皮層局部環路結構與功能研究綜述

任泓安,孫 樂,王曉群,4,譚 韜

(1.昆明理工大學 非人靈長類生物醫學國家重點實驗室,云南 昆明 650500;2.中國科學院生物物理研究所 腦與認知國家重點實驗室,北京 100101;3.首都醫科大學 北京腦重大疾病研究院,北京 100069;4.北京師范大學 IDG/麥戈文腦科學研究院 認知神經科學與學習國家重點實驗室,北京 100875)

0 引 言

大腦是一個高度復雜的系統.19世紀末,Ramon Cajal提出神經元是神經系統的基本單位.神經元種類多樣,數量巨大,人腦中約有860億個神經元[1]通過突觸連接傳遞信息,也正是神經元高度復雜的連接及其特有的信息處理方式造就了非凡的大腦.認識神經元的連接對于解析腦功能至關重要.

目前神經元的連接主要從宏觀、介觀和微觀三個尺度[2]來進行研究,不同空間尺度的測量對于全面了解連接組是各有優勢,且相互補充.宏觀連接組學(Macro-connectomics),分辨率在毫米級,主要基于磁共振成像技術來進行連接組的繪制,核磁的一大優勢是以非侵入的方式進行成像,可以無創測量人的大腦不同區域之間的連接[3].磁共振的局限是時間和空間分辨率較低,無法清晰地描繪局部環路的連接.介觀連接組學(Meso-connectomics),分辨率在微米級,主要利用病毒或者蛋白標記需要示蹤的神經元,利用光學成像技術追蹤神經元的投射.從介觀水平既可以研究跨腦區的連接,又可以研究局部環路的連接.雖然利用病毒稀疏跨突觸標記或者膜片鉗技術可以記錄到介觀水平的神經元形態以及連接,但介觀難以發現微觀水平上存在的連接細節,如無法記錄到突觸后連接精細的亞水平結構.并且介觀水平的分辨率受到光學成像的限制,對突觸連接的判斷存在一定程度的干擾.所以,微觀連接組學(Micro-connectomics)應運而生,分辨率在納米級,主要利用電鏡技術來獲取納米分辨率下的神經元,在局部環路研究上具有非常大的優勢.

大腦的連接不僅是腦區之間的信號傳遞,在腦認知研究中最關鍵的是皮層密集連接,以及如何對不同來源的信號進一步處理.不管是何種尺度的研究,想要進一步理解神經元的連接架構,都需要從結構和功能的角度來全面認識神經環路.現有的一些研究未將結構和功能很好地結合起來,例如從電鏡角度研究神經元大多數都只包含了結構信息,而沒有神經元連接的功能信息[4-5].現有的研究也缺乏對皮層細胞亞類之間的聯系和突觸連接功能屬性的完整描述[6].本文將從小鼠和靈長類皮層的局部環路出發,從微觀尺度結合結構和功能的研究來討論皮層局部神經環路的連接.突觸連接不是一個靜態的連接,并且連接強度也是不斷變化著的,同時受到突觸前后各類神經元活動的精細調節.了解神經連接的底層框架以及如何實現特定計算,有助于啟發類腦智能研究.

1 微觀水平上局部環路的神經結構

早在1986年,White等[7]第一次利用電子顯微鏡繪制出線蟲全部的神經以及數千個突觸連接.在2019年,Cook等[8]在線蟲中利用連續電子顯微鏡發現了比以往更多的突觸連接,神經元投射位點,并間接測量出連接強度.但相對于更大體積的腦來說,目前的電鏡技術重構出小鼠和靈長類全腦的連接組還是存在一定的困難.最近美國腦計劃2.0[9]提出未來將繪制出哺乳動物全腦的微觀水平神經連接,但目前的研究更多的是利用電鏡重構出小鼠以及靈長類皮層的局部環路[10-11].在微觀水平上,局部環路的結構可通過電鏡對神經元類型進行較為基礎的分類,對微觀結構以及連接結構,連接偏好性有較為細致的研究,并間接推測連接強度.

1.1 基于微觀結構對神經元類型的劃分

在局部環路的研究中,神經元的類型區分是較為基礎的一步,雖然根據電生理特征、形態學、蛋白表達以及轉錄組學信息可以對神經元進行較為細致的分類,但單純在電鏡水平還不能夠對每一個神經元進行細致的劃分.目前大多的電鏡數據是在無特異性分子標記情況下,根據電鏡下神經元形態及微觀結構對神經元進行分類[12-13],例如錐體神經元,軸突始端指向白質,以及存在樹突棘[14];抑制性神經元胞體較大,且含有大量線粒體,軸突起源于樹突;而非神經細胞,細胞體積小且細胞核的形態也不同[15].在分類的基礎上,統計不同物種之間神經元類型的占比,發現存在著較大差異.與嚙齒動物相比,人腦皮層中存在更多的膠質細胞[16],更多比例的抑制性神經元,獼猴和人類皮層抑制神經元占比與小鼠相比擴大了約2.5倍[15],導致連接組合的復雜度進一步提升.

