補腎活血法調控卵巢顆粒細胞凋亡防治卵巢早衰的機制研究進展

郭海霞,葉長青,金夢媛,羅洪斌

湖北民族大學醫學部(湖北 恩施 445000)

卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是指患者在40歲以前便出現了因卵巢內卵泡耗竭等原因引起的卵巢功能衰竭疾病,該類女性的月經初潮年齡或正?；蜓舆t,血清促卵泡激素(FSH)水平高、雌激素水平低,臨床癥狀主要有月經量少、閉經、不孕等,有的患者還會伴有潮熱、盜汗等圍絕經期綜合征表現[1]。POF屬于女性內分泌疾病,是引起不孕的主要原因之一,其發病的因素多,主要有免疫功能紊亂、遺傳、放射治療、化學治療等[2]。研究發現[3]POF發病率約為1%,且逐年增加,30歲以前發病率為0.1%,發病年齡呈年輕化趨勢。目前,西醫主要采用激素替代療法治療,可保護中樞神經,減少AD的發生風險[4],但長時間使用激素容易增加患子宮內膜癌、乳腺癌等疾病的風險;同時許多POF患者無法正常受孕,往往會借助輔助生殖技術助孕,但由于不易獲得質量較高的卵子進行體外受精,因此很多患者最終很難成功妊娠?，F代研究表明[5]中醫可改善月經、排卵及圍絕經期癥狀,如潮熱、盜汗、失眠、焦慮和骨質疏松癥等,對多種婦科疾病如多囊卵巢綜合征等都有良好療效。中醫認為,POF虛是根本,根據“因虛致瘀”理論,血瘀是其關鍵病機,臨床中運用補腎活血法治療POF療效明顯,研究表明[6]補腎活血方可通過降低FSH和T淋巴細胞比例(CD4+CD25+/CD4+)水平,提高抑制素(Inh)和雌二醇(E2)水平,減少細胞凋亡,從而使POF大鼠的卵巢健康狀況有所改善,即可調節性激素水平、抑制細胞凋亡,從而對卵巢的儲備功能起到保護作用;劉慧萍等[7]發現補腎活血方可抑制Fas、FasL的mRNA表達和提高E2,降低黃體生成素(LH)、FSH水平,改善卵泡顆粒細胞的凋亡最終達到治療作用。

補腎活血法主要是通過調控下丘腦-垂體-卵巢軸的神經內分泌功能、改善卵巢血流動力學與卵巢微循環、抑制卵巢顆粒細胞凋亡等發揮對卵巢早衰的調節作用[8],其中抑制卵巢顆粒細胞凋亡是其主要的作用機制之一。本文將就補腎活血法通過調控卵巢顆粒細胞凋亡防治卵巢早衰的作用機制進行綜述,以期為臨床及實驗研究提供相關參考依據。

1 POF與顆粒細胞凋亡的關系

細胞凋亡是一種主動的、程序性的、基因控制的細胞自主有序的死亡,它在卵泡發育的各個階段都有參與,因此,在卵巢疾病的發生發展中起到關鍵作用。卵泡的組成部分主要有卵母細胞、顆粒細胞和膜細胞,卵巢和卵泡微環境的自身穩態維持著卵母細胞的成熟,而卵母細胞發揮指導和促進顆粒細胞增殖和分化的功能,顆粒細胞提供卵母細胞生長發育所需的營養物質,二者在卵泡的發育、成熟和排卵的整個過程中都存在著緊密的聯系,其中,顆粒細胞的狀態影響著卵母細胞的質量和胚胎發育潛能。一般情況下,卵泡閉鎖是卵巢生理功能的重要部分,可清除不正常的組織,一旦顆粒細胞的凋亡機制發生紊亂,大量卵泡閉鎖發生在卵母細胞還未成熟時,并且其閉鎖速度快于生理代謝的速度時,卵巢儲備將會過早的耗盡[9],所以在一定條件下,不可避免地加快卵泡閉鎖,從而引起POF發生。

過度或紊亂的顆粒細胞凋亡是卵母細胞發育能力受損的標志,影響了卵母細胞和顆粒細胞在卵泡發育中的緊密聯系,抑制了卵母細胞的生長,導致卵泡閉鎖加速,從而影響卵巢功能[10],因此,POF的發生與卵泡顆粒細胞凋亡及卵泡閉鎖密切相關。卵泡顆粒細胞凋亡導致卵泡閉鎖,進而導致女性生殖能力的衰退[11]。HUANG等[12]發現對發生卵泡顆粒細胞紊亂的POF小鼠進行干預后,可逆轉相關指標并糾正相關蛋白的表達,由此可見,在POF的發展過程中,卵泡顆粒細胞發揮了關鍵性作用。

