胸水細胞學標本SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化預測肺腺癌的臨床價值

紀燕英，高錦添，王德玉

（中山大學第三附屬醫院病理科，廣州 510000）

肺腺癌是較常見的一類肺癌，起源于氣管、支氣管黏膜或腺體最常見肺部疾病的一類惡性腫瘤，有一定的遺傳易感性[1‐2]。其高死亡率可歸因于晚期診斷。早期肺腺癌預后較好，但患者無特殊癥狀，難以及時發現并引起重視。早發現、早診斷、早治療是提高肺腺癌患者生存率的關鍵，因此探尋高效的肺腺癌檢查診斷方式，提升肺腺癌早期確診率仍是臨床研究的重要課題。

矮小同源盒基因2（dwarf homeobox gene,SHOX2）和RAS 相關區域家族1A（RAS related region family 1A, RASSF1A）啟動子的異常甲基化已被驗證為診斷早期肺腺癌的一對有價值的生物標志物[25]。既往國內外報告多使用肺結節穿刺標本及支氣管肺泡灌洗液作為研究對象，結果均提示侵襲性病變中的SHOX2 和RASSF1A 啟動子甲基化程度均明顯高于非侵襲性病變[15,20]。另一方面，胸水細胞學標本的SHOX2、RASSF1A 臨床數據卻非常有限。相比肺活檢穿刺術和支氣管肺泡灌洗術，胸水標本采集顯然創傷性更小、安全性更高、可重復操作。因此，本研究擬將可疑肺腺癌患者作為干預對象，比較良性病變和肺腺癌間可疑惡性胸水的胸水細胞學標本SHOX2、RASSF1A 基因甲基化結果差異，并且聯合細胞學診斷結果，旨在探析兩項指標在肺腺癌病情預測診斷中的應用，以期為肺腺癌臨床檢查診斷方式的選擇提供參考依據。

資料與方法

1 一般資料與標本

選擇2022 年1 月—2022 年12 月，中山大學附屬第三醫院送檢的80 例胸水標本作為研究對象，按胸部CT、X 線、磁共振或病理學檢查結果的不同分為觀察組（40 例，可疑肺腺癌）和對照組（40 例，良性病變）。觀察組，男:女=24:16，年齡29～83歲，平均66.4 歲；對照組，男:女=32:8，年齡21～91歲，平均60.6 歲，病癥類型肺結核:肺炎:占位腫物=4:18:20。

2 肺腺癌篩查標準

符合《肺癌篩查與管理中國專家共識》[7]中肺腺癌診斷標準，有胸痛、咳嗽、咯血等癥狀，胸部CT、X 線、磁共振及病理學檢查提示肺腺癌。

3 納入和排除標準

納入標準：①年齡≥18 歲；②既往或目前胸部CT、X 線、磁共振或病理學檢查（細胞學或組織學）提示肺癌；③基本資料齊全。

排除標準：①有全身免疫性疾病、精神疾??；②存在嚴重感染性、傳染性疾??；③合并其他呼吸道疾?。ㄈ缱儺愋韵?、支氣管狹窄等）。

4 方法

4.1 試驗設備、試劑

BD CytoRich 樣本保存液，碧迪公司；CK7、TTF‐1、NapsinA、WT1、P40、CK5/6 即用型抗體，福州邁新生物技術開發有限公司；全自動免疫組化染色系統，美國羅氏，型號BenchMark ULTRA；醫用離心機，珠海順皓生物科技有限公司，型號H1650‐W；全自動醫用PCR 分析系統,上海宏石醫療科技有限公司,型號SLAN‐96S；LifeECO 基因擴增儀，杭州博日科技有限公司,型號TC‐96/G/H(b)C；熒光計，杭州奧盛儀器有限公司，型號Fluo‐100B；細胞保存液，上海透景生命科技股份有限公司；核酸抽取或純化試劑盒，上海透景生命科技股份有限公司；人SHOX2、RASSF1A 基因甲基化DNA 試劑盒測試劑盒（PCR 熒光法），上海透景生命科技股份有限公司

