王臺產卵育王技術對西方蜜蜂蜂王質量的影響

黎長龍，劉一博，王守程，何旭江，2*，劉光楠，袁 芳

（1.江西農業大學 蜜蜂研究所，江西 南昌 330045；2.江西省蜜蜂生物學與飼養重點實驗室，江西 南昌 330045；3.江西省石城縣農業農村局，江西 贛州 342700；4.江西省養蜂研究所，江西 南昌 330052）

【研究意義】蜜蜂是重要的授粉昆蟲，為全球85%以上農作物授粉，在維護生態平衡和糧食安全方面發揮著重要作用[1-3]。同時，蜜蜂也是重要的經濟昆蟲，為人類提供營養豐富的蜂產品[4]。然而，2006年以來全球各大洲均出現“蜂群衰竭失調癥（Colony collapse disorder，CCD）”，導致大量蜜蜂離奇死亡，其中蜂王質量下降是主要因素之一[5-6]。近年來，蜜蜂又面臨著過冬時期高死亡率的問題。北美地區蜂群數據統計顯示，其冬季損失率已經高達48%[7]。我國雖然沒有出現CCD 和越冬蜂高死亡率現象，但蜂王質量也有不斷下降的跡象。如今，殺蟲劑、氣候變化以及寄生蟲和疾病的傳播等，也威脅著蜜蜂的生存與繁衍[8]。因此，如何提高蜂王質量，提升蜂群的生存與繁衍能力已成為養蜂業的焦點問題。培育優質的蜂王對養蜂業發展具有重要意義。正鑒于此，本研究通過開發并應用王臺產卵育王技術培育優質蜂王，并對該技術所培育蜂王的質量進行評估?！狙芯窟M展】蜜蜂蜂王專職產卵，它是蜂群中唯一生殖器官發育完全的具有繁育能力的雌性個體，是整個蜂群的核心，在蜂群發展中具有決定性的作用[9-10]。而前人研究發現，蜜蜂群勢的強弱除了受外界環境條件影響，蜂王質量的優劣也會對蜂群產生重要影響[11-12]。蜂王質量的高低對蜂群的生長與發展非常重要，它決定了后代蜂群的生存能力、免疫能力，以及蜂群的產量和蜂產品質量[13]。從1568 年Nickel Jacob 利用自然王臺成功育王，到1888 年Doolittle[14]總結育王經驗并著《科學育王法》，蜜蜂人工移蟲育王技術在全球范圍內得到廣泛傳播與應用。這種傳統的育王方式是利用移蟲針移取工蜂巢房中的小幼蟲（1～2 d）至王臺培育蜂王。然而，有研究表明，蜂王漿所含成分如糖類、維生素、氨基酸、蛋白質和核酸等方面均與工蜂漿不同，且蜂王幼蟲比工蜂幼蟲獲得更多的食物[15-20]。本團隊前期研究發現，利用工蜂巢房卵所培育的F2 蜂王質量顯著高于人工移蟲育王所培育的F2 蜂王，且與發育、繁殖與免疫相關基因的甲基化水平會發生明顯改變[21]。易瑤等[22]報道了人工移蟲育王不僅會降低蜂王質量，其引起的甲基化變化還可以累代遺傳。最新研究表明，蜜蜂蜂王會在王臺中產更大更優質的卵，所培育的蜂王初生重等指標也顯著高于工蜂巢房卵和工蜂幼蟲培育的蜂王[23]。本團隊前期基于蜂王在王臺中產更大更優卵的生物學特性，研發了蜜蜂王臺產卵育王技術及設備[24]?！颈狙芯壳腥朦c】蜜蜂的育王方式不同對蜂王發育和質量的影響也不同，從而影響整個蜂群的生長與繁衍。某些蜜蜂育王技術，例如通過人工移取工蜂巢房幼蟲的方式培育蜂王，會顯著降低蜂王的質量[21-22]。與此同時，通過檢測蜂王的形態指標、卵巢管數等生理指標和關鍵基因表達等分子指標來評估蜂王的質量，可較好地評估蜜蜂育王技術的優劣性。本團隊前期研發了蜜蜂王臺產卵育王技術，但尚未對該技術所培育的蜂王質量水平進行有效評估?！緮M解決的關鍵問題】研究擬利用形態學分析、組織切片技術和實時熒光定量qRT-PCR 技術，比較分析蜜蜂王臺產卵育王和人工移蟲育王技術所培育蜂王的發育水平、繁殖性能和免疫能力等方面進行評估，為該技術在蜜蜂優質育種中的應用提供科學基礎，在保護蜜蜂這種重要的授粉昆蟲和促進養蜂業發展方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗蜂群

