越等［17］的報道結果判定分離菌對抗菌藥物的敏感性：抑制圈>15 mm為高度敏感（S）；抑制圈10~15 mm為中度敏感（I）；抑制圈<10 mm為耐藥（R）。

1.8 小鼠致病性試驗

將分離純化的菌株菌液濃度調節約為1×108CFU/mL，每株菌接種4只小白鼠，腹腔注射0.2 mL/只，對照組小白鼠接種營養肉湯0.2 mL/只。每天觀察小鼠的臨床癥狀，記錄死亡數，72 h后處死全部存活小鼠。無菌采集心臟、肝臟、脾臟用于分離細菌，對分離菌進行染色、鏡檢、生化試驗，并使用肺炎克雷伯菌khe基因特異性引物進行分子鑒定。

2 結果與分析

2.1 肺炎克雷伯菌的菌落形態

從2份乳樣中分離到1株疑似肺炎克雷伯菌菌株，命名為XC1分離菌株。菌株在麥康凱瓊脂培養基上形成粉紅色、圓形、光滑、邊緣整齊、濕潤、黏稠的菌落（圖1），用接種環挑取菌落有明顯的拉絲現象，與高興等［18］報道的肺炎克雷伯菌菌落形態相似。

圖1 麥康凱培養基上的菌落

2.2 肺炎克雷伯菌的菌體形態

鏡檢菌體為革蘭氏陰性的粗短桿菌，呈單個、成對或短鏈狀排列（圖2），與田維嘉［19］報道的肺炎克雷伯菌菌體形態相似。

圖2 革蘭氏染色的菌體（×1 000倍）

2.3 肺炎克雷伯菌的生化鑒定

分離菌株發酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖和甘露醇，產酸或產酸產氣；分解尿素；不產生硫化氫；枸櫞酸鹽、氧化酶陰性；尿素酶陽性。與劉冬霞［20］報道的肺炎克雷伯菌生化結果基本一致。

2.4 肺炎克雷伯菌的分子生物學鑒定

電泳結果顯示，XC1分離菌株可擴增出khe基因目的條帶，與預期目的片段大小基本一致（圖3）。

圖3 肺炎克雷伯菌khe基因PCR電泳結果

XC1分離菌株及接種小白鼠心臟中分離的菌液（XC1-1菌液）、肝臟中分離的菌液（XC1-2菌液）、脾臟中分離的菌液（XC1-3菌液）的khe基因測序序列長度均為454 bp，核苷酸同源性為100%，與肺炎克雷伯菌參考序列同源性為99.6%~99.8%（圖4）；XC1分離菌株16S rRNA基因測序序列長度為1 411 bp，與肺炎克雷伯菌參考序列同源性為99.7%~100%，與產酸克雷伯菌（K.oxytoca）參考序列同源性為97.1%~98.1%，與大腸埃希氏菌（E.coli）參考序列同源性為96.5%（圖5）。因此，khe基因和16S rRNA基因均確定XC1分離菌株為肺炎克雷伯菌。

圖4 肺炎克雷伯菌khe基因序列同源性比對結果

圖5 肺炎克雷伯菌16S rRNA基因序列同源性比對結果

2.5 藥敏試驗結果

XC1分離菌株對恩諾沙星、諾氟沙星、頭孢比肟和頭孢他啶高度敏感；對妥布霉素、慶大霉素和新霉素中度敏感；對紅霉素、氨芐西林和阿莫西林耐藥（表1）。

表1 藥敏試驗結果

2.6 小鼠致病性試驗

XC1分離菌株組小白鼠在接種第1天出現精神沉郁、蜷縮一角；第2天出現腹瀉、排血便；第3天全部死亡。剖檢發現死亡小白鼠胸腔有積液，肝臟出血，腸臌氣，直腸末端有血液。對照組小白鼠精神正常，全部存活。剖檢無明顯病變。

感染小鼠心臟、肝臟、脾臟等組織中分離的細菌為革蘭氏陰性、較粗短的直桿菌，生化試驗結果與XC1分離菌株一致，PCR檢測均在約480 bp處出現特異性條帶（圖3）。對照組未分離出細菌。小鼠致病性試驗表明XC1分離菌株具有較強的毒力。

