聯合疫苗研發關鍵技術

譚亞軍

中國食品藥品檢定研究院百白破疫苗和毒素室

國家衛生健康委員會生物技術產品檢定方法及其標準化重點實驗室

國家藥品監督管理局生物制品質量研究與評價重點實驗室

馬霄*

中國食品藥品檢定研究院百白破疫苗和毒素室

國家衛生健康委員會生物技術產品檢定方法及其標準化重點實驗室

國家藥品監督管理局生物制品質量研究與評價重點實驗室

傳染病流行是威脅人類健康和生命安全的重要問題?？v觀人類抗擊傳染病的歷史，疫苗接種是控制和消滅傳染病最有效、最經濟的衛生措施之一。我國自1978年起積極響應并正式實施兒童計劃免疫，目前免疫規劃疫苗已有14 種，其中單價疫苗有9 種，占全部疫苗的64%[1]。與此同時，非免疫規劃疫苗的研發和應用也得到不斷豐富。隨著家長的防病意識逐漸提高，越來越多的家長希望為孩子接種更多的疫苗。然而，由于疫苗本身特性和疾病流行情況，大多數兒童用疫苗集中在小年齡段接種，勢必造成嬰幼兒期疫苗接種過于頻繁，或將面臨接種部位不夠用的問題，另外還存在增加衛生部門的接種成本、降低幼兒接種的依從性、增加發生疑似不良反應的風險等問題。為此，世界衛生組織一直倡導接種聯合疫苗來減少以上問題發生的可能[2]，美國和歐盟則通過法規引導聯合疫苗的開發生產，比如允許不同的上市許可持有人合作開發聯合疫苗、允許企業開展同時接種的探索性臨床研究等，我國《疫苗管理法》也明確指出國家支持多聯多價等新型疫苗的研制。

聯合疫苗包括多聯疫苗和多價疫苗。多聯疫苗用于預防不同病原微生物引起的疾??；多價疫苗用于預防同一種病原微生物的不同血清型/株引起的疾病[3]。相比于單價疫苗，聯合疫苗優勢明顯，主要體現在：①可以減少接種劑次，簡化免疫程序，提高疫苗接種率和及時性，特別是在特殊原因導致兒童疫苗遲種或漏種的情況下，聯合疫苗可以發揮更大的優勢。②可以通過減少接種次數而降低嬰幼兒因接種造成的疼痛、壓力和不適，提高依從性。③可以相對減少疫苗中總佐劑、防腐劑或穩定劑的用量，降低不良反應的發生風險。④可以減少家長攜帶嬰幼兒往返接種單位的頻次、時間和誤工成本，還可在一定程度上降低嬰幼兒與家長等陪同人員感染相關傳染病的風險。⑤可以減少接種人員的工作量，提高工作效率，降低潛在的接種差錯和管理風險。⑥可以簡化疫苗供應，減少冷鏈存儲難度和縮減存儲空間，降低接種成本。因此，聯合疫苗是未來疫苗發展的重要方向之一。

1 聯合疫苗開發的基本原則

安全、有效和質量可控是疫苗開發的3 項基本原則，聯合疫苗的研發也必須遵循上述原則。聯合疫苗不是簡單地將各個疫苗或抗原組分的混合，其在開發時應充分考慮多種組分聯合后產生的相互作用對疫苗安全性和有效性的影響，以及聯合疫苗中其他非抗原成分對有效抗原的影響。聯合疫苗的質量控制包括對疫苗中各個組分的檢測，以及對疫苗整體質量的檢測。在臨床研究中，應采用聯合疫苗中各組分分別但同時接種作為對照組，同時還應充分評估各組分在體內的相互作用而產生的影響。因此，不能簡單地采用一種固定的模式研究聯合疫苗的安全性和有效性。根據聯合疫苗的研究經驗和結果，我國制定了《聯合疫苗臨床前和臨床研究技術指導原則》，從疫苗研發生產、質量控制、臨床研究多個方面對聯合疫苗的開發提出要求[4]。

