原生質體形成及融合因素分析

常玉廣,金 露

(南京曉莊學院 環境科學學院,江蘇 南京 211171)

在微生物細胞融合技術中,原生質體可以經過溶菌酶處理而制備,在高滲條件下通過聚乙二醇(PEG)促融,使具有不同優良性狀的2株菌通過破壁、促融,將2個優良性狀集中于一種微生物內[1]。其中原生質體產率是一個重要指標,如何讓原生質體再生的細胞,在普通的培養基上生長繁殖也是重要一環,不同微生物的原生質體最適再生條件存在著一定差異。另外,原生質體具有再生成細胞的活力才可以使它的子代進行遺傳。測定原生質體形成率和再生率可以作為檢驗、改善原生質體分離和再生條件的影響因素[2],也是分析融合實驗結果、改善融合條件的一個衡量指標。

細胞融合技術不僅為基因調控、遺傳互補、腫瘤發生、基因定位、衰老控制等理念領域的研究提供了有力的手段,而且在遺傳學、免疫醫學以及醫藥、食品、環保等方面都有廣泛的應用價值。從1974年發現的高效融合劑(聚乙二醇)使不同科屬的植物原生質體之細胞融合技術開始,PEG在細胞融合領域取得了可喜的成績,具有重要的實用性意義[3]。本研究在已有的高效絮凝菌研究基礎上[4],利用細胞融合技術,期望獲得具有更高絮凝能力的新型絮凝菌,以此作為后續絮凝菌絮凝性狀的基礎研究。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

絮凝菌主要來源于含油廢水處理單元曝氣池中的水樣,芽孢桿菌屬(Bacillussp.),兩例菌均為哈爾濱工業大學環境生物技術實驗室開發[5],菌種生理及生化特征參見文獻[6]。

1.2 實驗方法

1.2.1 原生質體形成及再生的培養

1.2.1.1 溶菌酶處理前總菌數的測定

挑取青霉素處理后具有抗性單菌落于液體培養基中振蕩培養至光密度(OD)值0.3～0.5[7];取活化的菌液0.5 mL,用生理鹽水稀釋成10-5、10-6、10-7的菌液,各取1 mL稀釋液(每個稀釋度做3個重復),涂布于完全培養基上,于30 ℃培養24 h,計數溶菌酶處理前的菌數,即為原菌計數。

1.2.1.2 溶菌酶處理后剩余菌數的測定

將溶菌酶處理后的含原生質體懸浮液1 mL,用無菌水稀釋,使原生質體裂解死亡,取稀釋成10-2、10-3、10-4的菌液各0.1 mL,涂布于完全培養基平板上。于30 ℃培養48 h,計算酶解后未形成原生質體的數量。

1.2.1.3 原生質體再生菌數的測定

雙層培養法:先倒高滲再生固體培養基在培養皿底層,取1 mL溶菌酶處理后的含原生質體懸液,用高滲溶液作稀釋劑,稀釋成10-3、10-4、10-5的菌液各取1 mL,加入底層平板中央,再倒入高滲再生半固體培養基混合。于30 ℃培養48 h,計數原生質體形成數量和未形成原生質體的菌數之和。

1.2.2 原生質體形成率及再生率

將原生質體形成率與再生率作為融合子形成率的衡量尺度,具體計算公式如下:

原生質體形成率=(A-B)/A×100%

(1)

原生質體再生率=(C-B)/(A-B)×100%

(2)

其中:A為溶菌酶處理前的菌數,即為原菌計數;B為未形成原生質體的菌落數;C為形成的原生質體與未形成原生質體的菌數之和[8];A-B原生質體形成數;C-B原生質體再生數。

1.2.3 原生質體的融合時間篩選

取制備好的原生質體,進行原生質體融合實驗[9-10],以此來確定原生質體融合PEG的最佳濃度和作用時間。

2 結果與討論

2.1 溶菌酶處理前總菌數的測定

測定溶菌酶處理前的菌液數量,通過計算原生質體形成率以及再生率,檢測菌液的生長活性。因為菌液的活性直接影響制備的原生質體生長活性,同時影響原生質體的再生能力。所以,菌液的活性是原生質體再生的一個重要因素。從表1可知,稀釋不同濃度的菌液的細菌總數測定趨于一致,F2菌種的總平均數為1680×105個,F6菌種的總平均數為1835×105個。說明在同一條件下,絮凝菌的生長狀況較穩定,有利于在溶菌酶的作用下形成良好的原生質體。

