生物鐘基因對牦牛卵巢類固醇激素合成的影響

洪 金，周凱欣，茍育聰，呂璽瑋，張 壽，高 磊

（青海大學 農牧學院，青海 西寧 810016）

【研究意義】牦牛（Bos grunniens）作為世居青藏高原的土著動物，對高寒缺氧的高原牧區有較強的適應能力，具有重要的經濟價值[1]。相比平原牛種，牦牛的性成熟晚且繁殖力低下，嚴重影響高寒地區農牧業發展和當地牧民的經濟收入[2]。類固醇激素的合成與分泌影響雌性動物繁殖性能[3]，生物鐘與機體生命活動及其生理機能的調節有很大關系[4]。前期研究表明，生物鐘系統調節哺乳動物血清生殖激素水平[5-7]，奶牛卵巢中有生物鐘基因的表達[8]，同時Cry1、Bmal1和Per2等生物鐘基因也分布在奶牛肝臟和乳腺組織中[9]。但牦牛卵巢中是否存在生物鐘基因表達并調控類固醇合成，目前尚未見報道。因此，研究生物鐘基因對牦牛卵巢類固醇激素合成的作用，進而通過生物鐘靶向調控提高牦牛繁殖力具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】卵巢是合成哺乳動物類固醇激素的重要器官，其中雌二醇（Estradiol，E2）對卵巢顆粒細胞的增殖分化和卵泡的生長發育起著重要的調節作用，而孕酮（Progesterone，P4）對雌性動物的妊娠維持極為重要[3]。類固醇激素的合成分泌涉及一系列復雜的生理生化過程，包括類固醇急性調節蛋白（Steroidogenic actue regulatory protein，StAR）、細胞色素P450 側鏈裂解酶（Cytochrome P450 cholesterol side chain lyase，CYP11A1）、17α-羥化酶（17α-hydroxylase，CYP17A1）、17β-羥基脫氫酶（17β-hydroxysteroid dehydrogenase，HSD17B3）和細胞色素P450 芳香化酶（Cytochrome P450 aromatase，CYP19A1）等限速酶的參與和調節[10]。研究發現，類固醇合成因子1（Steroidogenic factor 1，SF1）和孤兒核受體（Orphan nuclear receptor 77，NUR77）等核受體基因通過結合在類固醇合成基因StAR、Cyp11a1、Hsd17b3和Cyp19a1的轉錄起始位點，激活上述靶基因的轉錄[11-14]。生物鐘是一套控制生物鐘基因及其編碼蛋白24 h周期性震蕩的非常復雜的調控系統，在哺乳動物、植物和微生物機體中存在表達分布[15-16]。經典的生物鐘基因有Clock、Bmal1、Nr1d1、Per1、Per2、Cry1、Cry2、Dbp等，這些生物鐘基因還可以在其下游生物鐘控制基因的啟動子區域直接結合調控該基因的轉錄[17-19]。哺乳動物體內生物鐘不僅存在于位于中樞控制系統的下丘腦視交叉上核，而且也存在于大多數外周組織、器官和細胞中，維持機體生理機能的節律性變化和平衡[20-21]。前期研究證實，生物鐘調節哺乳動物血清促性腺激素釋放素、促黃體生成素和孕酮等生殖激素分泌水平[5-7]，生物鐘基因Cry1在綿羊的卵巢、子宮和下丘腦等組織中均存在表達分布[22]，生物鐘基因Bmal1敲除（Bmal1-/-）小鼠卵巢生物鐘基因及類固醇合成基因StAR的表達顯著下調[23]，進一步研究證實，生物鐘控制基因StAR的表達調控受到多種生物鐘基因的調節[24]，推測生物鐘系統與動物季節性繁殖和血清類固醇激素含量變化有關?！颈狙芯壳腥朦c】牦牛作為季節性發情動物，其繁殖行為受日照影響較大[25]。而牦牛卵巢類固醇激素含量是否存在晝夜節律性變化，其卵巢中是否存在生物鐘基因表達并影響類固醇合成，需要進一步深入研究?！緮M解決的關鍵問題】本研究擬檢測牦牛血清雌二醇和孕酮含量晝夜變化規律，探究生物鐘因子、類固醇合成和核受體因子在牦牛卵巢中表達分布情況，分析牦牛類固醇合成和核受體轉錄因子啟動子區域生物鐘控制元件，闡明牦牛生物鐘基因對卵巢類固醇合成的影響，為研究高原牦牛繁殖障礙機理及通過生物鐘靶向調控，提高牦牛生殖力提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 12月齡、健康、初始體質量相近（250 kg左右）的雌性牦牛6頭，飼養于青海省海西州金穗牧業有限公司，給予正常進食和飲水。