另外，在聯合疫苗臨床研究中，還需要考慮到聯合疫苗中已有抗原成分對免疫程序中其他疫苗有效性、安全性的影響。比如，現在的肺炎球菌結合疫苗（pneumococcal conjugate vaccine，PCV）、腦膜炎球菌結合疫苗（meningococcal conjugate vaccine，Men）大多含有白喉類毒素（diphtheria toxoid，DT）或者破傷風類毒素（tetanus toxoid，TT）作為多糖載體，許多聯合疫苗也含有白喉或者破傷風抗原成分，因此，需要評價含相同抗原成分的聯合疫苗和其他疫苗免疫有效性的相互影響。

由于聯合疫苗的抗原種類多、含量高、免疫機制復雜，在聯合疫苗臨床研究中，還需要進一步評價對計劃免疫程序中接種時間較近的其他疫苗安全性、有效性的相互影響。中國食品藥品檢定研究院積極開展了含無細胞百白破疫苗（diphtheria,tetanus and acellular pertussis vaccine，DTaP）組分的聯合疫苗與其他免疫程序相近疫苗的有效性相互影響研究，對DTaP基礎免疫與PCV、Men、脊髓灰質炎滅活疫苗（inactivated poliomyelitis vaccine，IPV）、b 型流感嗜血桿菌結合疫苗（haemophilus influenzae type b conjugate vaccine，Hib），以及DTaP 加強免疫與水痘疫苗（varicella vaccine，Var）的有效性是否存在相互干擾進行了臨床評價研究，結果表明上述疫苗對DTaP 疫苗的有效性無顯著影響。

2 聯合疫苗技術路線

目前，世界上已批準使用的聯合疫苗有幾十種。按照所含抗原種類劃分，聯合疫苗分為細菌蛋白組成的聯合疫苗、細菌多糖組成的聯合疫苗、病毒組成的聯合疫苗以及不同類別成分組成的聯合疫苗，如蛋白-多糖成分組合、蛋白-病毒成分組合、蛋白-多糖-病毒成分組合等。

2.1 細菌蛋白組成的聯合疫苗

由于蛋白類抗原本身具有免疫原性和抗原性，不同蛋白抗原間的免疫相互影響較小，采用不同蛋白抗原聯合制備是聯合疫苗開發中最常用的技術路線之一。細菌蛋白組成的聯合疫苗中最具代表性的是百日咳、白喉和破傷風聯合疫苗（DTP），是由百日咳菌體或百日咳抗原組分、精制DT和TT 按適當比例配制而成，并吸附在氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑上，用于預防百日咳、白喉和破傷風3 種疾病[5]。

2.2 細菌多糖組成的聯合疫苗

細菌中存在多種糖類物質，它們在細菌的識別、信號傳遞、黏附、感染及防御等方面發揮著重要作用。由于多糖的免疫原性，將特異性的多糖純化后制成的疫苗稱為多糖疫苗。多糖蛋白結合疫苗是通過化學方法將多聚核糖基核糖醇磷酸酯（polyribosylribitol phosphate，PRP）與載體蛋白共價結合，抗原類型從胸腺非依賴性抗原轉變為胸腺依賴性抗原，能激發2 歲及以下兒童、老年人和免疫缺陷者體內產生有效的免疫應答，并產生免疫記憶。Men、Hib 和PCV 多糖結合疫苗是兒童期免疫接種非常重要的一類疫苗。由于肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌等致病菌的細菌莢膜多糖抗原不同，可以分為多個血清型。為了能覆蓋臨床中主要致病的血清型，采用多種細菌血清型特異性多糖成分或者多糖-載體蛋白結合組合的多價疫苗是聯合疫苗另一主要技術路線。從細菌多糖組成的聯合疫苗的實際研發過程中，可以看出不同多糖結合疫苗在聯合時應重點考慮不同載體蛋白的適用性、各抗原含量的配方比例等，以及在保證疫苗抗原發揮最大免疫原性的前提下，如何確定抗原的最低含量和載體蛋白的種類及含量。

2.3 病毒組成的聯合疫苗

病毒組成的聯合疫苗主要分為三類：滅活病毒聯合疫苗、減毒活聯合疫苗、病毒蛋白抗原的多價疫苗。滅活病毒聯合疫苗包括以乙型肝炎疫苗（hepatitis B vaccine，HBV）為基礎的聯合疫苗，如甲型乙型肝炎聯合疫苗、正在開發的腸道病毒71 型-柯薩奇病毒A 組16 型聯合滅活疫苗等；減毒活聯合疫苗主要包括以麻疹-腮腺炎-風疹疫苗為基礎的聯合疫苗，如麻腮風聯合疫苗（measles，mumps and rubella vaccine，MMR）、麻腮風水痘聯合疫苗（measles，mumps，rubella and varicella vaccine，MMRV）[6-8]；病毒蛋白抗原的多價疫苗以多價人乳頭瘤病毒疫苗為代表。