1.2 局部環路中的連接偏好性

有了興奮和抑制神經元的劃分,就可以進一步研究環路連接偏好性.在最近,人的皮層研究中首次發現,在軸突距離胞體不同路徑長度下,存在突觸連接偏好性[15].如錐體神經元遠端軸突投射偏好于興奮性神經元的樹突棘,近端軸突投射偏好于抑制性神經元的樹突軸.另外,靈長類動物皮層中還存在錐體神經元軸突往興奮性神經元樹突軸投射,而小鼠中卻不存在這樣的連接偏好[17].神經元類型的占比和突觸連接偏好性綜合起來考慮,可進一步整合局部環路連接架構.轉錄組數據[18-19]和電鏡數據均提示人類皮層中抑制性神經元占比相對于小鼠多,電鏡下雙極細胞比小鼠多了一倍,并且雙極細胞突觸偏好性主要接受抑制性輸入,進一步提示人類皮層接受更多的抑制到抑制的神經網絡輸入[15],這也是從小鼠皮層到人類皮層的一個關鍵變化.并且在不同發育時期的小鼠皮層中發現,連接方式、連接密度還有突觸選擇偏好性上還存在著較大差異[17].對不同時期神經元連接形成過程,偏好選擇過程提供了新的見解.通過測量突觸后密度(Postsynaptic Density,PSD)[13]面積來測量突觸大小,與突觸前囊泡的數量成正比[20],并且可間接推測突觸強度[21-23].

電鏡可以在結構上對神經元的形態和連接提供一個極高的分辨率,使得我們對接連結構,連接偏好,連接密度有更加準確的認識,而無法直觀獲得神經元連接強度、可塑性變化等相關信息.

2 電生理對突觸連接功能的研究

電生理的優勢,可以非常準確地記錄到電信號.常用的電生理方法可分為胞外記錄和胞內記錄.胞外記錄可以被用來檢測單細胞電活動以及局部場電位.例如探索局部環路中一群神經元如何編碼處理信息,可利用多電極陣列(Multi-Electrode Array,MEA)來同時記錄多個神經元的電活動.多電極陣列記錄到的是局部群體細胞的電活動,在單細胞水平上的連接還存在較大的局限.而胞內記錄保證了對電信號更高的敏感度和信噪比,從而獲得突觸傳遞機制.

2.1 膜片鉗技術記錄神經環路連接

自從膜片鉗技術應用以來,越來越多的人開始利用這一技術研究神經元突觸的連接,從單個細胞的全細胞記錄,到兩個細胞同時的全細胞記錄[24-25],到現在更多的8個細胞的同時記錄[26].從記錄神經元的形態和電生理特性,到突觸電生理特性,到發現神經環路特定模式.雖然膜片鉗已經有幾十年的歷史,但仍然是目前研究神經功能強有力的工具.另外光遺傳技術和膜片鉗技術的結合[27],也可以用來研究局部環路的連接.對于局部環路微電路的功能研究,多通道膜片鉗(Multiple whole-cell patch-clamp recording)與其他方法相比仍然是金標準[28-29].因為其亞毫秒和亞皮安的分辨率,可記錄神經元的形態和電生理特征,使得研究局部環路中連接概率、連接強度、可塑性和神經網絡成為可能[30-32].

電生理相對于電鏡來說,有其獨特的優勢.可以結合遺傳標記或者轉錄組學,對神經元亞類類型進行進一步劃分,并且把亞類的介觀或者超分辨形態與電生理相結合,得到每種神經元對應的電生理特征與屬性.根據蛋白表達、形態和電生理特征,已經鑒定出十多種γ-氨基丁酸能(GABA)抑制性神經元亞型[33-38].并且經過大樣本量的膜片鉗記錄,可以對某種亞類的神經元的占比進行統計,例如:成年小鼠視皮層V1的Martinotti cell在L2/3層占其他抑制性神經元的11%,在L5層占32%[39-40].

2.2 多通道膜片鉗揭示局部環路連接模式與功能

多通道膜片鉗技術的優勢在于不但可以獲得細胞介觀的形態和電生理特征,而且還能直接獲取神經元之間的連接信息和突觸連接可塑性動態變化的信息.所以,在局部環路的研究上,多通道膜片鉗技術具有極大的技術優勢,這是其他電生理技術無法直接替代的.