1.1.2 試驗材料和主要試劑 雌二醇測定試劑（E2）和孕酮測定試劑（P4），均購自北京北方生物技術研究所有限公司；蛋白裂解試劑（KGP701）和蛋白濃度測定試劑（KGP902），均購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；兔抗BMAL1（ab93806）一抗和兔抗CYP19A1（ab18995）一抗，均購自英國Abcam 公司；兔抗StAR（D223242）一抗，購自上海生工生物工程股份有限公司；鼠抗β-actin（DKM9001L）一抗，購自天津三箭生物技術有限公司；驢抗兔IgG（H+L）二抗（A18741）、PVDF 膜（88585）、脫脂奶粉（37530）和ECL 發光液（A38556），均購自美國Thermo Fisher公司；DAB顯色劑（D12384）和蘇木精染液（51275），均購自美國Sigma-Aldrich 公司；TRIzol（9018）、反轉錄試劑盒（RR036A）、TaqTMPCR 酶（R001B）和SYBR?Premix ExTaqII（RR820A），均購自日本TaKaRa公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 青海地區8—9 月日照與黑夜時間大致相當（12 h∶12 h），光照開始時間在08:00 左右（ZT0），光照結束時間在20:00左右（ZT12）。牦牛屬于季節性發情動物[25]，本研究在8—9月雌性牦牛生殖能力旺盛的時間段采集血液和卵巢組織。

血清樣品：頸靜脈采血，收集ZT0 和ZT12 時間點每只雌性牦牛血液樣品，于室溫環境下2 000 r/min離心30 min析出血清，-80 ℃凍存備用。

卵巢組織：手術法分別采集ZT0和ZT12時間點的卵巢組織，每點3只。收集的一部分卵巢組織樣品立即用多聚甲醛（40 g/L）固定，用于免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）試驗；另外一部分卵巢組織樣品迅速用液氮凍存備用，用于后續提取總RNA和蛋白試驗。

1.2.2 牦牛血清雌二醇和孕酮含量的節律性變化分析 ELISA 檢測ZT0和ZT12時間點牦牛血清雌二醇和孕酮含量，具體操作按照ELISA 試劑盒操作說明進行，分析牦牛血清雌二醇和孕酮含量是否存在晝夜節律性變化。

1.2.3 生物鐘蛋白BMAL1 在牦牛卵巢中的表達定位 IHC 檢測生物鐘蛋白BMAL1 在ZT0 時間點收集的牦牛卵巢組織中的表達分布情況。將脫蠟的卵巢切片置于切片架中，然后將切片架放入檸檬酸鈉緩沖液（0.01 mol/L，pH 6.0）中，用微波爐加熱至沸騰，進行抗原熱修復；室溫冷卻后取出切片放入濕盒中，室溫條件下滴加H2O2-甲醇溶液（體積分數為3%）完全覆蓋組織部分并孵育10 min；牛血清白蛋白（50 g/L）滴加后，在37 ℃的恒溫箱中封閉1 h；試驗組每張切片滴加適量BMAL1一抗，陰性對照（Negative control，NC）組用PBS代替一抗進行試驗，4 ℃孵育過夜；每張切片滴加適量二抗后，37 ℃恒溫箱孵育1 h；DAB 顯色液進行染色處理，各切片保持一致的顯色時間；自來水沖片后使用蘇木精染液復染，并保持各切片顯色時間一致；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢并采集圖像。

1.2.4 生物鐘基因在牦牛卵巢中的表達分析 PCR 檢測生物鐘基因（Bmal1、Dbp、Nr1d1、Per1）在牦牛卵巢中的表達。利用NCBI 中的Pick Primers 在線引物設計軟件（www.ncbi.nlm.nih.gov）設計引物（表1），并由上海生工生物工程股份有限公司合成。采用TRIzol 法提取卵巢組織總RNA，利用分光光度計測定260 nm吸光度，計算總RNA濃度，按照說明書操作進行反轉錄合成cDNA。PCR反應體系參照說明書配制，反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環；72 ℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠（2 %）電泳檢測PCR產物。

