蠶品種對不同發育階段蠶體、蠶沙及蠶繭穩定同位素特征的影響

續文婕 胡慧萍 戴賢君 賈麗玲 鄭海玲 周 旸 潘家榮，*

（1中國計量大學生命科學學院，浙江 杭州 310018；2中國絲綢博物館，浙江 杭州 310002）

我國種桑、養蠶、繅絲、織綢的歷史悠久，可以追溯至新石器時代晚期，素有“絲國”的美稱［1］。絲綢文化作為中華文明的重要標志，大量文獻和考古實例證實了中國是絲綢的起源地［2］。但當今國際社會仍有部分學者持懷疑態度，提出的證據是在印度河流域遺址中發現距今4 000多年的蠶絲纖維殘留，提出印度絲綢起源論［3］。因此，為絲綢起源于我國提供理論依據，建立一種有效、穩定的蠶絲及其織物的產地溯源體系極為重要。

穩定同位素技術具有示蹤、整合和指示等功能，準確性和靈敏度較高，近年來已發展成為農產品產地溯源的有效手段之一［4-5］，在乳制品［6-8］、大米［9-10］、茶葉［11-13］、肉類［14-16］等農產品產地溯源中取得了良好成效。然而，多種因素如采樣地點與采樣時間、樣品處理方式、品種等會直接干擾產地溯源模型的鑒別準確率。如Zhao等［17］分析對比了奶牛泌乳階段、采樣時間對中國各省份牛奶樣品中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O 值的影響，發現不同泌乳階段的牛奶樣本中穩定同位素比值差異不顯著，對牛奶產地溯源無影響，而采樣時間會對牛奶產地溯源產生影響。劉志等［18］研究5種烘干方式對西湖龍井茶中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值的影響，發現不同烘干方式可能引起茶葉中單個穩定同位素比值的變化，但多因素橢圓置信區間測試結果表明不同烘干方式茶葉間不存在顯著性差異。趙珊等［19］研究不同發育期及授粉方式對甜瓜中穩定同位素比值的影響，發現在同一發育時期，不同授粉方式的甜瓜果實中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O 值無顯著差異。Zhang 等［20］對中國7 個地區的扇貝樣品的δ13C、δ15N 值進行測定，結果表明，不同產地、季節和品種的扇貝樣品中穩定同位素比值存在顯著性差異，在進行產地溯源時需要保證扇貝樣本品種的一致性。近年來，穩定同位素技術在紡織考古領域中的應用得到迅速發展，尤其是古代紡織品來源的確定，Von Holstein等［21］對現代和古代羊毛角蛋白的δ13C、δ15N、δ2H 值進行測定，發現羊毛角蛋白樣品的δ13C、δ15N、δ2H 值可以對產地進行有效鑒別，羊毛角蛋白的降解并不會導致樣本中穩定同位素組成出現顯著性差異。在絲綢溯源中，尚無蠶繭中穩定同位素特征是否受品種因素影響的研究。

本研究通過桑蠶飼養試驗，探討在外界環境與飼喂桑葉一致的條件下，5 種桑蠶品種（菁松×皓月、皓月×菁松、D5、D7和D18）不同齡期的蠶體、蠶沙以及蠶繭樣本中碳、氮、氫、氧穩定同位素比值的變化，并評估品種對蠶繭產地溯源模型準確性和穩定性的影響，以期利用穩定同位素指紋分析技術實現對不同產地蠶繭的精準溯源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選用5個桑蠶品種，其中雜交品種2個，組合分別為菁松×皓月（JH）和皓月×菁松（HJ），地方品種3個，分別為D5、D7 和D18，由浙江省農業科學院蠶桑與茶葉研究所提供。其中，菁松×皓月（正反交）是中國農業科學院蠶業研究所育成的優質、高產、多絲量蠶品種，是我國多個蠶區的主推品種［22］。喂食桑葉采自浙江省農業科學院桑葉園，小蠶食用嫩葉采自枝條近頂端，葉薄呈黃綠色；大蠶食用成熟葉采自枝干下端，葉厚呈暗綠色，桑葉的穩定同位素比值如表1 所示（δ15N存在顯著性差異）。

表1 桑蠶不同發育時期喂食桑葉的穩定同位素比值Table 1 The stable isotope ratio in mulberry leaves for different developmental stages of silkworm