在介觀形態和電生理的記錄中,更多反應的是細胞自身結構和內在的電生理特性,神經元的結構特征決定了它投射的區域位置,以及下游可能連接某些腦區的特定細胞類型.不僅形態決定神經元的投射以及下游可能存在的連接,神經元的電生理和形態特征的進一步結合可以對神經元類型進行初步分類,判斷神經元屬于興奮還是抑制類神經元,并在后期連接中進一步對神經元進行分類,從而有可能進一步考慮興奮與興奮的連接概率,興奮到抑制的概率,抑制到興奮的概率以及抑制到抑制的連接概率.另外,神經元的結構特征也有助于建立起何種形態的神經元傾向于形成哪些特殊類型的連接.例如L2/3的神經膠質樣細胞(Neurogliaform Cell,NGC)更傾向于在胞體周圍投射,形成卷曲樣的球形結構,這種類型的神經元在連接記錄中發現會存在較長的延遲時間[39].這些介觀形態和電生理特征都是在多通道膜片鉗中可以記錄到.

除了可以研究神經元結構和內在電生理特性,多通道膜片鉗強大的技術優勢是對突觸連接以及突觸連接功能的進一步研究.雖然皮層中每種神經元都有特定的連接模式,在不同層以及不同類型的細胞中,發現存在一些簡單的連接模式和連接規則,基于多通道膜片鉗技術發現抑制性神經元可劃分為三種連接模式[39]:1)非特異性連接.此類細胞與突觸后各類細胞的連接概率接近,幾乎沒有連接偏好.2)抑制性連接偏好.這類神經元絕大部分投射抑制性神經元,幾乎不投射興奮性神經元.如: 雙極細胞(Bipolar Cells,BPC)等,與電鏡下雙極細胞結果一致[15].3)最后一類主要往興奮性神經元投射.研究發現,淺層的連接概率高于深層,并且隨著蛋白特異性標記的神經元結合多通道膜片鉗大規模的記錄(見圖1),也發現生長抑素(Somatostatin,Sst)和血管活性腸肽(Vasoactive intestinal peptide,Vip)表達的抑制性神經元會產生與自身的連接,并且與小清蛋白(Parvalbumin,Pvalb)神經元一起互相抑制[41],補充了以往突觸連接的模式[42-43].另外,還發現不同物種皮層的不同層中存在著細胞類型差異和連接差異.在人類中,隨著皮層深度的增加,細胞電生理特征的多樣性也隨之增加,而在小鼠中未觀察到,并且L4層的連接性低于小鼠,這是人類L4層特有的屬性[41].不僅如此,還在人皮層中觀察到多突觸連接.對于不同物種皮層微環路有了進一步的認識.

圖1 多通道膜片鉗揭示皮層連接概率[41]Fig.1 Multiple whole-cell patch-clamp recording reveals cortical connection probability[41]

皮層的突觸連接不是一個靜態的環路系統,大腦的運行是一個連續且不斷變化的過程,皮層環路神經元反應強度會根據活動的變化隨時改變,所以需要在靜態環路的基礎上考慮到突觸連接的可塑性,比如皮層中常見的短時程可塑性(Short-Term Plasticity,STP)(見圖2).并且在配對記錄以及多通道膜片鉗的基礎上發現,興奮性動力學由突觸后神經元類型決定[44-45],抑制性動力學取決于突觸前類型[46-47].人類皮層興奮性神經元PSP(Postsynaptic Potentials,PSP)較大,且STP刺激后恢復的速度比小鼠快,也就意味著短時間內信息傳遞的內容可能會更多[41,48-49].

(a)Common motifs (b)Layer 2/3 (c)Layer 5 (d)Short-term plasticity圖2 多通道膜片鉗揭示皮層連接模式以及突觸可塑性[39-41]Fig.2 Multiple whole-cell patch-clamp recording reveals cortical circuit motif and synaptic plasticity[39-41]

所以,多通道膜片鉗技術是研究局部神經環路強有力的工具,但仍然受限于技術操作水平的影響.最近也在不斷催生自動化多通道膜片鉗技術[29].除此之外,由于目前多通道膜片鉗技術基本都是在離體腦片中進行的,也會存在著神經元連接在制備腦片時被切斷的情況.

