功能性魚軟骨多糖制備工藝優化及食用安全性評價

武瑞赟，桂 萌，劉子宇，Tharushi S. Shinali，尚 楠,

（1.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193；2.中國農業大學工學院，北京 100083；3.北京市農林科學院水產科學院研究所，北京 100068；4.北京語言大學社區衛生服務中心，北京 100083）

結直腸癌是消化系統中最常見的惡性上皮腫瘤[1]，在歐美等一些發達國家，結直腸癌已經成為繼肺癌、肝癌和乳腺癌后的第四大常見癌癥[2]，嚴重威脅人類健康。隨著社會經濟的發展，生活方式的轉變以及老齡化人口的增漲，結直腸癌的發病率和死亡率明顯上升，亟需開展有效的防治工作。由于結直腸癌發病因素復雜，病理表征多樣[3]。目前，結合外科手術和放療、化療的綜合治療對結直腸癌的治療效果并不理想，靶向治療費用較為昂貴；此外，結直腸癌的形成和發展是一個多階段的漫長過程，通常需要7～10 年的潛伏期[4]，這就為早期的預防提供了最佳的機會。預防藥物的開發已成為目前結直腸癌研究中的熱點；但是，許多經歷多年開發的化學預防藥物都被發現在長期服用下存在一定的安全問題，如抗藥性或對其他臟器的毒性[5]。因此，在滿足有效的同時，尋找安全低毒的預防物質是目前迫切需要解決的問題。

硫酸軟骨多糖（chondroitin sulfate，CS）廣泛存在于動物軟骨、結締組織和細胞外基質中，以D-葡萄糖醛酸（D-glucuronic acid，GlcA）和N-乙酰-D-半乳糖胺（N-acetyl-D-galactosamine，GalNAc）通過β-1,3糖苷鍵為基本二糖單位，二糖單位之間通過β-1,4-糖苷鍵連接形成的一類線性直鏈糖胺聚糖[6]，分子質量約10～100 kDa，具有抗炎、止血、保持關節軟骨彈性、調節細胞發育、調控細胞黏附分化和增殖、抗腫瘤等多種生物活性[7]。但是CS的高分子質量和高電荷密度導致其生物利用率較低，限制了其生物功效的發揮[8-9]。越來越多的證據表明，低分子質量CS具有黏度小、溶解性好、易吸收等優點，可有效克服CS生物利用率低的缺點，如牛源CS經降解后制備出不同分子質量的CS（92.7、54.1、26.3、19.7 kDa），通過體外氧化實驗證明了低分子質量的CS具有更高的抗氧化活性[10]。因此，開發和制備分子質量低、活性高的CS受到研究者的青睞。目前，低分子質量CS主要通過酸降解法、氧化降解法、超聲降解法、輻射降解法以及酶解法獲得[11-14]，其中由于酶解法具有反應條件溫和、催化效率高、操作簡便、作用底物專一、產物分子質量可控性高等優點而被廣泛使用。

常見的CS大多來源于鯊魚軟骨組織，但過度捕撈造成鯊魚資源的日趨匱乏。鱘魚作為世界上最大最原始的軟骨硬鱗魚類，軟骨含量可占魚體的10%～20%[15-16]，為CS的研究提供了豐富的來源。實驗室之前對鱘魚來源的CS進行結構分析，表明鱘魚CS（sturgeon sulfate chondropolysaccharides，SCS）具有和鯊魚CS一樣的官能團和相似的結構[17]，說明SCS可作為鯊魚CS的良好替代物。且前期實驗發現，SCS具有抑制結直腸癌細胞增殖的作用[18-19]，但體內吸收效果不佳，大量不能吸收的CS主要是通過調節患病小鼠腸道菌群緩解或減緩結直腸癌的發展[20]。因此，本實驗以SCS為原料，結直腸癌細胞HT-29增殖活性為指標，通過酶解法，利用響應面優化制備具有抗結直腸癌活性的低分子質量SCS。此外，開發SCS相關的食品或保健食品目前缺乏明確的毒理安全評價資料。因此，本實驗進一步通過動物急性毒性實驗探究制備的SCS食用安全性，研究結果為開發以低分子質量SCS為基礎的膳食營養補充劑預防、降低結直腸癌發生風險提供實驗依據，對SCS相關產品的開發和進一步的安全應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雜交鱘魚（Acipenser schrenckii×Huso dauricus）CS由中國農業大學食品科學與營養工程學院應用微生物實驗室制備保存。