1.2 儀器與設備

Delta V Advantage 穩定同位素比質譜儀、Flash 2000 HT 元素分析儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；LT-DBX120 F 電熱恒溫鼓風干燥箱，立德泰勀（上海）科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 飼養與采樣 蠶蟻從未感光狀態開始培養，1～3 齡期的小蠶喂食嫩桑葉，4～5 齡期大蠶喂食成熟葉。按正常程序進行飼養。隨機采集各齡期眠蠶蛻皮后48 h 的蠶體和蠶沙樣本，由于1齡蠶沙產量少，體積小，難以收集，故主要采集2～5齡蠶沙。

1.3.2 樣品處理 將采集的蠶體、蠶沙和桑葉樣品于70 ℃烘干至恒重，將烘干后樣品置于研缽內充分研磨，過100 目篩，密封保存待測。隨機采集不同品種蠶繭樣本各5個作為試驗對象，將其置于110 ℃烘箱中烘干至恒重，剪成1 mm×1 mm碎片，待測。

1.3.3 穩定同位素測定與計算

1.3.3.1 碳、氮穩定同位素測定 稱取0.2 mg 待測樣品于錫囊（3.3 mm×5 mm）中，通過自動進樣器進入元素分析儀中，以CO2和N2為參考氣，燃燒爐溫度為960 ℃；色譜柱溫度為50 ℃；氦氣吹掃流速為200 mL·min-1，在此條件下樣品中的碳元素和氮元素轉化為純凈的CO2和N2，經氦氣稀釋后進入同位素比質譜儀檢測。選用標準品IAEA-CH-7（δ13C=-32.151‰）和IAEA-310（δ15N=47.2‰）對樣品測試結果進行校正，為保證測試結果的準確性，每隔12個樣品插入1個標準品，每個樣品重復測定3次取平均值。

1.3.3.2 氫、氧穩定同位素測定 稱取0.2 mg 待測樣品于銀杯（3.3 mm×5 mm）中，通過自動進樣器進入元素分析儀中，以H2和CO為參考氣，燃燒爐溫度為1 380 ℃；色譜柱溫度為50 ℃；氦氣吹掃流速為100 mL·min-1，樣品在玻璃碳管內經高溫裂解產生CO 和H2，恒溫色譜柱內分離，經氦氣稀釋后進入同位素比質譜儀檢測。選用標準品IAEA-CH-7（δ2H=-100.3‰）和IAEA-601（δ18O=32.3‰）對樣品測試結果進行校正，為保證測試結果的準確性，每隔12個樣品插入1個標準品，每個樣品重復測定3次后取平均值。

1.3.3.3 穩定同位素比值計算 按照以下公式計算穩定同位素比值：

式中，R樣品為待測樣品中某種元素的重同位素與輕同位素豐度之比，即13C/12C、15N/14N、2H/1H、18O/16O；R標準為標準品中重同位素與輕同位素豐度之比，其中δ13C 的相對標準為VPDB，δ15N 的相對標準為Air，δ2H和δ18O的相對標準為VSMOW。

1.4 數據處理

利用SPSS 26.0 軟件進行獨立樣本T 檢驗和單因素方差分析（one-way ANOVA），利用MATLAB R2016a軟件進行橢圓聯合置信區間（elliptical joint confidence region，EJCR）測試。

2 結果與分析

2.1 不同時期蠶體和蠶沙中穩定同位素的特征及品種對其的影響

2.1.1 不同齡期蠶體和蠶沙的穩定同位素比值變化由表1可知，不同齡期桑蠶喂食的桑葉間δ13C、δ2H、δ18O值無顯著差異；大蠶期喂食桑葉的δ2H、δ18O 值相較于小蠶期喂食桑葉略有降低；不同成熟度桑蠶喂食的桑葉間δ13C 值差異極小，相比于小蠶期喂食桑葉，大蠶期喂食桑葉的δ13C值分布更加集中、穩定，與前人研究結果相一致［23］。不同成熟度桑蠶喂食的桑葉間的δ15N值具有顯著性差異，大蠶期喂食桑葉中δ15N均值（-2.58‰）顯著低于小蠶期桑葉中δ15N均值（-0.46‰），說明桑葉葉片發育過程中會優先貧化15N。

