熱處理促進淀粉和蛋白質中持久性自由基生成的影響

黃曉霞,陳 全,計丕霞,吳 敏,潘 波

(昆明理工大學 環境科學與工程學院,云南省土壤固碳與污染控制重點實驗室,云南 昆明 650500)

0 引 言

持久性自由基(Persistent Free Radicals,PFRs)[1]是一種比?；?、羥基等自由基壽命更長,能隨著環境介質遷移進入生物體內的新型環境污染物.PFRs通常在高溫熱處理,如燃燒、熱解、水熱碳化等過程中形成[2],其可在環境中持續數小時甚至數天,嚴重威脅人體健康.PFRs主要通過兩種途徑引起人體暴露風險:一種是在體外產生活性氧,讓機體處于氧化應激狀態,第二種是進入人體誘導活性氧產生,損傷生物體內的蛋白質、DNA等生物大分子[3-4].

食物從消化道攝入是PFRs進入人體的重要途徑之一.研究發現熱處理不同食品部位產生PFRs的含量不同,如面包外皮的PFRs含量是面包內心的2～5倍[5],杏仁片中的PFRs含量是杏仁核中的5倍[6].不同熱處理方式也會使食品產生PFRs的強度不同,微波熱處理大米蛋白形成了以碳為中心的PFRs,其產生的PFRs信號強度約為熱傳導方式的3倍[7];微波熱處理水分活度為0.4的大米淀粉產生的PFRs比熱傳導方式高1個數量級,受其激發產生PFRs的溫度也低于熱傳導處理[8],其原因是電磁場可直接作用于水分子、淀粉分子或蛋白質分子內的極性基團,提供斷鍵所需的解離能.而微波和電爐熱處理不飽和脂肪酸,只有電爐加熱使其產生了明顯的自由基信號,這與電爐加熱使不飽和脂肪酸中的C=C和C=O斷裂,而微波沒有改變不飽和脂肪酸的結構有關[9].此外,通過對不同植物油熱處理,發現多元不飽和脂肪酸含量越豐富的植物油,熱氧化穩定性越差,在熱處理過程中更易產生PFRs[10],并且亞麻酸含量越高的植物油產生的自由基信號強度越強[11].但當前研究多關注于植物油中PFRs的產生情況,油與食物相互作用對食物中產生PFRs的影響以及不同加熱方式對不同成分食品中PFRs的影響仍鮮被關注.

淀粉類和蛋白質類食品是我們日常生活必不可少的食物,油炸方式也是中國傳統烹調食物的方法之一.因此本研究采用空氣熱解和油浴加熱兩種方式分別對淀粉、蛋白質淀粉混合物以及蛋白質進行熱處理,采用電子順磁共振(EPR)檢測不同食品組分中的PFRs信號強度,判定其種類并探究不同食品組分產生PFRs差異的原因與產生機制.研究結果將有助于提高人們對高溫加工食品的健康風險認識,也有利于控制熱處理過程中PFRs的產生,降低食物處理方式不當對人體的傷害.

1 材料與方法

1.1 樣品的制備

分別稱取純馬鈴薯淀粉(購買于源葉生物)和純乳清蛋白質粉(美國西爾瑪配料有限公司)各 20.00 g,加入UP水攪拌均勻,將其揉成一個光滑面團(含水率約30%)后壓制成大小均一的小圓柱體.同理,稱取蛋白質粉和淀粉各 10.00 g 混合,制成蛋白質淀粉混合物.設置空氣熱解溫度和油炸鍋溫度分別為220、250、280和 310 ℃,每個溫度下加熱樣品3 min,立即取出適量油浴加熱后的油樣進行EPR測試,同理進行相同溫度加熱大豆油3 min的EPR測試.熱解處理和油浴處理的固體樣品待冷卻后研磨成粉末狀,待進一步測試.

1.2 測試方法

1) EPR測試:用石英毛細管吸取油樣,用固體膠封口后插入干凈的順磁管中;稱量固體樣品置于 4 mm 順磁管中.順磁管置于電子順磁共振波譜儀(Bruker X-band A 300-6/1)內腔中進行樣品的EPR光譜測定.調制頻率為 100 kHz,調制幅度為 1.00 G,掃描寬度為 100 G,轉換時間和時間常數分別為 40 ms 和 20.48 ms,EPR微波功率為 18 mW,掃描時間為 40.96 s,接收器增益為3.17×103,X軸分辨率為 1 024 點.其中,每個光譜的相對峰高度被估計為自由基信號的相對強度.

