超氧化物歧化酶1 基因與果蠅壽命和攀爬能力的關系

石玉霞，曹旭婷，朱凱，耿磊，陳冬生

（安徽師范大學生命科學學院，蕪湖 241000）

超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1,SOD1）普遍存在于需氧生物體內是一種結合Cu/Zn的酶，該酶的主要功能是催化超氧化物并在過氧化氫酶的作用下將有毒物質轉化為氧氣和水[1]。氧化自由基（reactive oxygen species, ROS）是呼吸作用產生的一類超氧自由基且該物質的過度積累會引發細胞的損傷，最終引起生物體的衰老[2]。SOD1 作為生物體內抗氧化酶系的重要成員，其通過與超氧陰離子直接結合將自由基（ROS）氧化成H2O2，從而維持細胞內適宜的ROS 濃度，進而達到保護機體的作用[2‐3]。

果蠅，又稱黑腹果蠅隸屬于昆蟲綱雙翅目果蠅科，其發育方式屬于完全變態發育，主要包括四個時期，即：卵→幼蟲→蛹→成蟲。果蠅具有遺傳背景清晰、易培養、繁殖快等優點，為衰老的研究提供了便利[4]。此外，果蠅基因高度保守，為人類衰老與發育生物學研究提供了一個理想的模型[5‐6]。

衰老是生物體內基因和環境共同決定的一種生理現象，壽命是衡量衰老最直觀、確切的指標，同一物種的最長壽命相差不大[7‐8]。改變果蠅所處條件可以不同程度的延緩或加速衰老的進程，例如降低溫度（20 ℃）培養可延長果蠅壽命，而提高溫度（29℃）會加速衰老、縮短果蠅壽命[9]。目前關于衰老的假說主要有氧化自由基學說、端粒學說、免疫學說等[10‐11]。本研究主要涉及氧化自由基學說，該學說闡述了細胞內的氧化因子（如ROS）和抗氧化因子（如SOD1）含量不平衡時，會導致前者的積累，進而引起各種生物大分子氧化損傷，最終導致個體的衰老乃至死亡[12‐13]。

已有研究表明，SOD1 基因sod1在真核生物中高度保守[14]，該基因與多種疾病相關，如肌萎縮側索硬化、帕金森病、唐氏綜合癥[15‐17]。但目前關于sod1基因調控衰老的報道較少。本研究以果蠅為實驗材料，通過下調或上調sod1的表達，統計果蠅的壽命，測量其攀爬能力，以揭示sod1與衰老及運動能力之間的相關性，希望為人類衰老機制的研究提供有價值的分子資料。

材料與方法

1 果蠅品系

購自Bloomington Drosophila Stock Center：野生型W1118(Bloomington 3605)；轉基因DNA（定點插入）工具株：{y1 v1P{nos-phiC31int.NLS}X;P{-CaryP}attP40（Bloomington 25709）；gal工具株：tub-gal4(Bloomington 5138)、tub-gal80ts(Blooming‐ton 7019)；購自清華果蠅RNAi 品系庫：sod1-RNAi-THattp2（THU 3207）；實驗室自制轉基因果蠅：ATBsod1P4K-GFP-sod1-3’UTR;UAS-attB-sod1-3’UTR。

2 實驗試劑及儀器

DNA Polymeras、溴化乙錠（EB）、DNA 純化試劑盒、LB 固（液）體培養基、膠回收試劑盒、酚/氯仿、氨芐青霉素、dNTP（10 mmol/L）、RNase A酶、普通DNA 產物純化試劑盒等；體視顯微鏡、離心機、PCR 擴增儀、恒溫水浴鍋、恒溫箱、搖床、紫外分光光度計、Sutter P97 拉針儀、顯微注射儀、酶標儀、熒光顯微鏡等。

3 果蠅重組載體構建

使用Sequence Builder 軟件設計ATB-sod1P4KGFP-sod1-3’UTR、UAS-attB-sod1-3’UTR引 物（表1）并由生物公司合成；利用PCR 擴增分別獲得目的基因sod1、3’UTR、GFP、sod1-P4K；再利用重疊PCR 獲得基因片段sod1‐3’UTR、GFP-sod1-3’UTR；經過PCR 產物純化、DNA 與載體同時酶切、連接、菌液PCR、小提質粒等步驟獲得以上兩個重組質粒；最后，對質粒進行酶切鑒定及生物公司測序驗證構建成功后方可留種保存或繼續實驗。