由表2 可知，不同品種家蠶幼蟲的δ13C、δ15N、δ2H和δ18O值在不同生長發育階段的變化趨勢不同。不同品種、不同齡期蠶體與攝食桑葉的碳、氮、氫、氧穩定同位素分餾值見圖1。結果表明，家蠶對攝食桑葉的δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O 值表現出不同的富集和貧化效應。蠶體δ13C 值的均值變化范圍為-30.33‰～-27.26‰，與喂食桑葉中的δ13C 值相近，隨著齡期的增加總體呈現先增后減的變化趨勢，1～3 齡期的蠶體δ13C 值緩慢升高并逐漸趨于飼喂桑葉的δ13C 值。在3～4 齡期，盡管大蠶期飼喂桑葉的δ13C 值與小蠶期相近，但蠶體的δ13C值明顯降低，至4～5齡期趨于穩定。桑蠶飼喂過程中，蠶體與桑葉的碳穩定同位素分餾值介于-2.72‰～0.31‰之間，除3齡期蠶體呈現弱富集效應外，其他齡期蠶體均表現出不同程度的貧化效應，其中4～5 齡期蠶體的貧化效應較大。對于δ15N，隨著齡期的增加，不同品種蠶體δ15N 值的變化呈波動上升趨勢，蠶體與桑葉的氮穩定同位素分餾值在-0.76‰～4.33‰之間，除3 齡期的蠶體對攝食桑葉呈現弱貧化效應外，其他各齡期均表現出不同程度的富集效應，其中4～5 齡期家蠶對攝食桑葉有明顯的富集效應。1～3 齡期喂食桑葉的δ2H值明顯低于初期蠶體，且蠶體δ2H值變化趨勢不明顯，對攝食桑葉的δ2H 富集程度較高。雖然大蠶期喂食桑葉δ2H 值與小蠶期喂食桑葉相比變化不明顯，但是隨著齡期的增加，不同品種蠶體總體呈急劇降低的趨勢，對δ2H 的貧化效應隨齡期的增加而增大。家蠶不同生長階段飼喂桑葉的δ18O 值基本不變，蠶體δ18O值隨齡期變化波動小，表現出明顯的貧化效應，蠶體與攝食桑葉的氧穩定同位素分餾值介于-6.49‰～-3.47‰。

圖1 不同齡期蠶體與飼喂桑葉之間的C、N、H、O穩定同位素分餾值Fig.1 Stable isotope fractionation of C，N，H and O between silkworm body and mulberry leaves at different instars

表2 不同品種蠶體在各齡期的δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值的顯著性差異Table 2 Significant difference of δ13C、δ15N、δ2H、δ18O value in silkworm body from different varieties and at different instars

由表3 可知，不同齡期蠶沙的δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O值變化趨勢與蠶體相似。

2.1.2 品種對蠶體和蠶沙穩定同位素比值的影響由表2 可知，不同品種之間在1 至4 齡期蠶體樣本中的δ13C值無顯著差異。而在5齡期，不同品種之間的δ13C差異范圍在0.24‰之內。不同品種之間在2、4、5齡期蠶體樣本中的δ15N 差異不顯著。而在1、3 齡期，不同品種之間的δ15N 值整體差異顯著，差異范圍分別為0.66‰和0.58‰。不同品種之間在飼養前期（1～2 齡期）的δ2H值整體存在顯著差異，但飼養后期（3、4、5齡期），品種間δ2H 值無顯著差異。前期主要受蠶種的影響，后期受喂食桑葉的影響，可能導致品種之間δ2H 值無顯著差異。各齡期不同品種之間的δ18O值無顯著差異。以上結果說明，在蠶飼喂過程中，不同品種之間多數齡期蠶體的穩定同位素組成無顯著差異，僅在個別齡期出現顯著差異。

同樣由表3 可知，不同品種之間在2 齡期和5 齡期的蠶沙樣本δ13C 和δ15N 值整體存在顯著差異，在3、4齡期，不同桑蠶品種的蠶沙樣本間δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O值均無顯著差異。

表3 不同品種蠶沙在各齡期的δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值的顯著性差異Table 3 Significant difference of δ13C、δ15N、δ2H、δ18O value in silkworm excrement from different varieties and at different instars

2.1.3 蠶體和蠶沙的相關性分析 對蠶體和蠶沙樣本的δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值分別進行線性相關分析，結果如圖2所示。除蠶體樣本中的δ18O值與蠶沙樣本中的δ18O 值相關性較差外，蠶體和蠶沙樣本中δ13C、δ15N、δ2H 穩定同位素指標的相關性較強，相關系數（R2）分別為0.982 8、0.666 6、0.811 7。因此，可將蠶沙代替蠶體進行碳、氮、氫3 種穩定同位素測定，具有試驗材料易獲得，且能避免活蠶取樣對飼養試驗產生過度干擾等優點［24］。