需要注意的是，聯合疫苗中可能存在病毒疫苗間的干擾現象，如高濃度的麻疹和腮腺炎疫苗毒株易被干擾，Var 與MMR 同時免疫會抑制Var 免疫應答，可通過提高Var 劑量避免這一弊端。

2.4 不同類別成分組成的聯合疫苗

不同類別成分組成的聯合疫苗中包括細菌蛋白、細菌多糖、病毒蛋白等各類抗原成分，是現今聯合疫苗開發的主要方向。在開發中除了需要考慮抗原成分相容性等因素外，還需要充分考慮免疫程序的相容性，將免疫程序接近的不同類別疫苗聯合是這類疫苗開發的重點。

新型聯合疫苗的發展開始于DTP 聯合疫苗。原因主要是百日咳、白喉和破傷風這3 種兒童傳染病在短期內尚不能消滅，會長期使用這種疫苗；DTP 聯合疫苗安全性好，2月齡即可接種；DTP 聯合疫苗中的DT、TT 抗原性質穩定，與其他抗原成分聯合不易產生干擾現象等。其中，DTaP 聯合疫苗中各抗原組分均為純化抗原，組分清晰，更利于分析不同抗原間、抗原與非抗原成分間的相互作用，現今以DTP為基礎的聯合疫苗多為DTaP 聯合疫苗[9-10]。

基于上述原因，在傳統DTP聯合疫苗的基礎上，含其他各種疫苗成分包括多糖成分、滅活病毒成分的新型聯合疫苗得到了飛速發展。Hib 免疫程序與DTP 的免疫程序完全相同，IPV、HBV免疫程序與DTP 基礎免疫程序部分相同或具有相似性，具備較好或一定的多聯疫苗研發基礎。Hib、IPV 和HBV 與DTP聯合組成的四聯、五聯、六聯疫苗相繼問世。此外，還有兒童用百白破-IPV 疫苗和成人用百白破-IPV 疫苗等。越來越多的國家和地區逐步開始使用含百白破成分的四聯、五聯或六聯疫苗。其中，超過100 個國家和地區將DTP-HBV-Hib 作為基礎免疫，在有關國際組織的援助支持下，多在中低收入國家和地區使用。

3 聯合疫苗面臨的挑戰

雖然近年來成功研發的和正在研發的聯合疫苗種類日益增多，但是聯合疫苗并不是簡單地將多個單價疫苗的混合，在其研發、制備、評價和使用中還存在許多關鍵問題需要深入研究和解決，面臨很多挑戰，包括全液體劑型技術、載體蛋白免疫原性評價及與聯合疫苗中已有抗原成分的替代、佐劑對聯合疫苗中抗原成分的影響、免疫程序對聯合疫苗的影響等。

3.1 全液體劑型技術

由于含DTP 成分的聯合疫苗多數含有多糖結合疫苗組分，而鋁佐劑對部分多糖結合疫苗的有效性有一定影響，因此現有的聯合疫苗大多是將多糖結合疫苗組分單獨分裝，臨用前混合，以最大程度降低影響。但是，臨用前混合使用仍有無菌風險和使用過程中發生錯誤的風險。全液體劑型聯合疫苗通過對佐劑工藝和制劑工藝的優化，開發單劑量、單一包裝、無需臨用前混合的疫苗成品，避免了凍干工藝引入的安全性風險及產能的限制，同時避免了凍干疫苗在免疫接種前需進行繁瑣的復溶過程，大大降低了接種安全性風險和工作量。從疫苗工藝的先進性來說，全液體疫苗更勝一籌，操作效率更高，更有利于安全注射。

在全液體疫苗的研發過程中，關鍵是通過抗原在液體制劑中的穩定性研究、各抗原組分間相互作用的評估、抗原含量的優化、制劑工藝的革新，研制出安全有效、使用方便的產品，對于含佐劑的疫苗制劑，還應包括佐劑的制劑配方對抗原穩定性的影響等。