本研究共選取了6 群群勢較強（10 足脾）的西方蜜蜂（Apis mellifera），均來自江西農業大學蜜蜂研究所的飼養蜂群。

1.2 試驗器材與試劑

1.2.1 試驗主要器材 DHI 型恒溫恒濕培養箱（中國上海埃開儀器設備有限公司），ME204 型電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司），WSI 型蜜蜂形態指標測定系統（中國重慶奧特光學儀器有限公司），OPTPro 型體式顯微鏡（中國重慶奧特光學儀器有限公司），TP1020 型自動組織脫水機（德國徠卡公司），HistoCore Arcadia H 型包埋機（德國徠卡公司），HistoCore Arcadia C 型冷凝機（德國徠卡公司），Model RM2245 型石蠟切片機（德國徠卡公司），KD-H 型攤片機（中國浙江科迪儀器設備有限公司），KD-P 型烘片機（中國浙江科迪儀器設備有限公司），Autostainer XL 染色器具（德國徠卡公司），DP80 型顯微鏡（中國奧林巴斯有限公司），AG R404A 型離心機（德國艾本德生命科技公司），T100 型反轉錄儀器（美國伯樂公司），QuantStudio⑤型qRT-PCR 儀器（美國賽默飛世爾科技公司），蠟盤，解剖針，手術剪，尖口鑷子，鐵質、塑料包埋盒，載玻片與蓋玻片，中性樹脂，載玻片和蓋玻片，計數器，移液槍，滅菌槍頭，96 孔熒光定量板以及封口膜等。

1.2.2 試驗試劑 4%多聚甲醛固定液，無水乙醇，二甲苯，石蠟，伊紅染液，蘇木精染液，R6734 型RNA 提取試劑盒（美國Omega公司），巰基乙醇，RR047A反轉錄試劑盒（北京寶日醫生物技術有限公司），RR420A型熒光定量試劑盒（北京寶日醫生物技術有限公司）。

圖1 王臺產卵育王設備與蜂王全景圖Fig.1 The physical panorama of queen and queen-cell egg laying device

1.3 王臺產卵育王設備

采用本團隊前期研發的蜜蜂王臺產卵育王技術及方法進行優質蜂王培育試驗[24]。

1.4 育王方式

1.4.1 王臺產卵育王 參考袁芳等[25]試驗方法，先將產卵器與王臺等噴灑50%糖水，放入蜂群中清理1 d。然后把蜂王關入產卵器，控制在王臺區域產卵。待F1蜂王在王臺內產卵后，將王臺轉移至育王框上，放入已調整出哺育區域的繼箱中培育F2 蜂王。記錄王臺產卵率。產卵率=產卵數/王臺總數×100%；幼蟲接受率=幼蟲存活數/產卵總數×100%；出房率=處女王出房數/產卵總數×100%，試驗重復3次。

1.4.2 人工移蟲育王 參考龐倩等[26]試驗方法，以2 日齡（孵化后48 h）的工蜂幼蟲作移蟲育王，移入和王臺產卵育王相同的王臺，并與王臺產卵育王的王臺放置在一起培育F2蜂王，以此作對照組。

1.5 蜂王數據測定

1.5.1 初生質量的測定 蜂王出房后會因進食和水分喪失等出現體質量變化，且蜂群內蜂王出房時為方便取樣與測取數據，所以試驗時在蜂王出房的前一天，將育王框或封蓋王臺等，轉移至恒溫恒濕培養箱。每隔30 min觀察F2 蜂王出房情況，在F2蜂王出房半小時內利用分析天平稱取蜂王初生質量。試驗組和對照組各測定8只F2蜂王。

1.5.2 形態指標測定 參考Reeves 等[27]試驗方法，利用蜜蜂形態指標測定系統分別測定兩種F2 蜂王前翅長和前翅寬、后翅長和后翅寬、胸長和胸寬等形態指標。兩組蜂王個體形態和卵巢切片樣品測定各含8個生物學重復。

1.6 卵巢切片、染色及觀察計數

參考改進甘海燕等[28]，陳品素等[29]，盧鳳蘭等[30]試驗方法，取材：F2 蜂王出房并培育3 d 后（卵巢發育較好），解剖顯微鏡下進行解剖，取其腹部，并除去卵巢之外的消化道、中腸以及蜜囊等。