4.2 指標檢測

采集胸水細胞學標本：收集50 ～100 mL 胸水，其中20 mL 胸水加入細胞保存液，剩余胸水離心處理（10 min，2000 r/min）并去除上清液后加入20 mL BD 樣本保存液；如果不能立即檢測，樣本保存于2‐8°冰箱；

細胞學染色：去上清液后的細胞沉渣進行液基細胞染色檢測操作及細胞蠟塊的制作，并進行巴氏、HE 染色，必要時加做免疫組織化學染色協診；

液基細胞學、細胞蠟塊及免疫組化病理診斷：有兩名經驗豐富的高年資病理醫生診斷。

甲基化DNA 提?。弘x心處理（10 min，2000 r/min）并去除上清液，每份樣本均可見芝麻大小沉淀物，細胞沉淀物采用DNA 提取試劑（離心柱形），離心、洗滌處理（嚴格按照試劑盒說明書操作），收集DNA。

亞硫酸鹽修飾：取20 μL DNA 樣本進行轉化、洗滌及DNA 修復處理（嚴格按照試劑盒說明書操作），修飾后DNA 立即用于檢測；

甲 基 化 檢 測： 用 人SHOX2、RASSF1A 基因甲基化DNA 試劑盒測試分析修飾后DNA。修飾后基因測序引物為SHOX2 上游5’‐GGT‐GTTGTGTCGTATAGGGAGT‐3’、 下 游5’‐TC‐CGCCTCCTACCTTCTAAC‐3’；RASSF1A 上游5’‐GAGGGAAGGAAGGGTAAGG‐3’、 下 游5’‐GAGGGAAGGAAGGGTAAGG‐3’。進行實時熒光定量PCR 檢測，PCR 反應體系：PCR 反應液15（n+2）μL 與DNA 聚合酶0.3（n+2）μL（n 代表樣本數量）混勻后取15 μL 及5 μL DNA 樣本加入反應管，顛倒混勻、瞬時離心；擴增程序：第1 階段95 ℃ 10 min，1 個循環，第2 階段95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，5 個循環，第3 階段95 ℃ 15 s、57 ℃ 30 s，40 個循環；信號收集。

陽性判讀值：FAM 熒光信號的擴增曲線為光滑的“S”形，且Ct 值＜35，提示RASSF1A 基因甲基化陽性；VIC（或HEX）熒光信號的擴增曲線為光滑的“S”形，且Ct 值＜32，提示SHOX2 基因甲基化陽性；用△Ct 法計算SHOX2、RASSF1A 甲基化表達水平，△Ct 值越低，基因甲基化水平越高。

5 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件處理數據，計數資料用%表示組間行χ2檢驗；計量資料符合正態分布數據用表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗；Logistic 回歸分析SHOX2、RASSF1A 甲基化與肺腺癌病情的關系；繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析SHOX2、RASSF1A 甲基化在肺腺癌病情診斷中的應用。P＜0.05 差異有統計學意義。

結 果

1 兩組細胞學病理診斷結果

觀察組中可疑惡性胸水液基巴氏染色及細胞蠟塊HE 染色片中找到腺癌細胞或核異質細胞，結合細胞蠟塊免疫組織化學染色napsinA (+)、TTF‐1 (+)、CK7 (+)、WT1 (‐)，證實為肺腺癌（圖1）。

圖1 肺腺癌胸水液基巴氏、細胞蠟塊HE 染色與免疫組織化學表型。A；液基巴氏染色；B，細胞蠟塊HE 染色；C，napsinA ；D，TTF‐1 ；E，CK7 ；F，WT1；箭頭，腺癌細胞；比例尺，50 μmFig. 1 Liquid based Pap staining of lung adenocarcinoma pleural fluid, HE staining of cell wax block and immunohistochemical phenotype. A, liquid based Pap staining; B, cell wax block HE staining; C, napsin A ; D, TTF‐1 ; E, CK7 ; F, WT1; arrows, adenocarcinoma cells; scale bar, 50 μm

對照組中良性胸水液基巴氏染色及細胞蠟塊HE 染色中未見確切癌細胞，結合細胞蠟塊免疫組織化學染色napsin A(‐)、TTF‐1(‐)、CK5/6 (散在+)、P40(‐)，證實胸水為良性病變（圖2）。