BALB/c小鼠（生產許可證號：SCXK（京）2016-0006）購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。SPF級健康5 周齡雌雄小鼠各半飼養于北京醫科大學實驗動物中心。按照SPF級要求，溫度（22±2） ℃，相對濕度（50±10）%，嚴格按照12 h光照/黑暗循環進行飼養和管理。實驗中各組小鼠進食和飲水自由。

硫酸軟骨素酶AC（chondroitinase sulfate AC，ChonAC） 北京碧澄生物科技有限公司；人源結直腸癌細胞HT-29細胞 中國醫學科學院基礎醫學研究所；DMEM高糖培養基、胎牛血清、胰蛋白酶細胞消化液、磷酸鹽緩沖液 美國Gibco公司；順鉑（cisplatin，DDP）美國Sigma公司；蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）試劑盒 北京索萊寶生物技術有限公司；葡聚糖分子質量標準品 美國聚合物標準品公司。

1.2 儀器與設備

FD-1/1C冷凍干燥機 北京德天佑科技發展有限公司；UV2355紫外-可見分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司；SynergyHTX酶標儀 美國Biotek公司；DHG-9141A恒溫恒熱培養箱 上海一恒科技有限公司；Hitachi 720血生化分析儀 日本日立公司；HEMAVET 950FS血細胞分析儀 美國DREW公司；3K15通用臺式冷凍離心機美國Sigma公司；UFSC40001 Amicon攪拌超濾杯 美國貝德福德密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

HT-29細胞從液氮中取出，在37 ℃快速溶解后，離心收集細胞沉淀，加入新鮮的含有10%牛血清的DMEM培養基并重懸細胞后，置于無菌的細胞培養瓶中，37 ℃、5%的二氧化碳條件下培養細胞，待細胞增殖到90%左右時進行傳代，3 代以上后用于實驗。

1.3.2 細胞增殖實驗

細胞經胰蛋白酶消化2 min后，吹打細胞成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×104cells/mL，按照每孔100 μL加入到96 孔板中，于37 ℃ CO2培養箱中培養過夜后，更換不同質量濃度的SCS溶液（DMEM培養基配制），同時設置不添加任何藥物的空白處理組和DDP陽性對照組。每個處理設置6 個平行，培養24 h后，每孔添加10 μL CCK-8試劑，避光4 h后，在450 nm波長下測定吸光度，按照下式計算細胞抑制率。

式中：A處理為處理組吸光度；A空白為空白組吸光度；A對照為DDP陽性對照組吸光度。

1.3.3 具有抑制結直腸癌增殖的低分子質量SCS最優制備條件確定

1.3.3.1 單因素試驗

利用單因素試驗，探究酶添加量、底物質量濃度、pH值、酶解時間、酶解溫度5 個因素下酶解產物對HT-29細胞增殖抑制率，共進行5 組實驗。酶添加量選取0.012 5、0.025 0、0.050 0、0.100 0、0.200 0 IU/mg；pH值選取5、6、7、8、9；酶解時間選取15、30、60、90、120 min；底物質量濃度選取0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL；酶解溫度選取20、25、30、35、40 ℃。單因素試驗中每個實驗重復3 次，取平均值。

1.3.3.2 Plackett-Burman（PB）試驗

試驗中使用Design-Expert 8.0.6軟件輔助設計PB試驗，選用N＝12的PB試驗設計。因素及水平如表1所示，響應值為酶解產物（1 000 μg/mL）對HT-29細胞存活率。通過對各因素效應值、方差和貢獻率的分析，選出貢獻率前3的因素進行下一步研究。

表1 PB試驗設計Table 1 Low and high levels of each independent variable used in Plackett Burman design

表2 PB試驗結果Table 2 Plackett Burman design and experimental results

1.3.3.3 最陡爬坡試驗

根據PB試驗得到的顯著因素和效應值，利用軟件設計最陡爬坡試驗的方向和步長。非顯著因素的取值根據PB試驗中的效應值確定。

1.3.3.4 響應面試驗

由最陡爬坡試驗得到的拐點可確定響應中心及接近響應值區間的因素取值范圍，利用Box-Benhnken（BB）法，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面分析。試驗模型對產物（1 000 μg/mL）作用下HT-29細胞存活率進行二次多元回歸擬合，得到等高線圖和響應面曲線圖，并獲得最優酶解制備條件，對模型進行方差分析，確定可信度并進行驗證。

1.3.4 低分子質量SCS分離

將在最優酶解條件下獲得的SCS酶解溶液經三氯乙酸除去蛋白后離心取上清，添加到Amicon攪拌超濾杯中，并連續通過不同分子質量的超濾膜（截留分子質量5、3、0.5 kDa）。超濾過程中的壓力調節0.10～0.22 mPa。收集3 種超濾成分，包括＞5、3～5、0.5～3 kDa，并冷凍干燥樣品，分別命名為SCS-1、SCS-2和SCS-3。測定不同分子質量的凍干SCS質量，并測定其對HT-29細胞存活率的影響。