表1 PCR 所用引物Tab. 1 Primers for PCR

將鑒定成功的質粒菌液用含有氨芐的LB 液體培養基過夜培養，再利用大提質粒的方法，提取高濃度、高純度的質粒。

4 制備轉基因果蠅

通過顯微注射方法將得到的2 個質粒載體，分別注射于工具果蠅（y1 w*P{nos--phiC31int.NLS}X;PBac{y+-attP-3B}VK00040，BDSC: 35568）新產的卵中。注射結束后的卵置于涂有酵母的平板中，然后將平板放于25 ℃恒溫箱培養2 d 左右，待卵發育成蠕蟲狀態，將其轉移至攪碎的培養基中培養。最后，將其成蟲與工具果蠅（w;sp/Cyo;bam△86/TM3）雜交，后代眼色為橘黃色的果蠅即為轉基因果蠅。

5 免疫組織化學染色

將ATB-sod1P4k-GFP-sod1-3’UTR轉 基 因 果 蠅腸道剖出并經過固定、漂洗、封閉后加入含有GFP抗體的溶液置于4 ℃冰箱搖床搖晃過夜；第2 d 將組織經漂洗后加入被熒光標記的二抗溶液避光搖床搖晃3 h；而后對二抗進行漂洗，最后將組織壓片后在熒光顯微鏡下觀察、拍片。

6 果蠅雜交

將tub-gal80ts；tub-gal4果蠅與UAS-sod1-RNAi-THattp2果蠅雜交，后代基因型tub-gal80ts；tubgal4＞UAS-sod1 RNAi即為全身性敲低sod1基因的果蠅；將UAS-attB-sod1-3’UTR轉基因果蠅與tubgal4果蠅雜交，后代表型為長毛的即為全身性過表達sod1基因的果蠅。

7 果蠅壽命統計和爬行能力的檢測

收集羽化48 h 內的果蠅并將其轉移至新的培養基中培養（培養溫度：29 ℃），之后每2 d 為果蠅更換新的培養基，并記錄在此期間死亡的果蠅只數和死亡的天數，直至所有果蠅死亡；在壽命統計的第10 d、20 d 和30 d 分別進行運動能力測試，實驗步驟為：首先，在距離果蠅管子底部5 cm 處標記刻度線，隨后將20 只果蠅轉入空管中并震蕩管壁，使果蠅全部落于管底，最后記錄15 s 內爬過 5 cm 刻度線的果蠅只數并計算出其所占百分比；將所得壽命、運動能力數據輸入到軟件Graph prism 8 中，最后生成生存曲線圖、平均壽命柱狀圖及運動能力曲線圖。

結 果

1 重組載體構建與轉基因果蠅制備

首先，PCR 擴增分別得到目的基因sod1（462 bp）、3’UTR（272 bp）、GFP（714 bp）（圖1A）和sod1基因4 kb 啟動子（sod1P4k）（圖1B）。利用重疊PCR 擴增得到sod1-3’UTR（734 bp）、GFPsod1-3’UTR（1448 bp）（圖1C）。片段純化后與載體（UAS和ATB）酶切，經連接、轉化獲得UASsod1-3’UTR和ATB-sod1P4k-GFP-sod1-3’UTR兩 種果蠅轉基因載體。重組載體經測序確認構建成功，經顯微注射獲得兩種轉基因果蠅品系。

圖1 PCR 擴增目的基因。A，PCR 擴增sod1 編碼區、3’非翻譯區和GFP 編碼區；B，PCR 擴增sod1 4kb 啟動子；C，重疊PCR 擴增sod1‐3’UTR、GFP‐ sod1‐3’UTRFig. 1 The target gene was amplified by PCR. A, PCR amplification of sod1, 3’UTR, GFP; B, PCR amplification of sod1P4K; C, overlap PCR amplifi‐cation of sod1‐3’UTR、GFP-sod1-3’UTR