固定：將蜂王軀體裝入盛有1 mL 4%多聚甲醛固定液的1.5 mL EP 管內，常溫狀態下4 h 或者4 ℃狀態下12 h。經此固定后，蜂王卵巢表現為聚攏狀，借助尖鑷能穩定取出。根據Jackson[31]關于蜜蜂卵巢管數的標準測定方法，將右側卵巢轉移至塑料包埋盒中。為防止卵巢在下一個試驗環節中從塑料包埋盒漏出，在卵巢外周裹一層紗布，保護卵巢不丟失，脫水時的蠟液也能透入包埋盒。

脫水：將處理好的塑料包埋盒放置在自動組織脫水機內，進行脫水處理。

包埋：經自動組織脫水機處理后的卵巢，轉移至包埋機。將卵巢垂直包埋在鐵質包埋盒中，以獲得清晰的卵巢管橫截面。蓋上塑料包埋盒另一半（底部），然后迅速放入冷凍機中進行冷凝。待溫度降下之后，分離塑料包埋盒底座與鐵質包埋盒，此時的包埋樣品可放置在4 ℃冰箱保存。

切片：石蠟組織塊安置在切片機上，調整刀片角度以及刀片與蠟塊的距離，切取7～9 μm 的切片。然后用鑷子夾取切片，正面平鋪在40 ℃的攤片機水面中進行加溫攤片，使切片完全展開。直至切取到在顯微鏡下能清晰見到卵巢管的切片，而后在42 ℃的烘干機中烘干3 h。

染色并封片：烘干后帶有卵巢切片的載玻片，經過HE染色程序處理。取出載玻片，并滴樹脂進行蓋玻片封片，以防止二甲苯揮發導致切片組織顏色變黑。

封片在通風機下通風1 d，并靜置3 d后，在顯微鏡下觀察F2蜂王右側卵巢形態組織并拍照計數。

1.7 基因水平檢測

1.7.1 RNA 提取 參考Deng 等[32]試驗方法，取兩種F2 蜂王的頭部。分別放入EP 管，每管1 個頭，放入液氮迅速冷凍處理和保存。兩組蜂王各含3 個生物學重復。根據Omega 公司的RNA 提取試劑盒指導方法提取樣品總RNA：每管樣品加入350 μL 的GTC-buffer（1 mL 的buffer 中加入20 μL 的巰基乙醇），研磨搗碎，勻漿。將DNA結合柱套入2 mL離心管中，把裂解液轉移到柱子，13 000 r/min離心1 min，濾液用于RNA 提取。向濾液中加入0.5 倍體積的無水乙醇，渦旋15 s 混勻，然后轉移到RNA 結合柱的管中，13 000 r/min 離心1 min。再將結合柱套入新的收集管，加入500 μL 的RNA Wash BufferⅠ，13 000 r/min離心1 min，棄濾液。結合柱重新套回收集管，加入500 μL 的RNA Wash Buffer Ⅱ，13 000 r/min 離心1 min，棄濾液，然后重復此步驟1 次。RNA 結合柱套回收集管，14 000 r/min 離心空甩柱子2 min。將RNA 結合柱套入新的1.5 mL 離心管中，加入40 μL 提前水浴加熱至70 ℃的DEPC-treated water，室溫孵育5 min。室溫下離心1 min，然后將離心下去的DEPC-treated water 吸取上來并打回結合柱，重復洗脫，提高RNA提取產量，獲得樣品總RNA。

1.7.2 反轉錄 參考Deng等[33]試驗方法，選用Takara 反轉錄試劑盒，并建立20 μL 體系進行反轉錄。先去除基因組DNA反應1（42 ℃，2 min；表1），在冰上配制以下反應混合液，加入RNA樣品。進行反轉錄反應2（37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；表1），同樣在冰上配制以下反應混合液，加樣然后按照反應條件進行即可獲得cDNA。