3 結構與功能的結合對于神經環路的研究

在海馬中發現,突觸的長時程增強會誘導樹突棘的生長,并記錄到突觸后電流的增強[50],這表明突觸連接強度與超微結構之間存在一定關系,尤其是 PSD 面積和樹突棘體積[51-52].后來在皮層中也發現類似現象[53].所以,連接組學的研究不僅僅停留在介觀層面或者功能層面,開始進一步轉為超微結構和功能同時來研究連接組學.

3.1 鈣成像與電鏡技術的結合

可用來研究神經環路如何處理信息.利用鈣成像指示劑在細胞分辨水平上記錄局部區域神經元電活動,可以與行為學結合,研究不同行為下的腦區電活動,從而觀察到神經信號在不同類型細胞間的連接架構與組織方式[54-56]、刺激強度與連接密度關系[57]、突觸大小分布和多突觸連接[58]等.巨大的優勢就是在于在動物活體狀態下結合行為學進行腦區活動研究,但是局限也非常的明顯.對于電信號的靈敏度低,鈣離子熒光指示劑GCaMP6能夠檢測單個動作電位,但不能解析高頻率動作電位的發放.鈣成像技術用于神經功能的研究尚存在一定的局限性.

3.2 電生理與電鏡技術的結合

可研究突觸大小和連接強度之間的線性關系,囊泡釋放模型等[59].從微觀的角度重新考慮,突觸在功能連接中所占有的生理權重.發現復雜形態PSD的突觸擁有更強的突觸峰值電流,并與PSD面積成正相關.通過量子分析提示皮層中可能存在多囊泡釋放[59-61],給現有的釋放模型[62]提出新的挑戰.

另外,特定類型神經元的下游連接亞細胞結構和突觸連接有特定的偏好性[63](見圖3),例如表達Pvalb的抑制性神經元更偏向于支配下游的下游興奮性神經元的胞體[37,64]等.不僅可以測得突觸連接精細的結構信息,還可以發現新的連接方式以及新的信號傳遞方式.發現抑制性神經元Chandelier cell的軸突末端與錐體神經元的軸突始端形成突觸連接[65](見圖3),并且在多通道膜片鉗中發現皮層中Chandelier Cell主要支配調控Chandelier Cell以及錐體神經元這兩類細胞[39].另外,也通過這兩種技術的結合確定存在一種新的神經遞質傳遞方式:體積傳輸(Volume transmission)[66],該結構在電鏡下發現未形成傳統的突觸結構,但隨著神經遞質在組織間隙中釋放,可擴散至周圍的各類神經元,并且這些神經元在多通道膜片鉗下均可被同時記錄到抑制信號[39,67]. 膜片鉗與電鏡技術的結合,及其高分辨率和精細化的研究突觸連接功能與結構,為洞察神經元連接方式與計算方式打開了一扇窗.

圖3 GABA 能抑制性中間神經元的主要亞型及其突觸多樣性[63]Fig.3 GABAergic inhibitory interneurons and their synaptic diversity[63]

這些技術的結合,促進我們發現和理解皮層局部微環路的連接架構與功能之間的關系.揭示不同皮層以及不同細胞類型之間連接的功能偏差,更好地理解認知行為的環路連接.不僅如此,神經元之間的連接擁有比想象中更復雜的計算.并且,已經在目前已有的結構與功能的基礎上,模擬出皮層的架構與運算規則,構建出了一系列皮層局部環路計算模型[68-70].每一種模型都存在著一定的限制,隨著局部神經環路結構與功能進一步的深入研究,模型也將一步優化.

4 結語與展望

在皮層的局部環路研究中,我們可以發現不同細胞類型、不同皮層狀態下,神經元之間的連接架構也是有差異的,并且受到各類細胞之間的精細調節以及協調,在不同場景下,突觸連接的強度也不斷變化著.皮層環路連接的高度復雜需要我們進一步去深入了解.在了解過程中也會發現一些局限,在微觀水平上,毫米級的腦區,就會產生海量的數據需要處理與分析,耗費大量人力物力,是微觀連接組學進展緩慢的重要原因.并且在多通道膜片鉗技術上,技術水平對科研工作者也提出了極高的要求.高通量的電鏡成像,以及自動化的數據處理,自動化的多通道膜片鉗技術也有望解決上述局限.

不僅僅是從結構到功能,還需要從分子到細胞,不同空間尺度,不同組學的測量,這些對于認識細胞研究大腦的連接組學都非常重要.目前依靠解剖學數據、電生理學、基因表達譜的手段在連接組已經獲得了豐碩的成果,可進一步結合轉錄組數據,對神經元亞類進行進一步細分,為繪制特定神經元類型的連接組提供基礎.另外,局部環路的神經架構的研究同樣啟發著我們對類腦智能的思考,不斷地刺激和推動類腦智能的發展.