2 sod1 表達產物在細胞質中高表達

轉 基 因 果 蠅ATB-sod1P4k-GFP-sod1-3’UTR細胞中GFP基因與sod1為融合表達，取轉基因果蠅的腸道，采用GFP 蛋白抗體對果蠅腸道進行免疫熒光染色并拍照。利用GFP 特異性追蹤sod1表達產物的亞細胞定位，同時通過DAPI 染色定位細胞核。結果所示，sod1表達產物僅在細胞質中高表達，在細胞核中不表達（圖2）。sod1表達產物的表達定位與其在細胞質中承擔著清除自由基的功能相一致。

圖2 ATB‐sod1P4k‐GFP-sod1-3’UTR 轉基因果蠅腸道細胞中sod1 表達檢測。細胞核：DAPI 染色；細胞質：GFP 抗體染色，箭頭顯示細胞質高表達；比例尺，10 μmFigure 2 Detection of sod1 expression in intestinal cells of transgenic fly with the genetype of ATB-sod1P4k-GFP-sod1-3’UTR. Nucleus: DAPI staining;Cytoplasm: GFP staining, the arrows show high expression in the cytoplasm; Scale bar, 10 μm

3 敲低sod1 表達顯著縮短果蠅的壽命

首先，通過雜交并低溫（18℃）培養獲得基因型為tub-gal80ts;tub-gal4＞UAS-sod1 RNAi的子代果蠅。gal80ts 是一種溫度敏感型蛋白，低溫下（18℃）與gal4蛋白結合并抑制其蛋白活性，高溫下（29℃）解除對gal4的抑制，從而允許gal4結合UAS位點，啟動UAS下游基因的表達。tub-gal4＞UAS-sod1 RNAi基因型中：tub-gal4為廣譜表達（tub表示管家基因tubulin啟動子），誘導UAS-sod1 RNAi產生全身型干擾sod1的表達。

然后，將剛羽化后果蠅tub-gal80ts;tub-gal4＞UAS-sod1 RNAi轉移至29℃下培養，分雌雄進行壽命統計。結果顯示：在29℃ 培養條件下，雄性親本tub-gal80ts;tub-gal4（對照組）平均壽命約為39.45 d（n=148），而tub-gal80ts;tub-gal4＞UAS-sod1 RNAi雄性果蠅平均壽命僅約為22.8 d（n=156）（圖3A）。與對照組相比，實驗組雄性果蠅平均壽命縮短了42.2%（P＜0.0001）。同樣條件下，雌性親本對照平均壽命約為39.13 d（n=165），sod1RNAi雌性果蠅平均壽命為33.8 d（n=147）（圖3B），平均壽命縮短了5.33 d（P＜0.01）。結果表明：敲低sod1顯著縮短果蠅壽命。

圖3 sod1 敲低對果蠅壽命的影響。A，雄性果蠅生長曲線（左）和平均壽命統計學分析（右）；B 雌性果蠅生存曲線（左）與平均壽命統計學分析（右）；****，P＜0.0001；**，P＜0.01Fig. 3 The effect of sod1‐knocking down on the lifespan of flies. A, the survival curve of male flies (left) and statistical analysis of mean longevity (left); B, the survival curve of female flies (left) and statistical analysis of mean lon‐gevity (left); ****, P＜0.0001; **, P＜0.01

4 過表達sod1 基因顯著延長果蠅壽命

首先，通過雜交獲得基因型為tub-gal4＞UASsod1-3’UTR的子代果蠅。然后，將其培養于29℃條件下，分雌雄進行壽命統計。結果顯示：雄性親本tub-gal4果蠅（對照組）平均壽命約為29.56 d，而sod1基因過表達組雄性果蠅平均壽命約為40.26 d（圖4A）。與對照組相比，過表達組果蠅平均壽命延長了36.2%（P＜0.0001）；同樣，雌性對照組果蠅平均壽命約為31.71 d，過表達組雌性果蠅平均壽命約為37.88 d（圖4B），后者比前者平均壽命延長了6.17 d（P＜0.0001）。結果表明：無論雌雄，過表達sod1基因均可顯著延長果蠅的壽命。