3.2 載體蛋白免疫原性評價及與聯合疫苗中已有抗原成分的替代

百白破疫苗和多糖蛋白結合疫苗常被開發為聯合疫苗或聯合接種或間隔接種使用。目前多糖蛋白結合疫苗中所用的載體蛋白主要是DT、TT 和白喉毒素的無毒突變體交叉反應物質197（cross-reacting material 197，CRM197）。DT 和TT 既作為疫苗抗原來免疫，又作為多糖結合疫苗的載體蛋白來重復應用，是否會對疫苗的免疫原性產生影響越來越受到研究人員的關注。主要包括以下幾種情況：載體蛋白啟動效應，載體蛋白誘導的表位抑制效應（carrier-induced epitope suppression，CIES）和旁觀者干擾效應。

載體蛋白啟動效應一般是先接種含有DT 或TT 的疫苗，再接種含相同載體的多糖結合疫苗，對疫苗免疫應答所產生的效應。這種預先誘導的針對載體蛋白的抗體可能會增強連接在同一載體蛋白上的多糖的免疫應答，但預存的過量載體蛋白抗體也有可能會抑制連接在同一載體蛋白上的多糖的免疫應答。載體蛋白啟動效應增強免疫應答可能是針對載體蛋白的特異性輔助性T 細胞（T helper cell，Th）和T 細胞介導的細胞因子增加所致。在動物體內進行的幾項試驗顯示，低劑量TT（0.025～0.25μg）初免對以TT 為載體的PCV-TT 和Men-TT 的多糖抗體應答具有增強作用；但高劑量TT（25μg）初免則會對多糖抗體應答產生抑制作用。在兒童和成人中也觀察到了大量的載體蛋白啟動效應。與未接種TT 或DT 疫苗的嬰兒相比，提前接種TT 或DT 疫苗，然后接種Hib-TT/DT 的嬰兒在初次接種和加強接種Hib 后，PRP 的抗體水平更高[11-18]。

除上文所述過量的載體蛋白初免可能會減弱多糖的免疫應答以外，同時接種相同載體蛋白的多糖結合疫苗可能會引起多糖免疫應答水平的降低，即載體蛋白誘導的表位抑制效應。其中可能涉及的機制有：①預先存在的針對載體蛋白的抗體可能通過空間位阻效應，有利于抗載體B 細胞反應，而不利于抗多糖B 細胞反應。②優勢載體特異性B 細胞可能通過競爭機制剝奪了多糖特異性B 細胞、T 細胞等必需資源。③在免疫應答后期，調節性T 細胞會進行負向調節，避免過強的免疫應答[11]。研究顯示，11 價雙載體肺炎球菌結合疫苗（PncDT/TT11，7 個血清型多糖與TT 偶聯，4 個血清型多糖與DT 偶聯）與全細胞百日咳疫苗（whole cell pertussis vaccine，wP）合用，破傷風載體介導的反應也可能受到一些抑制，但這種抑制被wP 的輔助作用掩蓋了。通過將wP 替換為無細胞百日咳疫苗（acellular pertussis vaccine，aP），這種佐劑效應被消除，所有與TT 結合的肺炎球菌結合物的反應都顯著降低，顯示了載體蛋白誘導的表位抑制效應[19]。隨著嬰兒期使用多種含aP 的疫苗的增加，可能需要新的佐劑和載體蛋白技術。

旁觀者干擾效應即多種疫苗共同接種，會影響同類載體或以其他載體蛋白制備的多糖蛋白結合疫苗的免疫作用。以CRM197為載體蛋白的多糖蛋白結合疫苗，可能是通過DT 和CRM197 之間共用的T 細胞機制介導，并且會影響共同接種的其他抗原。這種旁觀者干擾效應在以CRM197為載體蛋白的結合疫苗使用中已被證實，特別是乙肝表面抗體（HBsAb）和Hib 抗體應答容易受到干擾[20]。

針對聯合疫苗中已有抗原成分作為載體蛋白使用時會出現載體蛋白效應，有可能降低疫苗免疫原性，迫切需要開發新的載體蛋白，避免聯合疫苗中已有抗原成分作為載體蛋白多次重復免疫接種。另外，應探索優化聯合疫苗中已有抗原的含量，可以通過有效性的評估適當調整相應抗原的含量，在保證有效性的同時降低抗原含量，獲得更佳的安全性。