1.2.5 生物鐘基因、類固醇合成基因和核受體基因在牦牛卵巢中的時空表達分析 以Gapdh為內參基因，熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測生物鐘基因、類固醇合成基因（StAR、Cyp11a1、Hsd17b3、Cyp19a1）以及核受體基因（Sf1、Lhcgr、Nr1h4、Nur77）在牦牛卵巢中的時空表達規律。利用NCBI 在線引物設計軟件，設計引物（表1），以cDNA 為模板進行RT-qPCR 試驗，具體操作按照RT-qPCR SYBR green MIX 試劑的說明書進行。根據樣本的循環閾值（Ct），采用相對定量法（2-△△Ct）進行數據分析。

1.2.6 生物鐘蛋白和類固醇合成蛋白在牦牛卵巢中的表達分析 蛋白免疫印跡（Western blot，WB）檢測生物鐘蛋白BMAL1、類固醇合成蛋白StAR 和CYP19A1在牦牛卵巢中的表達。將牦牛卵巢組織研磨后，使用蛋白裂解液提取蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，以上操作均按照試劑盒說明書進行。取適量蛋白樣品進行電泳，然后將蛋白轉印至PVDF 膜上；將膜轉移至脫脂奶粉（50 g/L）中，室溫條件下封閉2 h；PBST洗膜后將膜分別置于對應的一抗工作液中，使用4 ℃搖床振蕩過夜；PBST洗膜后將膜分別置于對應的二抗工作液中，置于室溫搖床上進行1.5 h的孵育；然后用ECL 發光液在暗室里顯色；圖像分析系統采集圖像并分析數據。

1.2.7 牦牛類固醇合成基因和核受體基因啟動子區域生物鐘控制元件分析 登錄NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）或Ensembl（asia.ensembl.org）網址查找牦牛卵巢類固醇合成基因與核受體基因的基因組DNA 序列，列出位于轉錄起始位點上游的-1 至-2 000 bp 的啟動子區域，對牦牛體內可能存在的生物鐘基因結合元件（E-box、RORE 和D-box）進行統計分析，揭示牦牛卵巢生物鐘調控類固醇合成的內在機制。其中，5′-CANNTG-3′（其中N表示任意核苷酸序列）為E-box；5′-（A/G）GGTCA-3′或5′-TGACC（C/T）-3′為RORE；5′-TTA（TG/CA）TAA-3′為D-box。

1.3 數據統計與分析

利用Sigma plot v14.0 軟件對試驗數據進行計算和處理，并進行單因素方差分析（t檢驗）和雙因素方差分析（Two way ANOVA），數據采用“平均值±標準差”形式表示。

2 結果與分析

2.1 牦牛血清類固醇激素含量晝夜節律性變化

ELISA 檢測不同時間點（ZT0 和ZT12）牦牛血清雌二醇和孕酮含量，結果顯示，ZT0 時間點牦牛血清雌二醇和孕酮含量均極顯著低于ZT12時間點（P＜0.001），表明牦牛血清雌二醇含量和孕酮含量有節律性的變化（圖1）。

圖1 牦牛血清雌二醇和孕酮含量晝夜節律性變化Fig.1 Circadian rhythmicity of serum E2 and P4 levels in female yaks

2.2 類固醇合成基因和核受體基因在牦牛卵巢中的節律性表達分析

類固醇合成基因和核受體基因在牦牛卵巢中表達的RT-qPCR檢測結果（圖2）顯示，不同時間點（ZT0和ZT12）類固醇合成基因（StAR、Cyp11a1、Hsd17b3、Cyp19a1）和核受體基因（Sf1、Lhcgr、Nr1h4、Nur77）在牦牛卵巢中均有表達。其中，ZT12 的Cyp11a1、Cyp19a1和Nr1h4表達水平顯著高于ZT0（P＜0.05），ZT12 的Hsd17b3、Sf1和Nur77表達水平極顯著高于ZT0（P＜0.001），StAR和Lhcgr在2個時間點的表達無顯著差異，表明Cyp11a1、Hsd17b3、Cyp19a1、Sf1、Nr1h4和Nur77在牦牛卵巢中存在節律性表達差異。

圖2 類固醇合成基因和核受體基因在牦牛卵巢中的時空表達分析Fig.2 Circadian rhythm expression of steroidogenic and nuclear receptor genes in yak ovaries