圖4 sod1過表達對果蠅壽命的影響。A，雄性果蠅生長曲線（左）和平均壽命統計學分析（右）；B 雌性果蠅生存曲線（左）與平均壽命統計學分析（右）；****，P＜0.0001；**，P＜0.01Fig. 4 The effect of sod1 overexpression on the lifespan of flies. A, the survival curve of male flies (left) and statistical analysis of mean longevity (left); B, the survival curve of female flies (left) and statistical analysis of mean lon‐gevity (left); ****, P＜0.0001; **, P＜0.01

5 sod1 調控果蠅運動能力

果蠅的運動能力隨著其衰老程度的增加逐漸衰退[19]，因此運動能力可以反映其衰老的進程。通過在培養管上設置標志線，統計一段時間內爬過刻度線的昆蟲數量來檢測sod1敲低及過表達對果蠅運動能力的影響。結果顯示：與對照組果蠅相比（圖5A、5B），敲低組雌、雄果蠅運動能力均顯著下降（P＜0.05）。反之，過表達組雌、雄果蠅運動能力均顯著增強（P＜0.05）（圖5C、5D）。結果表明，sod1基因調控果蠅運動能力。

圖5 sod1 敲低和過表達對果蠅攀爬力的影響。A 和B，sod1 敲低對雄性（A）和雌性（B）果蠅攀爬力的影響；C 和D，sod1 過表達對雄性（C）和雌性（D）果蠅攀爬力的影響；與tub‐gal80ts; tub‐gal4 組（A 和B）或tub‐gal4 組（C 和D）比較： *，P＜0.05Fig. 5 The effect of knockdown and overexpression of sod1 on the climbing ability of Drosophila. A and B, the effect of knockdown of sod1 on the climbing ability of male (A) and female (B) Drosophila; C and D, the effect of sod1 overexpression on the climbing ability of male (C) and female (D)Drosophila; *, P＜0.05, compared with tub‐gal80ts; tub-gal4 group (A and B) or tub‐gal4 group (C and D)

討 論

SOD 作為生物體內抗氧化酶系的重要成員，可以通過氧化ROS，維持機體氧化系統和還原系統的平衡[20]，從而保護機體。目前共發現3 種SOD 基因，即sod1和sod3（編碼結合Cu/Zn 離子的SOD蛋白）和sod2（編碼結合Mn 離子的SOD 蛋白）。sod1主要定位于細胞質，sod2定位于線粒體基質，sod3分泌至細胞外發揮功能[21‐22]。本文通過構建ATB-sod1P4K-GFP-sod1-3’UTR轉基因果蠅，以腸道為研究對象檢測sod1的亞細胞定位，免疫熒光染色結果提示sod1可能僅在細胞質中發揮功能。

Phillips 等報道，利用甲基磺酸乙酯誘變果蠅獲得Cu/Zn‐SOD（sod1編碼）缺失突變體，發現雄性果蠅的平均壽命顯著縮短，并且增強了對白葉枯的敏感性[23]。Fleming 等報道，將牛Cu/Zn‐SOD 的cDNA通過顯微注射制備轉基因果蠅，高表達牛SOD 蛋白果蠅的平均壽命顯著延長，同時證明了sod的高度保守特性[24]。黃曉峰等在飼料中添加SOD 酶能顯著延長雌雄果蠅的平均壽命[11]。本研究利用RNAi 干擾技術，獲得sod1敲低果蠅品系；同時利用顯微注射方法制備sod1轉基因果蠅。結果發現敲低sod1可以顯著縮短雄性、雌雄果蠅的壽命且運動能力均會發生明顯的下降，過表達sod1可顯著延長雄性、雌性果蠅壽命并展現出更強的運動能力。上述結果與前人sod1突變體結果相一致，也表明sod的功能無性別差異。

此外，本研究發現無論是敲低sod1或是過表達sod1，雄性果蠅壽命變化程度都更加顯著，雌性果蠅則展現出相對溫和的變化。我們推測這種不同，可能是由于雌性果蠅體內有更多的激素參與了果蠅的衰老，從而減弱了sod1對果蠅衰老的調控。