2.2 溶菌酶處理后剩余菌數的測定

細胞通過溶菌酶處理后,存在原生質體和未形成原生質體的細胞。通過對剩余菌落數量的測定,來確定融合處理時的原生質體濃度,剩余細胞數量相對少,則原生質體形成率高,說明溶菌酶的作用效果相對較好。因此,分析溶菌酶處理后剩余菌數,形成原生質體形成率的一個指標,精準判斷細胞融合率。由表2可知,溶菌酶處理后的細胞數量相對菌液細胞數量少,F2總平均數為462×102個,F6總平均數為662×102個,表明溶菌酶處理細胞后得到的原生質體細胞數量相對多。鑒于對溶菌酶處理的菌體細胞形態分析,溶菌酶的處理效果較好,因此,以上數據反應了較好的處理效果。

表2 F2和F6溶菌酶處理后剩余細胞總數

2.3 原生質體再生數的測定

將溶菌酶處理后的溶液再經過純化后的原生質體涂布于再生培養基上,觀察發現原生質體再生成菌落的速度相對較慢,一般菌株在30 ℃下培養,需1～2 d能夠生長出菌落,而原生質體再生至少需要3～5 d才能長出菌落,一周左右細胞能夠成熟,這是原生質體再生過程的延緩現象。

測定原生質體再生數目,是檢測細胞活性、原生質體活性、細胞再生能力的重要參考因素,有利于判斷在該條件下的原生質體細胞融合的能力。由表3可知,F2的原生質體與未形成原生質體再生總數約為756×103個,F6的原生質體與未形成原生質體再生總數約為756×103個。該數量完全滿足細胞融合的需要,也是細胞融合成功的重要前提條件。

表3 F2和F6的原生質體與未形成原生質體再生總數

根據數據計算可知,F2原生質體的形成率99.97%,F6原生質體形成率99.96%,前期青霉素的預處理效果好,溶菌酶的作用時間與作用量的測定為最佳值[1]。盡管如此,原生質體的再生率相對較低,F2原生質體再生率0.4225%,F6原生質體再生率0.5423%。在本實驗中,盡管再生率比率相對低,但再生的細胞數目仍然可觀,足夠可以進行細胞融合。

2.4 原生質體融合PEG最佳作用濃度和時間

聚乙二醇(PEG)是乙二醇的多聚化合物,存在一系列的不同分子量的多聚體。PEG可與水分子借氫鍵結合,在高濃度的PEG溶液中自由水消失,導致細胞脫失而發生質膜結構的變化,從而引起細胞融合。為了發揮PEG促進細胞融合效力,必須采用較高濃度(30%～50%,分子量為6000),但PEG在高濃度下,細胞可能因脫水而受到顯著的破壞。因此,選擇合適的分子質量、濃度及作用時間是PEG融合技術的關鍵。PEG誘導細胞融合由于具有容易制備和控制、活性穩定、使用方便等特點,在細胞融合領域取得了可喜的成績,大量研究仍采用此法[11]。

PEG作用的最佳濃度和時間如表4所示。PEG的濃度設置從20%～60%,時間從10～120 min范圍,37 ℃條件下反應。由數據顯示,在反應10 min時,PEG的濃度為30%和40%融合效果最好,考慮到PEG會引起細胞脫水而受到破壞因素,選擇30%濃度為本次實驗的最佳值。其次,作用時間對絮凝微生物的原生質體融合具有一定的影響效果,通過顯微鏡觀察,確定PEG最佳作用時間,原生質體在促融劑聚乙二醇作用下促融和,PEG作用時間在20～120 min范圍時長出融合子逐漸減少,原因可能是PEG本身有毒性,作用時間過長導致原生質體失活,會影響融合子的生成無法再生,是對細胞有毒害[11]。所以10 min時的促融合效果更好,而且時間短,效率高,是實驗的最佳選擇。因此,確定了PEG最佳作用時間為10 min。

表4 PEG作用濃度和時間的選擇試驗

3 結 論

通過前期青霉素的預處理、溶菌酶的作用時間與作用量的測定,確定的最佳值得到的原生質體,原生質體的形成率高達99%左右,而原生質體的再生率在0.5%左右,原生質體的再生率相對較低,這種現象在眾多的細胞融合實驗中是一個很難解決的難題。在本實驗中,為了細胞融合達到理想的目標,對原生質體融合PEG最佳濃度和作用時間進行了篩選,PEG最佳濃度是30%,細胞融合的最佳作用時間為10 min。上述實驗數據旨在研究絮凝微生物的細胞融合,為改善絮凝微生物在水處理中的絮凝效果,需繼續完善細胞融合的研究。