2.3 生物鐘蛋白BMAL1在牦牛卵巢組織中的表達

根據文獻報道，生物鐘蛋白BMAL1 在ZT0 時間點的哺乳動物卵巢組織存在高表達[10,13]，為檢測生物鐘因子在牦牛卵巢中是否存在表達分布，選取ZT0 時間點采集的牦牛卵巢組織進行免疫組化試驗。BMAL1抗體孵育結果顯示，牦牛卵巢顆粒細胞有棕色信號（圖3B），說明生物鐘蛋白BMAL1在牦牛卵巢組織中有表達，且主要分布在分泌雌二醇和孕酮的卵巢顆粒細胞，提示BMAL1 與牦牛類固醇激素分泌有關。相反，陰性對照顯示卵巢顆粒細胞中無棕色信號，細胞核被蘇木精染為藍色（圖3A），表明棕色染色為BMAL1蛋白特異性染色。

圖3 生物鐘蛋白BMAL1在牦牛卵巢組織中的表達分布Fig.3 Expression and distribution of circadian clock protein BMAL1 in yak ovaries

2.4 生物鐘基因在牦牛卵巢中的表達

采用普通PCR 驗證生物鐘基因在牦牛卵巢中的表達，結果表明，生物鐘基因（Bmal1、Dbp、Nr1d1、Per1）在不同時間點（ZT0和ZT12）牦牛卵巢中均有表達（圖4）。采用RT-qPCR檢測生物鐘基因在牦牛卵巢中的時空表達規律，結果顯示（圖5），ZT0 的Bmal1基因表達水平極顯著高于ZT12（P＜0.01），ZT12 的Nr1d1表達水平顯著高于ZT0（P＜0.05），ZT12的Dbp和Per1表達水平極顯著高于ZT0（P＜0.01），表明生物鐘基因在牦牛卵巢中存在節律性表達差異。同時發現，生物鐘基因（Bmal1、Dbp、Nr1d1、Per1）與類固醇合成基因（Cyp11a1、Hsd17b3、Cyp19a1）和核受體基因（Sf1、Nr1h4、Nur77）表達變化存在節律相關性。

圖4 生物鐘基因在牦牛卵巢中的表達分析Fig.4 Expression analysis of circadian clock genes in yak ovaries

圖5 生物鐘基因在牦牛卵巢中的時空表達分析Fig.5 Circadian rhythm expression of circadian clock genes in yak ovaries

2.5 生物鐘蛋白和類固醇合成蛋白在牦牛卵巢中的表達

生物鐘蛋白BMAL1、類固醇合成蛋白StAR 和CYP19A1 在牦牛卵巢中表達的WB 檢測結果（圖6）顯示，ZT0 時間點BMAL1 蛋白在牦牛卵巢中的表達水平極顯著高于ZT12（P＜0.01），ZT12 時間點CYP19A1蛋白在牦牛卵巢中的表達水平極顯著高于ZT0（P＜0.001），兩個時間點類固醇合成蛋白StAR 在牦牛卵巢中的表達水平無顯著差異。結果表明，BMAL1 和CYP19A1 蛋白在牦牛卵巢中存在節律性表達，且有節律相關性。

圖6 生物鐘和類固醇合成蛋白在牦牛卵巢中的表達變化Fig.6 Expression of circadian clock and steroidogenic proteins in yak ovaries

2.6 牦牛類固醇合成相關基因啟動子區域存在生物鐘控制元件

生物信息學統計分析得出，所有與牦牛類固醇合成和類固醇合成有關的核受體基因啟動子區域，都存在一定數量的生物鐘作用元件（E-box、RORE 和D-box），其中所有基因的啟動子區域都有較多的Ebox模塊，除StAR外其余基因都有一定的RORE 模塊，Hsd17b3、Lhcgr和Nr1h4基因有一定的D-box模塊，說明牦牛類固醇合成相關基因啟動子區存在生物鐘基因結合位點，生物鐘基因對牦牛類固醇激素的合成有一定的調節作用（表2）。

表2 牦牛類固醇激素合成相關基因啟動子上可能的生物鐘控制元件Tab.2 Putative clock-controlled elements at the promoters of steroidogenesis-related genes in yaks