2) 紅外光譜(FTIR)測試:將樣品放入干燥的溴化鉀(KBr)中,樣品與KBr的比例為1∶200,充分研磨至混合均勻后使用壓片機壓制成透明薄片,放入傅里葉變換紅外光譜儀(Varian 640-IR,美國)中,扣除背景干擾值后進行樣品的掃描測定.FTIR檢測參數為:掃描次數為32次,分辨率為8,掃描范圍為 4 000～400 cm-1.

3) 元素分析(EA)測試:稱取樣品1.95～2.35 mg 至錫箔船中,包裹嚴密,放入元素分析儀(MicroCube,Elementar,Germany)中進行C、N、O、H、S元素分析.

1.3 數據處理

紅外譜圖分析采用OMNIC 8.2數據處理軟件,所得的譜圖與空氣譜圖進行差減.通過EPR程序Bruker WinEPR處理獲得g值、自由基信號強度和線寬.以上所有測試至少重復3次,實驗數據采用Excel 2016進行統計,Origin 2019b進行作圖.

2 結果與討論

2.1 油浴加熱和空氣熱解對淀粉類食品產生PFRs的影響

2.1.1 熱處理溫度及方式對淀粉生成PFRs的影響

油浴加熱和空氣熱解淀粉 3 min 產生的PFRs信號強度圖譜可見圖1.從圖中可以看出,隨著溫度的升高,淀粉中的PFRs信號強度逐漸增強,表明淀粉中PFRs的產生與加熱溫度顯著相關.熱處理溫度低于 220 ℃ 時,兩種熱處理淀粉中均未檢測到PFRs信號.280 ℃ 油浴加熱產生的PFRs信號稍高于同溫度下熱解產生,但兩種加熱方式產生的PFRs信號強度無顯著性差異.相比 280 ℃ 溫度條件,310 ℃ 油浴加熱和熱解淀粉產生的PFRs信號強度分別突增約10倍和50倍.通過TG/DTG/DTA對淀粉進行熱分析,發現在 300 ℃ 有一個明顯的質量損失峰[12],質量損失69%,證實淀粉結構在 300 ℃ 左右會發生質的變化.溫度為 310 ℃ 時,淀粉分子結構中的烷基側鏈、羥基、醚基等弱鍵斷裂,產生大量新的自由基,新產生的自由基通過與自身反應或與周圍環境中的穩定組分結合,形成穩定自由基[13].

(a) (b)圖1 淀粉在熱解(a)和油浴加熱(b)處理下PFRs信號強度圖譜Fig.1 PFRs signal intensities of starch treated by pyrolysis (a) and oil heating (b)

對熱處理后油中的PFRs信號進行檢測,結果見圖2.從圖中可知,雖然大豆油含有豐富的不飽和脂肪酸,但提高熱處理溫度和添加淀粉都不會使油中產生PFRs.與Zhao等[9]的研究結果不同的是,他們在熱處理不飽和脂肪酸純物質過程中檢測到PFRs信號,其原因可能是不飽和脂肪酸純物質中不含抗氧化劑,而食用油在生產過程中會人為添加一定量的抗氧化劑[14],可與食用油熱氧化過程中產生的烷基、過氧基和烷氧基等脂質自由基反應[15],減緩油脂的氧化速度,進而阻止PFRs的產生.雖然油脂與淀粉之間的相互作用對油脂產生PFRs的影響較小,但油脂與淀粉之間的相互作用會影響淀粉中PFRs的產生.兩種加熱方式在 310 ℃ 產生的PFRs信號強度有顯著性差異,熱解淀粉產生的PFRs信號強度約為油浴加熱的3倍.其原因可能是升高溫度破壞了淀粉的結晶區,使支鏈淀粉含量減少、直鏈淀粉含量增加[16],而直鏈淀粉可與脂質發生絡合反應,形成的淀粉-脂質復合物可以提高淀粉的結晶度,抑制淀粉糊化[17],從而減少PFRs的產生.