1.3.5 動物實驗分組和處理

BALB/c小鼠適應性喂養1 周后隨機分為6 組，其中雌性和雄性各3 組，每組10 只，實驗采用最大灌胃劑量方法，每只小鼠灌胃劑量為1 mg/（g·d），分別灌胃SCS和SCS-F2，另設生理鹽水為正常對照組，按照每只0.2 mL/d進行灌胃，連續灌胃2 周后處死小鼠，取各組織臟器進行病理分析，經眼球采血后，進行血液指標和血生化指標的測定。

1.3.6 血常規測定

使用血液細胞分析儀進行血常規測定，指標包括紅細胞計數、紅細胞比容、平均紅細胞體積、白細胞計數、平均紅細胞血紅蛋白、血小板計數等。

1.3.7 血液生化指標測定

使用血生化測定儀進行液生化指標測定，包括谷丙轉氨酶、白蛋白等。

1.3.8 病理切片觀察

將剖取的臟器組織置于10%的中性福爾馬林組織固定液中，使用不同體積分數乙醇溶液和無水乙醇進行梯度脫水，二甲苯透明后，石蠟包埋。使用切片機對組織進行切片，厚度5 μm，按照試劑盒進行操作進行染色后使用光學顯微鏡檢測并采集圖片，進行病理分析。

取小鼠結直腸樣本制好的HE染色切片，顯微鏡下進行觀察并拍照記錄，每個樣本隨機選取2～3 個不同視野進行拍照，利用軟件進行圖像分析。選取組織結構完整性好的隱窩，對結直腸縱切后，記錄每個隱窩縱向一半時的細胞數為所需隱窩深度，每個樣本的計數均需要大于20 個隱窩。

1.4 數據處理

各個組別臟器指標、血生化以及血液學指標統計完全后將實驗組的數據與空白組利用SPSS軟件進行分析，采用單因素方差分析的方法對各組間的差異進行統計學分析，數據結果以平均值±標準差表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

如圖1所示，隨著酶添加量、pH值、溫度、酶解時間和底物質量濃度的增加，酶解產物對HT-29細胞的抑制率呈現先增加后降低或趨于不變的趨勢。其中，酶添加量在0.1、0.2 IU/mg時達到最大（圖1A），這是由于在一定的底物質量濃度時，大分子、長鏈的糖鏈會被酶解成短鏈的多糖，從而分子質量降低[13-14]，但是酶解產物對細胞的抑制率與酶解效率并不呈正相關，小分子的糖越多，分子質量越低并不一定代表對細胞的抑制活性越強。如圖1B所示，當pH值為7時對細胞的抑制率最高為58.05%；而后隨pH值增加，酶解產物的細胞活性抑制率降低。這可能是由于隨pH值增加，糖苷鍵斷裂加劇，聚合度減低，形成的單糖越多，為細胞生長提供的營養越充分，促進細胞增殖[21]，也因此細胞的抑制率有所降低。在固定酶添加量和pH值的條件下，酶解溫度對產物活性的影響如圖1C所示，酶解溫度為35 ℃時，產物對HT-29細胞的抑制率最高，為62.43%。這是由于溫度的升高，使酶與底物之間的分子運動速率增加，酶的作用效果加強，酶解效率也有所增加，糖苷鍵斷裂的數量增加，使更多具有抑制癌細胞生長的活性糖鏈片段被分離出來。在此條件下，隨酶解時間延長，細胞抑制率在60 min時達到最大值64.41%（圖1D）；而后酶解時間進一步延長，一方面底物和酶的含量有限，酶解效率減緩；另一方面，酶解得到的寡糖或者二糖增加，細胞生長需要的碳源增加，使得細胞的增殖能力有所上升，SCS對HT-29細胞的抑制率降低。保持其他條件不變的情況下，底物質量濃度為1、2 mg/mL時，產物對細胞的抑制率最大，分別為70.04%和70.11%（圖1E），且與其他各組差異顯著。細胞抑制率增長表明酶解反應后更多具有活性的SCS被解離[22-23]，糖苷鍵斷裂，具有抗腫瘤活性的糖鏈被解離出來。通過單因素試驗得到最適酶添加量、pH值、酶解溫度、酶解時間及底物質量濃度分別為0.1 IU/mg、7、35 ℃、60 min和1 mg/mL。