圖2 良性胸水液基巴氏、細胞蠟塊HE 染色與免疫組織化學表型。A，液基巴氏染色；B，細胞蠟塊HE 染色；C，napsinA；D，TTF‐1；E，CK5/6；F，P40；比例尺，50 μmFigure 2 Liquid based Pap staining of benign pleural fluid, HE staining of cell wax block and immunohistochemical phenotype. A, liquid based Pap staining; B, cell wax block HE staining; C, NapsinA; D, TTF‐1; E, CK5/6; F, P40; scale bar, 50 μm

2 比較兩組的SHOX2、RASSF1A 基因甲基化檢測情況

觀察組的SHOX2、RASSF1A 基因甲基化檢測值低于對照組（表1）。

表1 比較兩組的SHOX2、RASSF1A 基因甲基化檢測值Tab. 1 Comparison of SHOX2 and RASSF1A gene methylation detection values between two groups

3 肺腺癌的多因素Logistic 回歸分析

視臨床或病理學檢查結果為標準，觀察組診斷為肺腺癌，患者的性別、年齡，差異無統計學意義（表2）。

表2 觀察組SHOX2、RASSF1A 表達水平的比較Tab. 2 Comparison of the expression levels of SHOX2 and RASSF1A in the observation group

以SHOX2、RASSF1A 甲基化表達水平為自變量，連續變量；將觀察組甲基化結果作為因變量，進行Logistic 回歸分析，結果顯示，SHOX2、RASSF1A甲基化高表達是肺腺癌危險因素（表3）。

表3 SHOX2、RASSF1A 甲基化與肺腺癌病情的Logistic 回歸分析Tab. 3 Logistic regression analysis of SHOX2, RASSF1A methylation and lung adenocarcinoma status

4 SHOX2、RASSF1A 甲基化在肺腺癌病情診斷中的效能分析

以肺腺癌病情診斷結果為自變量，以SHOX2、RASSF1A 甲基化表達水平為因變量，繪制ROC 曲線（圖3）。分析結果顯示，SHOX2、RASSF1A甲基化聯合預測肺腺癌病情結果的AUC（0.821，95%CI:0.727～0.915）最大，敏感度、特異性分別為87.5%、97.5%（表4）。

圖3 SHOX2、RASSF1A 和兩者組合甲基化與肺腺癌病情診斷價值的Roc 曲線Fig.3 Roc curve of SHOX2, RASSF1A, and their combination methylation in the diagno‐sis of lung adenocarcinoma

表4 SHOX2、RASSF1A 甲基化在肺腺癌病情診斷中的效能分析Tab. 4 Effectiveness analysis of SHOX2 and RASSF1A methylation in the diagnosis of lung adenocarcinoma

5 比較兩組的甲基化結果與細胞學診斷結果

以SHOX2、RASSF1A 基因甲基化，其中一項或兩項陽性可判斷總甲基化為陽性，細胞學則以有無腫瘤細胞為診斷結果，設定其見腫瘤細胞為陽性，未見腫瘤細胞為陰性；計算兩組總甲基化結果與細胞學診斷符合率；結果顯示，觀察組中細胞學診斷結果與總甲基化結果的符合率（80%），對照組中細胞學診斷結果與總甲基化結果的診斷符合率（72.5%）（表5）。

表5 兩組總甲基化結果與細胞學診斷符合率Tab. 5 Compliance rate between total methylation results and cytological diagnosis in two groups