(a) (b)圖2 熱處理對油中PFRs影響情況:(a)為加熱3 min后的大豆油;(b)為油炸淀粉3 min后的大豆油Fig.2 Effect of heat treatment on PFRs in oil: (a) soybean oil after heating for 3 min;(b) soybean oil after frying starch for 3 min

圖3 不同熱處理方式加工淀粉在 不同溫度下的g值和線寬Fig.3 The g value and line width of starch treated by different treatment methods

EPR信號的波普分裂因子(g值或g因子)是提供分子內部結構信息的重要特征參數.從圖3的g值變化來看,隨著溫度升高,油浴加熱和空氣熱解均使淀粉產生的PFRs的g值下降,表明PFRs從以O為中心逐漸轉變為以C為中心.線寬(ΔHp-p)表示孤對電子從激發態的高能狀態返回低能狀態所經歷的時間長短,這一過程也稱為弛豫時間,ΔHp-p越小弛豫時間越長[18].圖3中,熱解淀粉的ΔHp-p從 9.677 4 降至 4.398 6,油浴加熱淀粉的ΔHp-p從 19.061 6 降至 4.398 9,可見隨著加熱溫度的升高,淀粉的線寬不斷減小,孤對電子從高能態返回低能態的弛豫時間不斷增加,其自由基的生成種類逐漸減少[9].此外,大豆油中雖然沒有產生PFRs,但其受熱不穩定易產生瞬時性自由基,可攻擊破壞淀粉結構產生以多個原子為中心的PFRs[15],自由基的生成種類多于熱解,因此 250 ℃ 油浴加熱淀粉的ΔHp-p明顯高于熱解.

2.1.2 淀粉分子官能團變化與PFRs之間的關聯

圖4的FTIR光譜用于研究熱解和油浴加熱對淀粉分子碳骨架結構的影響.圖4(a)中 1 719 cm-1出現的吸收峰歸因于碳水化合物COO-的拉伸振動;1 020 cm-1、567 cm-1處的吸收峰歸因于α-1,4糖苷鍵(C-O-C)的骨骼振動[19].-CH2吸收峰(2 927 cm-1)和C-O-C(1 020 cm-1)峰在加熱過程中明顯減弱并發生紅移,表明淀粉分子間氫鍵被削弱,淀粉分子內的結晶區域被破壞.1 740～1 640 cm-1淀粉出現的較強吸收峰是由半縮醛基引起,并且隨著溫度的升高,此處的吸收峰有分裂成2個峰的趨勢,這2個峰可歸為羰基峰和C=C雙鍵峰[12].圖4(b)在相似位置也能找到相同官能團的振動,除此之外,2 913 cm-1、2 848 cm-1和 1 739 cm-1分別對應甲基、亞甲基和酯基的分子振動,這些都是食用油中脂肪酸和甘油三酯的特征官能團[20].

2.1.3 淀粉分子元素變化與PFRs之間的關聯

不同溫度熱解和油浴加熱淀粉后其元素變化情況見圖5.熱處理后淀粉的C含量上升,O含量下降,O/C比和H/C比下降,表明淀粉熱處理后含氧官能團降低,芳香化程度上升.其中 310 ℃ 時C含量增加率最大,O含量損失率最大,說明在 310 ℃ 時淀粉的降解速率最快,這與Zhao等[21]報道的熱解淀粉化學結構一致.在熱處理過程中,淀粉結構中的O-H鍵和C-O鍵斷裂,生成烷氧基自由基和烷基自由基,烷氧基自由基通過脫烷基化反應生成C=O鍵(1 719 cm-1),淀粉中的羥基通過脫水反應還可以形成C=C鍵(1 631 cm-1).用 600 MHz13CNMR深入研究了玉米淀粉在不同溫度下的化學結構變化,發現淀粉在 200 ℃ 熱處理后C-4(δ=62 ppm)和C-1(δ=100 ppm)峰開始消失,同時,甲基和亞甲基峰強增加,隨著溫度繼續升高,到 300 ℃ 時甲基和亞甲基峰強減弱,C=O鍵增強,并形成了苯環結構[22].Zhang等[23]發現淀粉的降解產物主要含有環酮、苯酚和烷基苯.研究證實,芳環C=C鍵和C=O鍵與PFRs的產生顯著相關[24].因此,隨著溫度的升高,淀粉產生的PFRs信號強度越強,并且在 310 ℃ 出現PFRs信號突增的情況,與淀粉在熱處理過程中不斷碳化,淀粉結構不斷芳香化,在形成芳香族化合物過程中產生的C=C鍵和C=O鍵有關.