2 補腎活血法與顆粒細胞凋亡的關系

細胞凋亡是機體重要的自我穩態機制,是由促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白和凋亡調控因子等在相應的信號通路的作用下共同參與的過程[13],與顆粒細胞凋亡相關的蛋白有Bcl-2蛋白家族、Caspase-3、FOXO3、Myc和P53等[14]。研究顯示[15]補腎活血中藥具有抑制顆粒細胞凋亡的作用。補腎活血中藥能夠抑制雷公藤多苷所致氧化應激對卵巢Bcl-2相關X蛋白(Bax)、細胞色素C、caspase-3的激活,使顆粒細胞的凋亡減少,避免了卵泡的過度閉鎖,從而保護了卵巢的儲備功能;由當歸、熟地黃等組成的補腎活血方能夠使POF小鼠卵巢中Bcl-2/Bax的比值增大,caspase-3 mRNA的表達量減少,從而使卵巢顆粒細胞的凋亡受到抑制,有效減少卵泡閉鎖,進而起到改善卵巢儲備功能的作用[16];益腎調經方可能是通過增加抗凋亡因子Bcl-2的表達,使促凋亡因子caspase-3、Bax的表達下調,從而使大鼠卵巢顆粒細胞的凋亡受到抑制,達到改善卵巢功能的作用[17]。

3 顆粒細胞凋亡相關蛋白

3.1Bcl-2蛋白家族Bcl-2家族蛋白是調控細胞凋亡的重要蛋白。Bcl-2蛋白可有效抑制細胞凋亡,利于卵泡的生長發育;Bax則相反,它可促進細胞的凋亡,從而加快卵泡閉鎖的速度,二者共同調控著卵巢卵泡生長發育的各個階段。研究顯示亡[18]Bax蛋白在卵子細胞死亡過程中起關鍵性作用,它可運用小分子干擾RNA(siRNA)干擾Bax的表達,從而達到抑制顆粒細胞凋亡的作用。bcl-2蛋白和bax蛋白形成同二聚體或異二聚體表達,調控顆粒細胞的凋。研究表明亡[19]大鼠卵巢顆粒細胞的凋亡可由顆粒細胞中自噬體的積累使得Bcl-2的表達減少而誘導,并加速卵泡閉鎖從而發生POF。廖風嬌[20]研究表明新加歸腎丸具有改善雷公藤多苷導致的大鼠卵巢損傷的作用,可通過調節Bax、Bcl-2 mRNA的蛋白表達量來達到促進顆粒細胞增殖的作用,進而使卵巢儲備功能得到改善。

3.2Caspase-3Caspase蛋白酶家族在細胞凋亡過程中具有重要作用,caspase-3又是其中最重要的細胞凋亡效應分子,它可通過多種途徑誘導細胞凋亡的發生。研究表明[21]Caspase蛋白酶可通過激活Caspase-3等引起Caspases的級聯反應,最終導致細胞凋亡,所以,細胞凋亡的相關情況可通過Caspase-3的表達反應出來,因此,caspase基因很可能是誘導顆粒細胞發生凋亡的主要機制之一。張麗娜等[21]研究發現補腎活血方能抑制Bax及Caspase-3蛋白的表達,治療雷公藤多苷誘發的卵巢顆粒細胞凋亡引起的卵巢早衰。

3.3FOXO3FOXO3是FOXO的轉錄因子,顆粒細胞的凋亡可通過上調FOXO3的表達誘發,進而誘導卵泡發生閉鎖。FOXO3a轉錄因子為FOXO蛋白家族的成員之一,調控細胞的增殖、生長、分化、調亡及衰老等重要的生命過程。另外,FOXO3a轉錄因子作為磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路下游的重要靶蛋白之一,具有調節細胞周期阻滯蛋白P27kip1和促凋亡蛋白Bim的功能,從而對細胞周期及細胞凋亡進行調控。研究顯示[22]二仙湯具有降低FOXO3a表達的作用,從而使P27kip1及Bim的表達下調,進而抑制卵巢顆粒細胞的凋亡,具有保護因順鉑損傷的卵巢顆粒細胞的作用。

