小鼠RNA結合蛋白QKI-5的生物信息學和組織表達分析及其過表達對癌癥相關基因表達的影響

王逢博，高登科＊，李 超，李 丹，劉 薇，張海森，楊王浩，靳亞平，陳華濤*

（1.西北農林科技大學 動物醫學院，陜西 楊凌 712100；2.農業農村部動物生物技術重點實驗室，陜西 楊凌 712100）

【研究意義】RNA 結合蛋白（RNA-binding Proteins，RBPs）是一類存在于細胞中與mRNA 有高度親和性的蛋白質，包含2 000種以上的蛋白質，是RNA 轉錄后調控過程的關鍵參與者。其RNA 結合域結構的靈活性以及功能的多樣性，使RBPs 能夠調控大量轉錄本的代謝過程[1-2]。Quaking（QKI）是一類重要的RBP，通過QKI反應元件（quaking response element，QRE）與RNA特異性結合，可以調控細胞分化[3-4]、細胞凋亡[5]、細胞周期、膠質細胞命運和發育[6-7]等細胞生物過程。研究發現QKI 能夠抑制豬睪丸支持細胞凋亡，且可以促進未成熟的豬睪丸支持細胞中胰島素樣生長因子IGF-1 等分泌因子的分泌以及細胞增殖[8-9]。此外，QKI基因在山羊骨骼肌組織中高表達，且在山羊骨骼肌衛星細胞增殖分化的過程中表現出持續上升的表達規律，提示QKI 在山羊的骨骼肌發育的過程中可能也發揮一定作用[10]。近年來，許多研究證據表明Qki-5 轉錄本與前列腺癌[11]、肺癌[12-13]、卵巢癌[14]以及乳腺癌[15]等多種癌癥的發生密切相關。但是，對于QKI-5的其他功能以及在肝癌發生發展過程中的影響作用鮮有報道。因此，預測QKI-5未知功能并研究其在肝癌發生發展過程中的作用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】RBPs可通過直接或間接與mRNA 上的作用元件結合，在RNA 的轉錄后調控中起著關鍵作用[16-17]，參與調控RNA 加工過程的各個方面，在調控RNA 編輯、代謝、剪接、定位和翻譯等過程中發揮著重要作用[18-20]。研究證據表明，RBPs 表達改變和功能異常會影響RNA 表達的多個生理過程，進而引起免疫性疾病[21]、神經系統疾病[22]、心臟疾病[23-24]、急性白血病[25]以及結直腸癌[26-27]等多種疾病的發生。RNA 結合蛋白QKI 是STAR（signal transduction and activation of RNA）蛋白家族的一員，Qki基因位于人類第6 號染色體和小鼠第17 號染色體上，在KH 結構域內含有一個RNA 結合基序，其兩側有兩個QUA 結構域（QUA1 和QUA2）[28]。QKI 選擇性剪切生成5，6，7 kb大小的轉錄本，分別編碼QKI-5、QKI-6、QKI-7蛋白。其中，QKI-5在基因序列上有一段非經典的核定位信號肽，因此其主要位于細胞核中，但在胞漿中也能檢測到QKI-5，其可以發揮將胞漿信號輸送到胞核的功能[29]，而QKI-6、QKI-7主要存在于細胞質內[30]。近年來有許多研究證據表明QKI-5作為一個重要的轉錄因子，在許多生理、病理過程中發揮作用。Cochrane 等[3]研究發現，在小鼠誘導多能干細胞分化的內皮細胞中，過表達QKI-5能夠顯著改善實驗性后肢缺血后血管生成、新生血管形成及血流恢復。Zhao 等[11]研究發現，Qki-5 基因在體外和體內均能有效抑制前列腺癌細胞增殖。趙易等[15]研究發現，在乳腺癌中QKI-5的高表達可能通過抑制癌細胞的細胞周期致使細胞增殖變緩，從而具有抑制腫瘤生長的作用。段小霞等[14]研究發現，QKI-5在卵巢癌細胞中特異性擴增后能夠抑制卵巢癌細胞的增殖以及細胞克隆形成并促進癌細胞發生凋亡?！颈狙芯壳腥朦c】QKI-5作為轉錄因子，其調控的下游靶基因眾多，調控方式多種多樣。但人們對QKI-5 參與調控哺乳動物多種生理、病理功能認識仍不全面，亟待進一步的深入探究。并且該基因在肝癌發生發展過程的影響仍尚不清楚?！緮M解決的關鍵問題】本研究擬通過克隆小鼠Qki-5基因的蛋白編碼序列（coding sequence，CDS），構建其真核表達載體，并對小鼠QKI-5進行了生物信息學分析，為進一步探究Qki-5基因的生物學功能提供關鍵材料支撐，為后續探究牛、羊等反芻動物Qki-5基因的功能提供前期研究基礎；此外，本研究探索Qki-5 基因在不同組織的表達豐度及其在小鼠肝臟中的表達分布，分析在小鼠肝細胞AML12 中過表達Qki-5 基因后檢測其對癌癥相關基因表達的影響，以期為探究Qki-5 基因在小鼠AML12 細胞中影響癌癥相關基因表達的作用機制提供關鍵材料與前期基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022 年02 月至2022 年08 月在西北農林科技大學農業農村部動物生物技術重點實驗室完成。試驗所用的組織包括小鼠肝臟、心臟、脾臟、腎臟、肺臟、十二指腸、結腸、全腦、肌肉、附睪脂肪、皮下脂肪以及睪丸，共計12個組織，每種組織分別取自3只4月齡C57BL/6野生型雄鼠，小鼠購自北京維通利華公司；HEK293T、AML12細胞購自中國科學院細胞庫。