3 討論與結論

3.1 討論

3.1.1 牦牛卵巢類固醇激素分泌與生物鐘系統相關聯 卵巢類固醇激素主要包括雌二醇和孕酮，其在卵巢內的合成過程包括一系列復雜的生理和生物化學反應[26]。首先，卵巢卵泡內膜細胞中的膽固醇在StAR作用下從線粒體外膜轉移到內膜，在CYP11A1作用下轉化為孕烯醇酮，然后經HSD3B2催化生成孕酮。CYP17A1 催化孕酮轉變為雄烯二酮，進入顆粒細胞并最終在CYP19A1 作用下形成雌二醇[27]。研究發現，雌性哺乳動物的生殖機能隨季節和光照變化，具有強烈的周期性變化規律[28]。雌性山羊的這種周期性規律表現為激素分泌變化導致的增強或減少的性腺功能和性欲[29]。雌性哈努曼葉猴由于季節更替導致的性腺激素分泌水平的變化影響其繁殖性能[30]。通過神經內分泌調節和藥物處理可以改善雌馬的繁殖季節性限制[31]，揭示了生物節律對維持雌性生殖具有重要作用。諸多研究表明，生物鐘基因在包括肝臟、腎臟、胰臟、卵巢、胸腺和血液在內的多種外周組織和器官中均存在廣泛表達分布，構成了完整的外周生物鐘系統[15]。不同雌性動物血清雌二醇和孕酮含量均存在明顯的晝夜節律變化，說明生物鐘系統與雌性動物類固醇激素分泌有關[6,32-33]。本研究結果與上述研究發現一致，牦牛血清雌二醇和孕酮含量存在晝夜節律性變化，說明生物鐘系統與牦牛類固醇激素分泌存在相關性。

3.1.2 生物鐘基因在牦牛卵巢中的表達分布 研究表明，生物鐘參與多種生理機能調控，維持機體內環境穩態[13,34]。哺乳動物下丘腦-垂體-卵巢軸上每個水平的生物鐘系統對雌性生殖活動和繁殖能力均具有重要的調控作用[17]。前期研究發現，生物鐘基因在哺乳動物卵巢組織以及從大鼠和小鼠卵巢分離的卵巢顆粒細胞中均存在節律性表達[13,35-42]。從小鼠、兔子和牛卵巢分離的卵母細胞以及子宮中分離出的未附植胚胎中均存在生物鐘基因的節律性表達[43-46]。大鼠卵巢中卵泡和黃體中存在生物鐘基因的節律性表達[47-48]，且生物鐘基因Per1和Per2的mRNA在傍晚呈現表達高峰[37]。生物鐘基因Clock、Bmal1、Per1、Per2、Cry1和Cry2在大鼠的輸卵管組織和妊娠晚期小鼠的子宮、胎盤和胎膜中均存在節律性表達分布[49-50]。生物鐘基因與奶牛類固醇激素分泌密切相關[8]。生物鐘基因Bmal1在哺乳動物生理機能調控中起到關鍵性作用[51]，跑步輪試驗檢測發現Bmal1-/-小鼠活動和作息規律紊亂[52]。本研究結果與上述研究一致，牦牛卵巢組織存在生物鐘蛋白BMAL1的表達分布，且在卵巢顆粒細胞高表達，提示生物鐘系統參與牦牛類固醇激素合成。生物鐘蛋白BMAL1 和生物鐘基因（Bmal1、Dbp、Nr1d1、Per1）在牦牛卵巢中均存在晝夜節律性表達，說明牦牛體內存在完整的卵巢生物鐘系統。

3.1.3 牦牛卵巢生物鐘對類固醇激素分泌的調控 研究表明，雌性Bmal1-/-小鼠表現為不孕不育，類固醇激素分泌減少，發情周期延長，胚胎附植率降低，卵巢組織類固醇合成基因表達下調[23,53-56]。雌性Clock基因突變小鼠產仔數減少，排卵障礙，死胎和畸形數增多[6,57]。生物鐘基因Per1/Per2敲除小鼠卵巢中類固醇合成基因表達下降[24]。Bmal1子宮肌細胞條件性敲除小鼠分娩過程中難產率顯著增加[58]，表明生物鐘基因對雌性動物生殖機能維持具有重要作用。體外培養的豬卵巢顆粒細胞中，Bmal1基因表達下調影響類固醇合成相關的基因表達和孕酮激素的分泌[59]。CRY 通過調節非洲爪蛙卵巢類固醇激素的合成調控其發情周期變化[60]。Bmal1與Nr1d1基因協同調控牛子宮內膜基質細胞前列腺素合成關鍵酶基因的表達水平[61]。綜上所述，生物鐘系統可以通過多種途徑參與到卵巢類固醇激素的合成調控。本研究結果與上述研究發現一致，牦牛卵巢生物鐘蛋白和生物鐘基因存在晝夜節律性表達的差異，牦牛卵巢中存在類固醇合成蛋白StAR、CYP19A1 和類固醇合成基因（StAR、Cyp11a1、Hsd17b3、Cyp19a1）表達，且類固醇合成基因（Cyp11a1、Hsd17b3和Cyp19a1）和類固醇合成蛋白CYP19A1 均存在節律性表達差異，表明生物鐘系統與牦牛類固醇合成因子表達有關，且或許直接參與Cyp11a1、Hsd17b3和Cyp19a1基因的表達調控。