3.4Myc蛋白Myc是核蛋白類基因中的一種,是較早發現的癌基因,C-myc、N-myc和L-myc是目前發現的3種,Myc可影響細胞的周期、分化,調控細胞的增殖和凋亡。研究顯示,Myc蛋白可能通過促進顆粒細胞的凋亡,從而使卵泡膜細胞發生凋亡。隨著卵泡發育和功能的完善Myc基因的表達會發生相應變化,在卵泡發育的原始階段呈強陽性,隨著卵泡的發育,強陽性會逐漸減弱,在卵泡閉鎖時,可能只在卵泡膜細胞中可檢測到Myc蛋白。王海丹等[23]研究表明補腎健脾方具有治療POF的作用,可能是通過提高E2水平,激活雌激素受體(ER),從而促進c-Myc的表達,調節端粒酶逆轉錄酶(TERT)的表達來促進卵巢顆粒細胞的增殖。

3.5P53p53是一種重要的促凋亡基因,它可通過抑制細胞的轉化生長,調節細胞的分裂過程,p53的激活還可調節其它凋亡因子發揮作用。研究表明[24]p53可能通過抑制顆粒細胞中由TGF-β1誘導的有關miRNA的表達來調控卵巢顆粒細胞的生長、發展和凋亡。作為DNA損傷凋亡通路中的關鍵調控因子,P53的一個同系物TAp63可與磷酸化的c-Abl(一種原癌基因)發生相互作用,然后級聯激活促凋亡相關分子Bax和Bak,使顆粒細胞凋亡發生級聯反應。常卓等[25]研究發現,運用補腎活血方對不明原因復發性流產(URSA)小鼠的蛻膜化過程進行調節,可發現蛻膜化中后期的p53、p21表達顯著降低。

4 顆粒細胞凋亡相關信號通路

4.1PI3K/Akt/mTOR信號通路PI3K/Akt信號通路對卵巢顆粒細胞的凋亡起到調控作用,該通路主要參與細胞的增殖、分化、凋亡等過程。PI3K/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路廣泛存在于卵母細胞和顆粒細胞中,可維持原始卵泡激活與休眠、存活與凋亡之間的動態平衡。經研究發現[10]調節顆粒細胞的增殖和分化有PI3K/Akt信號通路中的許多分子的參與。研究表明[26]補腎活血方可對PI3K/Akt/mTOR信號通路進行激活,進而使caspase3的表達下調,卵泡凋亡減少,最終改善卵巢儲備功能。新加歸腎丸通過激活mTOR信號通路,從而提高細胞周期蛋白D2的表達,加速卵巢顆粒細胞周期的進程,從而實現顆粒細胞的增殖達到改善卵泡發育的作用[27]。對PI3K/AKT/mTOR通路進行激活后,還可使下游自噬效應分子Beclin 1及微管相關蛋白2輕鏈3(LC3-II)的表達減少并降低p62的消耗,從而修復雷公藤甲素誘導的大鼠卵巢顆粒細胞的自噬損傷,進而改善卵巢儲備功能[28]。左歸丸通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路的蛋白表達,使Bcl-2得到上調,Bax的表達下調,抑制卵巢顆粒細胞的凋亡,使殘存卵泡得到發育,進而保護卵巢功能[29]。補腎活血方可調節卵巢組織中的顆粒細胞,上調小鼠PI3K、AKT及MTOR的蛋白表達量,使E2升高,FSH和LH降低,從而達到促排卵,減少卵泡閉鎖的作用,最終使卵巢環境和內分泌功能得到改善[30]。

4.2NF-κB信號通路核轉錄因子-кB(NF-кB)可參與激活多種細胞進程中的基因轉錄、細胞凋亡和免疫應答的信號傳導。NF-κB在次級卵泡到竇卵泡的過渡過程中被激活,可通過卵泡刺激素受體(FSH receptor,FSHR)及其相應的靶分子起到抑制顆粒細胞凋亡的作用,從而促進細胞的增殖和分化,與此同時,被激活的Bcl-2在細胞質內與NF-κB形成Bcl-2-NF-κB復合物也具有抑制顆粒細胞凋亡的作用。POF的發生與NF-κB失活關系密切,如果NF-κB在卵巢卵母細胞和顆粒細胞發育過程中的信號轉導減弱,卵泡發育將會出現異常,導致卵泡閉鎖,最終引發POF。研究發現[31]下調轉基因小鼠中的NF-κB,其竇卵泡數量減少了,E2和抗繆勒氏管激素(AMH)的水平也降低了,認為NF-κB可能是通過葡萄糖調節蛋白78(GRP78)介導的內質網應激來調節卵泡刺激素受體的表達,從而使顆粒細胞發生增殖,促使卵泡的發育成熟。袁苑[32]研究發現補腎促卵方可使骨形態發生蛋白7(BMP-7)的表達水平上調,caspase-3的表達下調,從而抑制雷公藤多苷誘導的離體小鼠卵巢顆粒細胞的凋亡,進而恢復其卵巢功能,其可能是通過細胞信號轉導分子(Smad)和NF-κB兩條信號通路來介導對BMP-7、caspase-3的調控。