圖2 蠶體與蠶沙樣本的δ13C、δ15N、δ2H、δ18O相關性分析Fig.2 The correlation analysis plot of δ13C、δ15N、δ2H、δ18O of silkworm body and silkworm excrement

2.2 品種對蠶繭穩定同位素比值的影響

2.2.1 單因素方差分析 由表4 可知，不同品種蠶繭樣本間的δ18O值分布在17.30‰～18.11‰之間，無顯著差異。而δ13C、δ15N、δ2H值在部分蠶繭樣本間出現顯著差異，蠶繭δ13C分布在-27.02‰～26.55‰范圍內，δ15N值分布在2.51‰～4.23‰范圍內，δ2H 值分布在-80.32‰～-72.27‰范圍內。如圖3 所示，桑蠶品種對蠶繭樣本碳、氧穩定同位素的影響較小。D5、D7、D18 對蠶繭中的氮穩定同位素比值影響相似，明顯高于菁松、皓月正、反交品種。對于δ2H，除D5品種蠶繭的δ2H 值明顯較低外，其他品種蠶繭樣本的δ2H值較為接近。

圖3 不同蠶繭品種的δ13C、δ15N、δ2H、δ18O單因素方差分析箱線圖Fig.3 One-way ANOVA boxplot of δ13C、δ15N、δ2H、δ18O in cocoons of different silkworm varieties

表4 桑蠶品種對蠶繭中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值的影響Table 4 Effects of silkworm varieties on the δ13C、δ15N、δ2H、δ18O value in cocoons

2.2.2 橢圓聯合置信區間測試 單因素方差分析初步探索了不同桑蠶品種對蠶繭中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O 4 種穩定同位素指標的影響，結果表明不同品種蠶繭的δ18O 值無顯著差異，δ13C、δ15N、δ2H 值在部分品種間存在顯著差異，但單一穩定同位素指標并不足以全面考察品種帶來的影響，單一變量的異常值可能影響樣本均值估計的精確度［18］。因此，進一步采用橢圓聯合置信區間（EJCR）評估不同桑蠶品種對蠶繭中穩定同位素組成的影響。

由圖4-A、B 可知，對蠶繭的δ13C 和δ15N、δ2H 和δ18O 進行雙因素EJCR 測試，蠶繭樣本總體分布在95%置信橢圓內，僅第14 號樣本位于δ2H 和δ18O 雙因素置信橢圓的置信限上。由圖4-C、D 可知，蠶繭樣本總體分布在δ13C、δ15N 和δ2H 與δ13C、δ15N 和δ18O 的三因素置信橢球內，無異常樣本。隨著耦合指標的增加，第14號樣本逐漸逼近置信橢球的期望值，可以認為不是異常樣本。雖然不同桑蠶品種對蠶繭樣本內單一穩定同位素指標產生影響，但雙因素及三因素EJCR測試結果顯示蠶繭樣本總體分布在95%置信區間內。由此可知，盡管不同桑蠶品種能夠引起蠶繭中穩定同位素比值出現變化，但不會導致蠶繭樣本間出現顯著性差異。

圖4 不同品種蠶繭樣本的δ13C、δ15N、δ2H、δ18O的橢圓置信區間測試Fig.4 Elliptical joint confidence region of δ13C、δ15N、δ2H、δ18O in cocoons of different silkworm race

3 討論

我國桑蠶品種繁多，現階段桑蠶養殖以散戶經營為主，且不同桑蠶養殖地區的環境存在差異，導致各地品種出現多、混、雜等現象［25］。已有研究探討了穩定同位素指紋分析技術在蠶繭產地溯源中的應用［26］。然而對桑蠶品種引起的穩定同位素比值變化及其對溯源準確性的影響仍缺乏相關研究。

本研究探討了不同桑蠶品種對蠶體、蠶沙樣本中穩定同位素比值的影響，以及桑蠶生長發育過程中對攝食桑葉的穩定同位素分餾效應。利用單因素方差分析和橢圓聯合置信區間測試全面評估了品種引起的蠶繭中穩定同位素比值差異，以及這種差異對產地溯源的影響。