討 論

目前肺腺癌的具體病因尚未明確，早發現是提高存活率的基礎，低劑量胸部計算機斷層掃描（LDCT）篩查可早期發現肺癌，但LDCT 特異性較差，影像學檢測到的肺小結節中，多為良性結節，鑒于病理學是診斷肺腺癌的金標準，影像學結果往往易滯后、誤診；而開發高效、高敏感性、高特異性的檢測方法以提高肺腺癌的診斷率及準確率是非常有必要的。DNA 甲基化是一種相對穩定的表觀遺傳改變，經常發生在腫瘤發生的早期階段。較早期的研究已發現肺癌患者血漿中DNA 甲基化甲程度明顯高于良性肺結節患者[14]，但高甲基化也常常會發生在其他多種腫瘤如頭頸部鱗狀細胞癌、腎細胞癌和結腸直腸癌的血漿中[24]，因此肺穿刺活檢標本、支氣管肺泡灌洗液、胸水標本的基因甲基化檢查更有助于肺癌的診斷。胸水標本取樣不僅操作簡單、患者接受度高，基層醫院也可以進行，更重要的是還可以作為肺腺癌患者治療后隨訪復查的連續性檢查手段。本研究數據顯示，觀察組可疑肺腺癌患者胸水SHOX2、RASSF1A 基因甲基化程度高于對照組，是肺腺癌的危險因素，與既往肺穿刺活檢和支氣管肺泡灌洗液結果基本一致[17,20]，說明可疑肺腺癌患者胸水細胞學標本SHOX2、RASSF1A 基因甲基化檢查也可為肺腺癌的臨床診斷及病情預測提供重要參考。

既往多個研究顯示SHOX2、RASSF1A基因甲基化肺癌診斷中特異性均高于90%，甚至接近100%，但在不同肺癌病理類型中敏感性有差異，其中肺腺癌敏感性較小細胞肺癌、肺鱗癌低，只有68.8～69.6%（支氣管肺泡灌洗液）和77.78%（肺穿刺石蠟標本）[23,24,26]。本研究利用胸水標本檢測，在病情預測診斷方面，SHOX2、RASSF1A 基因甲基化表達水平變化可能與肺腺癌的病情發展有密切聯系；高敏感度及特異性原因可能與檢測標本取材方式以及細胞完整度有關。肺泡灌洗液在沖刷過程中可能令異型細胞破壞，導致離心后DNA 含量降低；而肺穿刺活檢小標本受更多因素影響，如病灶的大小和位置、操作者技術水平、患者配合度等等。另一方面，本研究觀察組總甲基化結果與細胞學診斷結果符合率80%，高于國內文獻66.67%[27]，原因可能是肺腺癌異質性較大，統計結果容易受樣本細胞含量影響。胸腔積液穿刺術屬于基礎操作，能得到更均質化的細胞標本，這一系列可側面提示胸水SHOX2、RASSF1A基因甲基化檢測作為有效補充手段可行性較高。

對于細胞學結果與總甲基化結果不相符的患者，臨床也應高度重視；如果是細胞學診斷結果為陰性而總甲基化結果為陽性的患者，則需要提前預警和密切隨訪，尤其是病情較為復雜或不明顯的情況，可考慮穿刺活檢進行組織病理學檢查以免漏診或誤診；細胞學診斷結果為陽性而總甲基化結果為陰性的患者，可多次行甲基化檢查，以排除假陰性可能。

盡管靶向治療和免疫治療方面已取得進展，但化療仍為肺癌治療最有效的方法。有研究表示，大多數化療藥物對基因甲基化有促進作用，RASSF1A 基因是具有預測化療價值的的一項有利指標[21]；在肺腺癌中，SHOX2 基因高表達或低甲基化提示患者易復發、分化程度低、預后差[22]。 SHOX2、RASSF1A兩基因聯合檢測，可以幫助臨床更精準及時地了解療效，更早發現疾病預后發展情況，盡早調整治療方案。

本研究當前存在一定的局限性。首先，研究樣本數量相對較小，研究結論存在一定誤差，還需更多患者的研究數據來驗證、優化結果；其次，未對不同類型的肺腺癌患者進一步分組對比，且尚未證實胸水細胞學標本SHOX2、RASSF1A 甲基化在不同類型肺腺癌預測診斷中的廣泛效力；最后，本研究未對患者疾病進行后續跟蹤隨訪。

綜上所述，SHOX2、RASSF1A 甲基化在肺腺癌胸水中呈高表達，可為肺腺癌的臨床診斷及病情預測提供重要參考，也作為細胞學病理診斷上的補充，提高早期肺腺癌診斷的準確率。SHOX2、RASSF1A基因甲基化聯合檢測可作為一項快捷、有效的新興無創傷性輔助檢測指標，可在各級醫院中廣泛使用。