圖1 酶添加量（A）、pH值（B）、溫度（C）、酶解時間（D）、底物質量濃度（E）對細胞增殖活性的影響Fig. 1 Effects of enzyme dosage (A), pH (B), temperature (C),enzymatic hydrolysis time (D) and substrate concentration (E) on cell proliferation activity

2.2 PB試驗

利用Design Expert 8.0.6設計N＝12的Plackett-Burman，選擇對酶添加量（A）、底物質量濃度（B）、酶解溫度（C）、pH值（D）及溫度（E）5 個因素進行分析?？疾旄饕蛩貙χ苽涞拿附猱a物抑制結直腸癌細胞增殖活性的影響，以上述因素在單因素實驗中的結果選擇合適的范圍和高低水平，以酶解產物對結直腸癌細胞HT-29的抑制率為響應值，設計和結果分別如表1、2所示。

用Design Expert 8.0.6對實驗結果進行效應分析以及方差分析，結果如表3、4所示。由表3可知，酶添加量、底物質量濃度、酶解時間這3 個因素為正效應；pH值、溫度2 個因素為負效應，并且這些因素效應值的大小與貢獻率保持一致。由表4可知，模型顯著，說明PB模型選擇合適，各因素P值的大小反映了該因素對實驗結果影響的顯著程度，P值越小說明該因素對結果影響越顯著。因此可選用這3 個因素進行最陡爬坡試驗。對于其他的因素，pH值、溫度為負效應，因此應選取其低水平，即pH 5、溫度35 ℃。

表3 PB試驗設計因素水平及效應分析Table 3 Analysis of effect and contribution rate of each variable used in PB design

表4 PB試驗整體因素模型方差分析表Table 4 Analysis of variance for the effect of each variable on cell proliferation activity in PB design

2.3 最陡爬坡試驗

最陡爬坡法是將各因素正負效應的變化確定為爬坡方向，利用各因素的效應值大小確定變化步長，可以更經濟快速地逼近最佳值區域，得到有效的響應擬合方程。根據PB試驗結果，篩選出主要的影響因素并設計最陡爬坡路徑。最陡爬坡試驗拐點圖如圖2所示。編號為4的實驗是最大值點，對應的條件為酶添加量0.1 IU/mg、底物質量濃度1 mg/mL、酶解時間90 min。對應對HT-29細胞的抑制率可達80.95%，故該點為下一步BB試驗設計的中心點。

圖2 最陡爬坡試驗Fig. 2 Results of steepest ascent test

2.4 BB響應面試驗

利用Design-Expert 8.05b軟件對酶添加量（A）、底物質量濃度（B）、酶解時間（C）設計三因素三水平的實驗，BB試驗的結果如表5所示。BB試驗的數據分析使用Design-Expert 8.0.5b軟件進行方差分析，結果如表6所示。

表5 Box-Behnken試驗設計Table 5 Box-Behnken design and experimental results

表6 Box-Behnken實驗回歸模型方差分析Table 6 AVOVA of quadratic polynomial model developed based on Box-Behnken design

由表6可知，所選擇的回歸模型的P值小于0.05，表明整體模型對實驗結果有顯著的影響，具有可信度；失擬項的P值為0.053 5，不顯著，說明未知因素對結果的影響較小，殘差主要由隨機誤差引起，模型選擇適當；該模型的相關系數R2＝0.978 7，信噪比大于4，表明模型可信。低分子質量硫酸軟骨對HT-29細胞的抑制率（Y）對酶添加量（A）、底物質量濃度（B）、酶解時間（C）的多元二次回歸方程為：

由回歸方程所做的響應面立體圖見圖3所示，主要反映了酶添加量、底物質量濃度和酶解時間之間的交互作用。通過方程可知，二次項系數為負值，表明方程具有最大值。利用Design-expert8.0.5b分析計算，酶解最佳條件為酶添加量0.103 IU/mg、底物質量濃度1.005 mg/mL、酶解時間87 min，可得最大抑制率82.63%。按照工藝進行驗證實驗，所得結果為82.55%，與預測值基本吻合，說明模型很好地預測試驗結果。

圖3 兩因素交互作用的響應面圖和等高線圖Fig. 3 Response surfaces and contour plots showing individual and interactive effects of variables on inhibitory activity against cell proliferation