表1 反轉錄試驗的反應液體系Tab.1 Reaction fluid system for reverse transcription experiments

1.7.3 基因引物設計選取 根據參考文獻[34-38]選取Antimicrobial peptide gene defensin-1（Defensin1）、Juvenile hormone acid methyltransferase（Jhamt）、Honey bee hexamerin110（Hex110）和Cytochrome P450 monooxygenase（CYP）家族中的CYP9Q1。Defensin1基因反映蜜蜂的免疫能力[34]，Jhamt基因被證實與蜂王的級型分化有關[35]，Hex110基因影響蜂王的卵巢發育[36]，CYP9Q1基因則關系到蜜蜂解毒性能[37-38]。因此試驗選擇這4 種基因進行熒光定量分析。在NCBI 上查詢相關基因編號和基因序列，各基因編號分別為Defensin1：LOC 406143；Jhamt：LOC 724216；Hex110：LOC 551648；CYP9Q1：LOC410492。以GAPDH（LOC410122）為內參基因，在Primer 5 軟件上設計引物序列（表2），由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表2 實時熒光定量PCR的各基因引物信息Tab.2 Primer sequences of each gene in quantitative real-time PCR

1.7.4 qRT-PCR 反應條件 熒光定量反應體系如表3所示，PCR擴增反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性2 min，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸15 s，循環40 次；72 ℃終延伸10 min。RT-qPCR 試驗每組樣品含7 個生物學重復，并且每個cDNA樣品進行3次技術重復。

表3 實時熒光定量qRT-PCR的反應液體系Tab.3 Reaction fluid system in quantitative real-time PCR

1.8 數據處理

基因相對表達量數據使用2-ΔΔCT進行計算，其中Defensin1、Jhamt、Hex110和CYP9Q1作為目的基因，GAPDH為內參基因。相對表達量以及卵巢管數等各項測定數據在檢驗其為正態分布后，采用STATVIEW分析軟件中的ANOVA分析和Fisher’s PLSD方法檢驗進行方差分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 王臺產卵育王與人工移蟲育王的幼蟲接受率與出房率

表4表明，蜜蜂王臺產卵育王的蜂王接受率隨幼蟲日齡的增長而下降。王臺產卵育王的幼蟲接受率與處女王出房率均顯著低于人工移蟲育王（P＜0.05）。

表4 王臺產卵與人工移蟲育王的王臺幼蟲接受率與出房率Tab.4 The acceptance and emerging rates of queen cells from the queen-cell egg laying and 2 d worker larva-grafting

2.2 王臺產卵育王與人工移蟲育王方式蜂王的初生重比較

圖2 表明，利用蜜蜂王臺產卵育王所培育的F2 蜂王初生質量（249.03±19.02）g 顯著高于人工移蟲育王（221.76±18.59）g的蜂王（P＜0.05）。

圖2 王臺產卵與人工移蟲育王蜂王的初生重比較Fig.2 Comparison of newborn weight of queens from the queen-cell egg laying and 2d worker larva-grafting

2.3 王臺產卵育王與人工移蟲育王方式蜂王的形態指標比較

圖3所示，王臺產卵育王F2代蜂王的前翅長和后翅長顯著長于人工移蟲育王F2代蜂王（P＜0.05），而前翅寬、后翅寬、胸長和胸寬則沒有顯著差異（P≥0.05）。

圖3 王臺產卵與人工移蟲育王蜂王的形態指標比較Fig.3 Comparison of morphological indexes of newly emerged queens from the queen-cell egg laying and 2 d worker larva-grafting

2.4 王臺產卵育王與人工移蟲育王的卵巢管數比較

圖4所示，王臺產卵育王的F2代蜂王右側卵巢的卵巢管數（164.80±12.70）顯著高于人工移蟲育王的F2代蜂王（137.25±13.35，P＜0.05）。

圖4 王臺產卵與人工移蟲育王蜂王的右卵巢管數比較Fig.4 The ovariole number（right side ovary）of queens from the queen-cell egg laying and 2 d worker larva-grafting

2.5 王臺產卵育王與人工移蟲育王蜂王的4種基因表達量比較

圖5 所示，Defensin1、Jhamt與Hex110基因在王臺產卵育王F2 代蜂王的表達量顯著高于人工移蟲育王F2代蜂王（P＜0.05），而CYP9Q1基因表達量則差異不顯著（P≥0.05）。

圖5 王臺產卵與人工移蟲育王蜂王的4種基因表達量比較Fig.5 The expression of four genes in queens from the queen-cell egg laying and 2 d worker larva-grafting