(a) (b)圖4 熱解(a) 和油浴加熱(b) 淀粉紅外光譜Fig.4 FTIR of starch heated by pyrolysis (a) and oil heating (b)

(a) (b)圖5 不同溫度熱解(a)和油浴加熱(b)淀粉的元素含量Fig.5 Element contents of starch produced by pyrolysis (a) and oil heating (b)

2.2 空氣熱解對不同成分食品產生PFRs的影響

由于熱處理方式不同,食品產生的PFRs也不同,即使是同一食物的不同部位,也具有明顯的自由基強度差異[5],因此需要探究不同成分食品熱處理過程產生PFRs的差異.前面的研究指出,在一定溫度范圍內,油浴加熱和熱解處理對食品產生PFRs差異不明顯,但油脂的存在會影響食品在熱處理過程中結構變化的判定,因此為排除食用油中油脂成分對食品結構表征的干擾,本實驗采用馬弗爐對日常飲食中常見的食品成分:淀粉,蛋白質以及它們的1∶1混合物進行熱解處理.

2.2.1 同溫度下蛋白質比淀粉更易產生PFRs

熱處理不同成分食品的PFRs信號強度圖譜見圖6.當加熱溫度達到 280 ℃ 時,才能觀察到淀粉樣品產生的PFRs信號,而蛋白質產生的PFRs信號在 220 ℃ 時就能觀察到,這一現象與Wei等[25]的研究結果相符:玉米淀粉的初始熱解溫度為 280.4 ℃,而大豆蛋白的初始熱解溫度為 217.9 ℃.由此可推測不同成分食品PFRs來源與其結構分解有關.

(a) (b) (c)圖6 熱解不同成分食品產生PFRs信號強度圖譜(a為淀粉,b為蛋白質淀粉混合物,c為蛋白質)Fig.6 PFRs signal intensities produced by pyrolysis of food with different components(a: starch;b: protein-starch mixture;c: protein)

此外,容易觀察到相同溫度下蛋白質相較淀粉更容易產生PFRs,其產生的PFRs峰形較淀粉也有所差異.其中,310 ℃ 熱處理蛋白質產生的PFRs強度為淀粉的8～10倍,可能是因為蛋白質中的氫鍵和二硫鍵會促進蛋白質與自由基的反應與轉移[26].蛋白質中的二硫鍵斷裂形成巰基,游離的巰基和游離的硫醇基團能促進蛋白質之間的聚集,且氨基酸殘基易受到氧自由基的攻擊形成羰基和二酪氨酸,反應過程比淀粉更復雜,形成PFRs的途徑更多,因此更容易產生PFRs,進而PFRs信號強度更強[27-28].

圖6中可觀察到不同溫度熱處理蛋白質產生的PFRs信號強度均高于蛋白質淀粉混合物,這可能與淀粉蛋白質混合加熱會產生美拉德反應有關.原因在于,碳水化合物的存在能夠增加蛋白質的變性溫度,減弱自由基生成反應[27],即添加淀粉后,需要更高的能量才能使蛋白質結構充分展開,因此蛋白質的PFRs信號強度最高,建議在日常蛋白質食品加工中可適當添加淀粉,有助于降低PFRs強度.

馬弗爐熱處理不同成分的食品的g值和線寬見表1.可以看出,不同組分的g值和線寬都隨著溫度的升高而降低.g值的變化表明隨著溫度的升高,不同成分食品產生小分子雜原子自由基減少,而生成了更多大分子芳香烴自由基.在 250 ℃ 時,相對淀粉蛋白質混合物和蛋白質,淀粉存在小分子雜原子自由基更多.由于線寬越小弛豫時間越長,表明不同食品組分在加熱過程中自由基逐漸從低能量狀態轉變為高能量狀態.