3 討論與結論

3.1 討論

牛群品種、飼養管理、地域環境、季節氣候等的不同，會影響奶牛乳房炎的發生率以及病原菌種類。肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae）作為我國常見的奶牛乳房炎環境性致病革蘭氏陰性菌之一，不同地方分離率有差異。Gao等［3］報道黑龍江、遼寧、河北、山東、河南、天津、北京等21省161個大型奶牛場（>500頭）K.pneumoniae平均分離率為13.0%；馮小慧等［8］報道上海和河北患病牛乳K.pneumoniae分離率分別為18%（18/100）和14%（14/100）；曹菲菲等［9］報道福建、江蘇、廣州、河北、安徽、山西、內蒙古、浙江等地區的11個規?；翀鯧.pneumoniae平均分離率為14.55%（119/818）；Gao等［21］報道我國13省123個奶牛場臨床型乳房炎奶樣K.pneumoniae平均分離率為51.5%（124/241）；He等［22］報道山東、黑龍江和河北3家規?；膛雠R床型乳房炎奶樣K.pneumoniae平均分離率為2.9%（183/6301）；石玉祥等［10］報道河北某大規模奶牛場K.pneumoniae分離率為18.4%（45/245）；Cheng等［23］報道中國南北部2個奶牛場K.pneumoniae平均分離率為27.0%（365/1 354）；Yang等［24］報道江蘇、山東生乳K.pneumoniae分離率分別為7.8%（65/830）和0.4%（1/233）；吳香云［13］報道湖北省5個奶牛場K.pneumoniae平均分離率為26.9%（239/887），臨床乳房炎和隱性乳房炎牛乳K.pneumoniae分離率分別為25.4%（35/138）和24.5%（12/49）；高興等［18］報道全國大型規?；翀鋈榉垦啄虡覭.pneumoniae分離率約11%（212/2 000），說明全國各地奶牛場的衛生防護措施參差不齊。

奶源安全問題是食品安全問題的重中之重，受到人們的廣泛關注。乳汁微生物鑒定常被認為是乳房炎診斷的“金標準”，但肺炎克雷伯菌與大腸埃希氏菌形態相似，難以區別。由于khe基因只在肺炎克雷伯菌中檢出，因此，khe基因可作鑒定該菌的特異性基因［5］。16S rRNA基因由于片段大小適中，能體現出不同種屬細菌間的差別，現常應用于細菌分類鑒定。因此，本試驗通過細菌形態學觀察、生化鑒定、分子生物學鑒定、小鼠致病性試驗等對分離菌株進行鑒定，確定該場奶牛乳房炎與肺炎克雷伯菌感染有關，這與張明國等［25］、周國燕等［12，26］的研究結果不完全一致，這些研究認為葡萄球菌為涼山州奶牛乳房炎優勢菌。藥敏試驗結果顯示，XC1分離菌株對頭孢比肟、恩諾沙星、諾氟沙星和頭孢他啶4種藥物敏感，對紅霉素、氨芐西林和阿莫西林3種藥物耐藥。近年來，各地區奶牛乳房炎源K.pneumoniae耐藥率和耐藥譜均存在差異，甚至出現多重耐藥的現象［27-28］。張穎欣等［2］報道國內13省耐藥型K.pneumoniae流行率約為13.7%。曹菲菲等［9］報道分離自奶牛乳房炎的119株K.pneumoniae對氨芐西林的耐藥率達到了94.96%。He等［22］報道分離自奶牛乳房炎的183株K.pneumoniae對復方新諾明的耐藥率均在90.0%以上，顯著高于其他藥物的耐藥率（25.0%以下）；對多西環素中等耐藥（15.4%～25.0%）；對慶大霉素、氟苯尼考、環丙沙星、頭孢曲松、替加環素、阿莫西林/克拉維酸鉀和卡那霉素表現出較低水平耐藥（1.0%～7.7%），其中環丙沙星、替加環素、阿莫西林/克拉維酸鉀和卡那霉素維持在1.0%左右的低耐藥率，而對美羅培南和多黏菌素尚未耐藥。K.pneumoniae可產生水解頭孢菌素的超廣譜β-內酰胺酶，且編碼基因可以通過質粒分布在奶牛場的細菌中［29］，為臨床治療K.pneumoniae引起的奶牛乳房炎帶來困難。因此，在生產中應積極開展肺炎克雷伯菌的分子流行病學調查，及時監控該菌的流行趨勢。在臨床治療中，應加強對該菌耐藥性的監測，規范治療流程，減少抗生素的誤用和濫用，從而減少耐藥菌株的產生和傳播，以免引起公共衛生安全危害。

3.2 結論

本研究通過細菌形態學觀察、生化試驗、分子生物學方法對乳房炎乳樣進行細菌分離鑒定，分離出1株肺炎克雷伯菌，命名為XC1分離菌株；小鼠致病性試驗表明XC1分離菌株具有較強的毒力，證明該場奶牛乳房炎與肺炎克雷伯菌感染有關。藥敏試驗結果表明XC1分離菌株對臨床常用的抗生素存在不同程度的耐藥性，其中對紅霉素、氨芐西林和阿莫西林耐藥。研究結果可為該奶牛場防治乳房炎提供參考。