本研究發現，飼養過程中蠶體對桑葉的穩定同位素分餾效應略有不同，桑葉中δ13C、δ18O 值均高于初始蠶體，δ15N、δ2H 值低于初始蠶體，家蠶攝食桑葉后體內δ13C 大體表現出貧化效應，僅3 齡期蠶體對攝食桑葉的Δ13C 介于0‰～1‰之間，與前人研究報道的相鄰營養級間的碳穩定同位素富集效應在0‰～1‰之間相一致［27］，且蠶體δ13C的分餾效應不明顯，主要是由攝食桑葉中的δ13C 決定的［28］。δ15N 大體呈現顯著的富集效應，4、5 齡期蠶體的Δ15N 介于3.01‰～4.33‰之間，與文獻報道的相鄰營養級間的氮穩定同位素富集效應介于3‰～4‰相一致［29］。蠶體與桑葉的穩定同位素判別值與前人報道的δ13C、δ15N 富集效應存在一定差異，可能是由于小蠶期是家蠶充實體質的重要時期，是蠶體快速生長發育期，需要大量的蛋白質用于軀體構建，大蠶期的家蠶體質量增長率開始趨于平穩，攝入營養物質主要用于蠶絲纖維的合成。δ2H 在小蠶期表現出富集效應，在大蠶期呈貧化效應；δ18O 總體呈貧化效應，受喂食桑葉影響較小。相對于碳、氮穩定同位素而言，氫、氧穩定同位素的影響因素更為復雜［30］，桑蠶主要通過桑葉攝取水分，不同齡期桑蠶攝食桑葉的含水量存在差異，小蠶期攝食桑葉的含水量更高，且大蠶期相較于小蠶期的體質量增長率下降，兩種因素共同導致了蠶體δ2H、δ18O 分餾效應的差異。不同齡期蠶沙的δ13C、δ15N、δ2H和δ18O變化趨勢與蠶體相似。

在蠶生長發育過程中，除少數齡期外，不同桑蠶品種蠶體和蠶沙的δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值無顯著差異，且蠶體與蠶沙樣本的δ13C、δ15N、δ2H 相關性高，可采用非入侵性取樣代替活蠶取樣。單因素方差分析結果表明，桑蠶品種對蠶繭中的δ18O值無顯著影響，對δ13C、δ15N、δ2H影響較顯著，可能是由于地方品種吐絲量低，相較于生產品種出現繭偏小、繭層薄的現象，為加強蠶繭對蠶蛹的保護能力，地方品種相較于生產品種中的小分子物質含量更高［31］。單一穩定同位素指標并不足以全面考察品種帶來的影響，單一變量的異常值可能會影響樣本均值估計的精確度［18］，現階段穩定同位素溯源技術正由單一同位素向多同位素聯合分析轉變［32-33］。已有研究比較了不同同位素指標組合對判別準確率的影響，結果表明，隨著同位素指標的增加，蠶繭產地判別準確率得到顯著提升［27］。本研究雙因素和三因素EJCR 測試結果表明，不同桑蠶品種對蠶繭中單一穩定同位素比值產生較大影響，但不會導致蠶繭樣本出現顯著性差異，品種引起的差異可能遠小于產地引起的差異，并不足以影響不同產地蠶繭的鑒別，這為基于穩定同位素技術的蠶繭產地溯源提供了理論依據。近年來市場對蠶絲產品的需求趨于多元化，彩色繭家蠶品種的飼育規模不斷擴大［34］。彩色繭品種的色素來源于桑葉中的類胡蘿卜素和葉黃類色素，以及桑蠶體內合成的黃酮色素［35］。本研究僅探討了不同白色繭品種對桑蠶及其蠶繭的影響，而有關彩色繭品種對攝食桑葉的同位素分餾效應，不同發育階段中蠶體、蠶沙的穩定同位素比值變化，以及蠶繭樣本中穩定同位素比值可能出現的變化還需進一步探討。這為進一步加強穩定同位素技術在蠶絲及其織物產地溯源中的準確性和有效性提出了亟待解決的新問題。

4 結論

本研究結果表明，蠶體對4 種穩定同位素的分餾效應存在差異，且蠶體與蠶沙在不同齡期的穩定同位素比值變化趨勢相似。在相同飼喂條件下，除少數齡期外，不同桑蠶品種之間蠶體和蠶沙樣本的穩定同位素組成總體不存在顯著差異，且蠶體和蠶沙樣本的δ13C、δ15N、δ2H 值存在較強的相關性。桑蠶品種可能導致蠶繭中單個穩定同位素出現較大變化，但不同品種之間蠶繭穩定同位素比值變化可能遠小于產地因素帶來的差異。因此，穩定同位素指紋分析技術可應用于不同品種蠶繭的產地溯源。在后續研究中，品種可以不作為主要影響因素，可有效解決采樣品種難以控制的困難，大大降低采樣難度，提高采樣效率。