4.3TGF-β/Smads信號通路轉化生長因子-β(TGF-β)/Smads通路對顆粒細胞的增殖、分化具有重要的調控作用,參與了卵泡的生長發育,卵巢顆粒細胞可分泌TGF-β1,并且顆粒細胞表面含有TGF-β受體,它對竇前卵泡生長、顆粒細胞增生與分化具有促進作用。研究顯示[33]補腎活血方對免疫性POF小鼠TGF-β1/Smads信號通路的傳導具有明顯的促進作用,從而利于顆粒細胞的增殖和分化,減少了顆粒細胞的凋亡,進而調控了卵泡的發育,改善了卵巢的功能。卵巢顆粒細胞可分泌一種肽類物質激活素A(Act A),補腎活血方可促進Act A的分泌,使激活素ⅡA型受體、Smad2、Smad3的表達上調,然后通過Act A/Smads信號轉導通路,推動卵巢顆粒細胞的增殖和分化,從而提高芳香化酶的表達和活性,使卵巢顆粒細胞更好的發揮調節卵泡發育的功能,促使卵巢局部微環境得到很好的改善[34]。

4.4Nrf2/ARE信號通路Nrf2/ARE信號通路主要由核因子NF-E2相關因子(Nrf 2)、Bach1和抗氧化反應元件(Are)等組成,為最重要的內源性抗氧化應激通路[19],具有維持細胞穩態、抑制細胞凋亡等方面的重要作用。研究表明[15]補腎促卵方通過調控卵巢Nrf2/ARE信號通路,抑制Kelch樣ECH相關蛋白1(Keap1)過表達,從而促進Nrf2核易位,使下游抗氧化酶活性得到激活,可對抗雷公藤多苷誘導的DOR小鼠的卵巢氧化應激損傷,從而避免卵泡顆粒細胞過度凋亡,防止卵泡發生異常閉鎖。

近年來,POF的發病率不斷上升,中醫藥療法在POF防治方面的作用越來越被廣大患者所接受。POF在中醫典籍上沒有記載,但從其癥狀來看,常與“血枯”“經水早斷”“不孕”等有關。古代醫家對該類疾病的病因病機雖然各有看法,但都認為腎虛是主要致病因素,《素問·上古天真論》云:“女子……,七七任脈虛,太沖脈衰少,天癸竭,地道不通,故形壞而無子也?！薄秼D人歸·經脈之本》曰:“天癸者,言后天之陰氣,陰氣足而月事通?！薄秱髦忆洝り庩柶吩?“元陰者,即無形之水,以長以立,天癸是也,強弱系之,故亦曰元精?！薄陡登嘀髋啤吩?“經水出諸腎”,都認為腎藏精,主生殖,腎精的盛衰影響著天癸的至竭、沖任二脈的盛衰以及月事的行止,腎虛精虧可致天癸不能按時正常充盈而出現過早的耗竭,最終導致POF。女子以血為本,以氣為用,氣血調和,則臟腑功能正常,腎虛精虧則瘀血內生,可致不孕,《陳素庵婦科補解》曰:“婦人諸疾,多由經水不調。調經,然后可以孕子,然后可以卻疾?！薄秼D科玉尺》曰:“養血之法,莫先于調經。蓋經不調則血氣乖爭,不能成孕?！薄杜埔肌芬嘣?“婦人無子,皆由經水不調……種子之法,即在于調經之中?！币坏庋д{,則極易導致瘀血阻滯胞中,不能益腎,另外瘀血不祛,新血不生,則經血失源,從而引起臟腑功能失常,而女子經、孕、胎、產、乳最易傷精耗血,故腎虛血瘀是導致POF的主要病機,臨床上治療POF多以補腎活血法為原則遣方用藥。

現代藥理研究發現[35]補腎活血中藥的化學成分豐富多樣,主要有黃酮、甾體、糖類等成分,主要發揮抑制血小板聚集及抗血栓、抗炎等作用。依據補腎活血法組成的中藥復方可通過多種信號通路和相關蛋白起到抑制卵巢顆粒細胞凋亡的作用,從而防治POF。但補腎活血復方藥味較多,藥物之間的相互作用是否會產生新的物質因子作用于疾病,還有待進行深入挖掘研究;對補腎活血中藥的禁忌癥缺乏報道,后續可增加相關研究數據使其作用機制更加完善。