2.5 具有抗結直腸癌活性的低分子質量SCS的超濾分離

超濾分離后各組分相對含量如圖4A所示，共收集到3 個組分，凍干并計算相對含量，SCS-F1、SCS-F2和SCS-F3分別占SCS總質量的24.11%，57.07%和18.02%。配制1 000 μg/mL的各組分樣品進行細胞實驗，檢測各組分對結直腸癌細胞HT-29增殖活性的抑制效果。如圖4B所示，SCS-F2具有更高的抑制活性（88.87%），顯著高于陽性對照DDP處理組（50.70%）。同時分子質量最小的SCS-F3卻顯示出較低的抑制活性，約29.13%，低于陽性對照DDP組，這可能是由于分子質量降低，具有抗腫瘤活性的官能團減少或者消除[23]，使得該組分（SCS-F3）不具有抗腫瘤活性，因此選擇SCS-F2進行后續研究。

圖4 不同分子質量截留超濾后各組分相對含量（A）和對結直腸癌細胞HT-29增殖活性的影響（B）Fig. 4 Percentages of ultrafiltration fractions with different molecular masses (A) and their inhibitory effects on the proliferation of colorectal cancer cell line HT-29 (B)

2.6 具有抗腫瘤活性的低分子質量SCS毒性分析

動物實驗期間，各小鼠均未表現出明顯的不良反應，且無意外死亡狀況發生。隨機剖取各組中的小鼠，觀察不同處理對小鼠心、肝、脾、肺、腎和結腸組織的影響。表7中臟器質量結果顯示，SCS-F2對臟器的生長發育沒有影響。如圖5所示，各組臟器的形態、顏色和質地未見變化。其中肝臟組織切片的HE染色圖顯示各組肝臟中肝小葉排列規則、結構無異常、無病理性改變，但是在空白對照組中，可見少部分胞漿呈空泡網格狀，猜測可能有輕微炎癥現象，SCS-F2處理組中未見該現象，且干細胞索排列整齊，細胞形態正常，胞核位于中央，胞漿分布均勻，未見變性壞死，說明對肝臟沒有毒性影響，結合上述肝臟血生化指標（表7），SCS-F2處理組中血液中抗炎指標均高于空白組，說明SCS-F2一定程度上對肝臟具有保護作用。

圖5 SCS和SCS-F2對小鼠組織臟器的影響（200×）Fig. 5 Effects of SCS and SCS-F2 on visceral tissues of mice (200 ×)

表7 SCS和SCS-F2對小鼠臟器質量、血常規及血生化的影響Table 7 Effects of SCS and SCS-F2 on visceral organ mass, complete blood count and blood biochemical indexes in mice

腎臟病理切片觀察可以看出，各組小鼠腎臟組織中腎皮質及腎髓質分界清晰，腎小球分散且分布均勻，周圍組織未見明顯病變，均為正常腎臟組織。腎臟的基本功能是產生尿液[24-25]，清除體內代謝產物及不可被吸收的殘渣，具有保證機體內環境的穩定和新陳代謝的正常進行的作用[26-29]，說明SCS-F2對腎臟不具有毒副作用。

異常隱窩灶（aberrant crypt foci，ACF）是結直腸的一種癌前病變，是結直腸癌發生發展過程中的一個重要階段[30-31]。因此，對ACF的檢測和改善可以有效預防結直腸癌的早期發生[32]。如圖5所示，各組中小鼠結腸隱窩細胞排列整齊規則；對比正常對照組，SCS-F2處理組中不論是雄性或者是雌性小鼠中結腸均為出現柱狀細胞和杯狀細胞增生的現象。如圖6所示，與正常對照組和SCS處理組相比，SCS-F2處理后ACF數量較低，僅為6.11±2.09（雄性）和6.00±3.21（雌性），說明SCS-F2具有預防和治療結直腸癌的潛力。綜合以上結果，SCS-F2屬于實際無毒級，對小鼠內臟器官無不良影響。根據《保健食品檢驗與技術評價規范》，當死亡數量≤50%時，可以進入下一階段的毒理學試驗，實驗結果說明實驗組在1 000 μg/（g·d）劑量下滿足食品安全要求，可初步確定SCS-F2安全。

圖6 SCS和SCS-F2對小鼠結腸ACF的影響Fig. 6 Effects of SCS and SCS-F2 on colonic aberrant crypt foci in mice

3 結 論

本實驗以SCS為原料，以結直腸癌細胞抑制率為指標，利用酶解法和響應面法結合的手段，確定最佳酶解制備條件，通過凝膠層析色譜，分離純化出具有高活性的低分子質量SCS；采用小鼠急性毒性實驗，對SCS-F2的食用安全性進行評價。結果顯示，制備的低分子質量SCS具有較高的抑制結直腸癌增殖活性，且無毒副作用，在1 000 μg/（g·d）劑量下滿足保健食品的要求。本研究為開發高活性、低分子質量SCS的制備和研究提供新思路，初步了解SCS是否具有食用安全性，為SCS相關產品的日后開發和利用提供依據。