3 討論與總結

蜂王是影響蜜蜂蜂群生產的首要因素，在養蜂業中起重要作用[39]。尤其是在全球蜜蜂面臨著疾病、寄生蟲、環境污染等諸多挑戰的情況下[5-6,8]，如何培育出高質量的蜂王顯得尤為重要。本研究在前期開發的蜜蜂王臺產卵育王技術基礎上，對該技術所培育蜂王的個體發育、繁殖性能和免疫能力等方面進行了評價和分析。結果表明，蜜蜂王臺產卵技術培育的蜂王初生重、前翅長和后翅長均顯著高于人工移蟲育王技術培育的蜂王（圖2、圖3），王臺產卵育王蜂王右側卵巢的卵巢管數顯著多于人工移蟲育王蜂王（圖4）。這是因為蜜蜂的母體效應，王臺中的卵含有更豐富的營養物質，有利于蜂王幼蟲的發育成長[22-23]。蜂王卵巢管數是評價蜂王生殖能力的一個重要指標，卵巢管數目越多，則越有利于其性成熟，增加產卵數量，同時也會使封蓋子脾面積增大[40]。因此，采用蜜蜂王臺產卵育王技術可以顯著地改善蜂王的個體發育和生殖性能。

此外，Defensin1基因是反映蜜蜂免疫能力的關鍵基因，其多肽可以對抗革蘭氏陽性細菌感染[34]。結果顯示，人工移蟲育王培養的蜂王中，Defensin1基因的表達水平相對較低，而在王臺產卵育王的F2 蜂王中，該基因的表達水平相對高，表明王臺產卵育王F2 蜂王的免疫功能更加強大，防御系統更加完善。Jhamt基因則被證實與蜂王的級型分化有關，它的主要作用是防止變態發育和調節生殖成熟[35]。試驗結果顯示，Jhamt基因表達量在王臺產卵育王的F2 蜂王中含量更高，證明其細胞分化機理更成熟。而Hex110基因主要作用是儲備幼蟲向成蟲發育時所需的氨基酸物質，前人研究證實該基因家族是影響蜂王卵巢發育的關鍵基因[36]。而本研究的結果表明王臺產卵育王F2代蜂王具有比對照組蜂王更多的卵巢管數，這極可能與其體內高表達的Hex110等關鍵基因相關。試驗結果發現參與蜜蜂解毒相關功能的CYP9Q1基因[37-38]則未出現明顯的差異表達，說明王臺產卵育王技術對蜂王解毒相關的能力可能沒有潛在影響?？傊?，本研究發現3 個關鍵基因（Defensin1、Jhamt、Hex110）在王臺產卵育王的蜂王體內表達顯著高于人工移蟲育王培育的蜂王（圖5），表明王臺產卵育王技術培育的蜂王在個體發育、生產性能及其免疫能力等方面，均優于人工移蟲育王。

然而，蜜蜂王臺產卵育王的接受率顯著低于人工移蟲育王（表4）。這可能與蜂王的產卵特性有關。蜂王在繁殖季節在自然王臺中產約10～20 個受精卵，培育后代蜂王[41]。本研究中，蜂王在塑料王臺中產卵欲望較低，且王臺中產受精卵的數量極可能會受到蜂群限制。同時，試驗中還發現，季節對蜂王的王臺產卵特性也有較大的影響。因此，蜂王在王臺中產卵的內在機制與生物學特性仍需進一步深入研究，進而提高蜜蜂王臺產卵育王的接受率。

利用先進的方法培育優質蜂王是促進蜂群健康和養蜂業發展的重要保證。然而，沿用了上百年的人工移蟲育王技術不斷地降低蜂王的質量，逐漸暴露出了各種弊端，對蜜蜂這一重要的授粉昆蟲的生存與繁衍帶來諸多不利影響[21-22]。本團隊研發的蜜蜂王臺產卵技術充分利用了蜜蜂的母體效應對蜂王發育的促進作用。利用王臺中高質量的受精卵培育蜂王可顯著提高蜂王的質量，其個體發育水平、繁殖性能和免疫力等均顯著優于人工移蟲育王所培育的蜂王。為培育優質、高產和抗病力強的高質量蜂王提供了技術支持。如能長期利用該技術進行優質蜂王的培育，將可扭轉人工移蟲育王對蜜蜂帶來的不利影響，從而不斷促進蜜蜂蜂群的健康與發展。該育王技術可廣泛應用于蜜蜂育種與生產領域，不斷提高蜂群的生存與繁衍能力，以及抵御諸多環境挑戰的能力，為促進養蜂業的發展提供技術支持，同時在保護和利用蜜蜂這一寶貴的資源方面具有重要意義。