3.3 佐劑對聯合疫苗中抗原成分的影響

鋁佐劑廣泛應用于聯合疫苗，包括氫氧化鋁、磷酸鋁和無定形羥基磷酸鋁硫酸鹽。當蛋白質抗原吸附在鋁佐劑顆粒時，通過表面的相互作用，可能影響其構象表位和穩定性。氫氧化鋁的正表面電荷吸引帶負電荷的離子，在粒子附近形成表面層。與疫苗制劑溶液的pH 值相比，氫氧根離子的吸引力使該層pH 值增加了1～2 個單位。磷酸鋁佐劑顆粒周圍的表面層pH 值也會降低。吸附到鋁佐劑上的抗原暴露于與溶液中存在的抗原不同的pH 值，這有可能會加速某些蛋白質脫酰胺和氧化。微環境pH 值的升高可能解釋了Hib 莢膜多糖-蛋白結合物中的磷酸二酯鍵在被氫氧化鋁吸附后發生水解的原因，這種水解過程在堿性條件下會加速?？乖c鋁佐劑的吸附，可能對其穩定性沒有影響，也可能降低或者增強穩定性。采用生物、物理等技術方法對聯合疫苗中鋁佐劑對各抗原成分的影響進行特異性評估非常必要。

抗原的吸附，通常會增強其免疫反應。鋁佐劑的免疫刺激作用來自多種機制，包括減緩抗原從給藥部位擴散，增加炎性細胞積聚，激活補體，誘導單核細胞分化為樹突狀細胞以及樹突狀細胞對抗原的攝取、抗原呈遞和CD4+T 細胞的活化等。但鋁佐劑誘導Th1 和Th17 應答反應弱，而這些應答反應可能是誘導針對瘧疾和結核等傳染病的保護性免疫所必需的。研究發現，針對不同機制激活免疫反應的佐劑與鋁佐劑的結合可以產生協同效應，可能誘導更有效或更持久的免疫反應，并可減少疫苗中的抗原使用量。

3.4 免疫程序對聯合疫苗的影響

在聯合疫苗使用中，免疫程序的設定對疫苗誘導產生免疫應答有重要的影響。如DTaPIPV-Hib 聯合疫苗在法國的臨床試驗中，分別按2、3、4月齡和2、4、6月齡兩個免疫程序進行免疫，后者誘導產生的特異性抗體普遍高于前者[21-24]。應在臨床研究階段探索聯合疫苗的免疫程序，以確定疫苗接種在最短的時間內誘導產生良好的免疫應答。另外，由于不同國家規定的免疫接種程序不同，聯合疫苗應有接種程序的可塑性。如美國規定的HBV免疫程序比較靈活。使用DTPHBV 聯合疫苗時，出生首劑用單價HBV 免疫，2、4、6月齡用DTaP-HBV 四聯疫苗免疫[25]。此程序中HBV 多免疫一個針次，對免疫效果沒有太大影響。在我國，目前含DTP-HBV 聯合疫苗的接種程序與現行HBV免疫程序（0、1、6月齡）存在一定沖突，是含DTP-HBV聯合疫苗未來應用所面臨最主要的挑戰，需要解決的問題包括第2劑次接種推遲對HBV 免疫原性和防控效果的影響、多劑次接種的安全性以及出生劑次與后續劑次之間的交替使用等問題。另外，聯合疫苗使用中還應注意不同生產廠家制造的聯合疫苗能否互相使用、抗原的重復免疫等問題。

4 展望

聯合疫苗不僅為個體提供更全面、更及時的保護，而且在全球或單個國家內都會產生重要的公共衛生意義，充分顯現了疫苗預防疾病的高效性。盡管成功研制一種聯合疫苗面臨諸多挑戰，包括不同組分之間的相容性問題、抗原含量的優化、佐劑工藝的優化、制劑工藝的革新、理想的臨床方案和免疫程序的適應等，但隨著生物技術的快速發展，我國聯合疫苗的研發取得了很多重大突破，如13 價PCV 的獲批上市、IPV 的成功研制、DTaP-IPVHib 等疫苗的加速研發。我們應該借鑒國內外的寶貴經驗，加大聯合疫苗前期基礎研究的投入，解決當前聯合疫苗面臨的瓶頸問題，為我國新型疫苗的研發及免疫策略優化提供更多的選擇。