研究表明，某些核受體基因與類固醇合成基因轉錄調控有關。類固醇合成基因StAR、Cyp11a1、Hsd17b3和Cyp19a1存在核受體基因Sf1和Nur77的結合位點，通過結合在靶基因啟動子區域啟動靶基因的轉錄，促進類固醇激素合成[12-13]。前期研究發現，人、山羊、大鼠和小鼠卵巢中均存在類固醇合成基因（Hsd3b2、Hsd17b3和Cyp11a1）、核受體基因（Sf1和Nr0b1）和生物鐘基因的節律性表達[54,61-63]。核受體基因Sf1條件性敲除小鼠胚胎附植存在障礙，孕酮分泌減少[64]。生物鐘基因Clock誘導Cyp19a1和LhcgrmRNA 的表達，從而誘導卵巢顆粒細胞雌二醇分泌；Per2通過抑制BMAL1/CLOCK 異源二聚體的活性，從而抑制StAR的表達，抑制卵巢孕酮分泌[65]。本研究結果與上述發現一致，牦牛卵巢中不僅存在類固醇合成基因（Cyp11a1、Hsd17b3和Cyp19a1）的節律性表達，也存在核受體基因（Sf1、Nr1h4和Nur77）的節律性表達，說明牦牛卵巢生物鐘系統通過直接或間接（調控核受體基因）影響類固醇合成基因的表達，影響其類固醇激素的分泌。

大量研究證實，生物鐘控制基因啟動子區域存在一定的生物鐘控制元件，啟動生物鐘震蕩調控機制[66]。類固醇合成基因StAR、Cyp11a1、Hsd3b2和Cyp19a1，已被證實都是生物鐘控制基因，受到生物鐘系統的調控[24,67]。豬卵巢中核受體基因Sf1通過結合在類固醇合成基因Cyp19a1的轉錄起始位點，激活其mRNA 的表達[59]。雞卵巢類固醇合成基因StAR的啟動子區域存在一定數量的BMAL1/CLOCK 二聚體結合位點（E-box），證明生物鐘系統對雞類固醇合成基因StAR的表達有直接調節作用[67]。山羊Hsd17b3和Sf1基因啟動子區域存在大量的生物鐘控制元件，Bmal1基因過表達可顯著提高山羊睪丸間質細胞中Hsd17b3的表達水平，實時熒光素酶活性監測證實BMAL1/CLOCK 二聚體直接調控Hsd17b3基因的轉錄[68]。本研究結果與上述研究發現一致，牦牛體內類固醇合成和核受體基因啟動子區域，均存在一定數量的生物鐘控制元件，說明牦牛類固醇合成和核受體基因均為生物鐘控制基因。類固醇合成基因（Cyp11a1、Hsd17b3和Cyp19a1）和核受體基因（Nr1h4和Nur77）有較多的E-box、RORE和D-box序列統計數，且同時存在節律性表達，提示牦牛卵巢生物鐘直接調控Cyp11a1、Hsd17b3、Cyp19a1、Nr1h4和Nur77的轉錄水平影響類固醇激素合成。

3.2 結論

本研究發現牦牛卵巢生物鐘與類固醇合成基因表達存在節律相關性，初步分析了生物鐘對牦牛類固醇激素分泌的影響。研究結果為后期研究牦牛卵巢生物鐘調控類固醇激素分泌的分子機制以及通過生物鐘靶向調控牦牛繁殖力提供理論基礎。

致謝：青海大學省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室自主課題（2022-ZZ-09）、青海大學青年科研基金項目（2022-QNY-5，2021-QNY-8）、青海省科技廳科技援青合作專項項目（2020-QY-217）和青海省科技廳自然科學基金青年項目（2022-ZJ-934Q）同時對本研究給予了資助，謹致謝意！