表1 不同成分食品熱解后的g值和線寬

2.2.2 不同成分食品的元素變化與PFRs之間的關聯

不同成分食品熱解的元素分析見表2,其中蛋白質的C含量最高、O含量最低,熱處理后不同成分食品中的C含量均增加,O含量均降低.隨著加熱溫度的升高,不同食品成分的O/C和H/C均下降,表明不同成分食品的芳香度均隨著熱解溫度的升高而增加,推測食品在熱處理過程中發生了脫水、脫羧以及環化等反應形成了苯環結構,使芳香度增加[21].但蛋白質的O/C和H/C更低,因其變性溫度低,熱穩定性較差[29],故在熱處理過程中,蛋白質的碳化過程比淀粉更快,在形成芳香族化合物過程中相應產生的芳環C=C和羰基基團更多,形成的PFRs強度更高.值得注意的是,蛋白質淀粉混合物的N含量隨著溫度的升高不斷增加,可能是蛋白質中的氨基酸脫氮過程與碳水化合物的羰基之間發生美拉德反應,促進N雜環化合物的形成[25].由于含N化合物一般會轉化為更穩定的芳香結構[30],而芳香結構是形成和穩定自由基的重要因素[31],因此蛋白質的PFRs強度遠高于淀粉也可能與N元素在其中發揮的作用有關.

表2 熱解不同成分食品元素含量變化

2.2.3 不同成分食品分子官能團變化與PFRs之間的關聯

熱解不同食品成分的紅外光譜圖譜對比可見圖7.圖7(b)和7(c)中 3 600～3 200 cm-1歸因于蛋白質的O-H和N-H拉伸振動,2 922 cm-1為脂肪族C-H拉伸振動,1 390 cm-1為脂肪族彎曲振動[32].1 650～1 500 cm-1之間的峰對應芳環中雙鍵的振動,如C=C或C=N[33].740 cm-1代表芳香環的搖擺振動[34].從圖中可見隨著溫度的升高,N-H鍵,C-N鍵(1 525 cm-1)逐漸減弱并消失,C=C鍵或C=N鍵先減弱后增加,可能與蛋白質淀粉混合物中產生的N雜環化合物轉化為更穩定的芳香族化合物有關.由圖7(b)可見,蛋白質淀粉混合物 250 ℃ 以下的FTIR圖與淀粉差別不大,280 ℃ 以上的FTIR圖與蛋白質的一致,表明淀粉與蛋白質混合后初始熱解過程主要由蛋白質主導,后續熱解過程主要由淀粉主導.

(a) (b) (c)圖7 熱解淀粉(a)、蛋白質淀粉混合物(b)和蛋白質(c)的紅外光譜圖譜Fig.7 FTIR of pyrolyzed starch (a),protein-starch mixture (b) and protein (c)

3 結 論

本研究闡述了熱處理方式及溫度對淀粉產生PFRs的影響和熱處理對不同成分食品產生PFRs的影響,建立了食品結構變化與PFRs信號之間的關聯,所得主要結論如下:

1) 食品中產生PFRs信號強度與加熱溫度顯著相關.熱處理溫度低于 220 ℃ 時,淀粉中不產生PFRs信號.溫度越高,淀粉產生的PFRs信號強度越強.淀粉熱處理過程中生成PFRs可能與淀粉結構不斷芳香化、分子中的O-H鍵和C-O鍵斷裂產生C=C鍵和C=O鍵有關.

2) 在一定的熱處理溫度下,食品中產生的PFRs信號強度與熱處理方式無明顯相關性.溫度為250～280 ℃,空氣熱解和油浴加熱均能使淀粉產生PFRs信號,但PFRs信號強度之間無顯著性差異.進一步升高溫度時,熱解淀粉產生的PFRs信號強度約為油浴加熱的3倍.為降低淀粉類食品中PFRs對人體的危害,宜采用油浴加熱的方式進行熱處理.

3) 溫度對蛋白質類食物產生PFRs影響顯著,其初始熱解溫度比淀粉更低,在 220 ℃ 就檢測出較強的PFRs信號.同一溫度熱處理蛋白質產生的PFRs也高于淀粉,可能是蛋白質熱解過程比淀粉更復雜,形成PFRs的途徑更多,蛋白質中的氫鍵、二硫鍵以及N元素可促進蛋白質與自由基的反應,蛋白質中的氨基酸殘基也易受到氧自由基的攻擊形成羰基.同一溫度蛋白質淀粉混合物PFRs信號強度和N/C比低于蛋白質,因此日常加工蛋白質類食品,可適當添加淀粉,有助于減少PFRs的產生.