1.2 主要試劑

DH5α感受態細胞、膠回收試劑盒、無內毒素質粒小提中量試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；胎牛血清、Opti-MEM 培養基購自美國Gibco 公司，DMEM 高糖培養基購自Hyclone 公司，TurboFect Transfection Reagent 購自美國Thermo Fisher 公司；TRIzol、PrimerSTAR?Max DNA polymera 和Quick Cut?BmaHⅠ購自日本TaKaRa 公司；反轉錄試劑盒購自日本TOYOBO 公司、SYBR qPCR Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；RIPA 裂解液、PMSF、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑均購自上海碧云天生物技術有限公司；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；脫脂奶粉購自BD 公司；兔抗HA 抗體購自Abcam 公司；兔抗GAPDH 多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；HRP 共軛山羊抗兔抗體購自中國中杉金橋公司；ECL HRP 底物試劑盒購自北京迪寧生物科技有限公司；多聚甲醛固定液購自武漢賽維爾生物科技有限公司；兔抗QKI 單克隆抗體購自博士德生物工程有限公司；非特異性兔抗IgG 抗體購自Abcam 公司；免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP 試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設計與合成 根據GenBank 數據庫中的小鼠Qki-5 基因CDS 區序列（登錄號：NM_001159517.1），使用Primer Premier 6.0 軟件設計PCR 擴增引物，引物序列如下：F：5′-AGAGAATTCGATATCGGATCCATGGTCGGGGAAATGGAAAC-3′；R：5′-GGTCTCGAGGGTACCGGATCCTTAGTTGCCGGTGGCGG-3′（下劃線為BamHⅠ酶切位點），在上下游引物5′分別添加了pcDNA3.1-Puro-N-3HA載體BamHⅠ酶切位點兩側互補配對的同源序列，預計擴增產物長度為1 026 bp。引物交由西安擎科生物科技有限公司合成。

1.3.2 PCR擴增 稱取20 mg小鼠肝臟組織，加入1 mL TRIzol，使用TRIzol法提取總RNA，并使用逆轉錄試劑盒將提取的RNA 逆轉錄為cDNA，反應液均在冰上配制，反應過程如下：RNA 5 μL 65 ℃變性5 min；反應后加入4×DN Master Mix 2 μL、Nuclease-free water 1 μL混勻，37 ℃溫育5 min；之后加入5×RT Master Mix Ⅱ 2 μL，37 ℃ 15 min、50 ℃ 5 min、98 ℃ 5 min，反應結束后置于-20 ℃保存。以cDNA為模板，PCR擴增帶有同源序列的Qki-5基因CDS區片段。PCR 反應體系50 μL：2×PrimerSTAR Max Premix 25 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA 4 μL（50 ng/μL），加ddH2O 至50 μL。PCR 反應程序：98 ℃預變性3 min，98 ℃變性10 s，53.5 ℃退火15 s，72 ℃延伸75 s，循環35次，72 ℃終延伸5 min。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，符合預期的條帶進行膠回收。

1.3.3 pcDNA3.1-mQki-5真核表達載體的構建 使用限制性內切酶BamHⅠ對pcDNA3.1-Puro-N-3HA載體進行線性化，反應體系：pcDNA3.1 2 μL，Quick CutTMBamHⅠ 1.5 μL，10×Quick Cut Green Buffer 2 μL，加ddH2O 至20 μL。將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并將目的條帶進行膠回收純化。之后將膠回收純化的Qki-5基因CDS區片段與pcDNA3.1-Puro-N-3HA線性化載體進行重組連接，反應體系：線性化載體104.22 ng，插入片段41.04 ng，5×CE Ⅱ Buffer 4 μL，Exnase Ⅱ 2 μL，加ddH2O 至20 μL，37 ℃反應30 min。反應結束后，按照說明書將重組產物轉化到DH5α 感受態細胞中，在含有羧芐青霉素抗性的LB 固體培養基中倒置培養37 ℃ 16 h，之后挑取單克隆菌落，置于37 ℃搖床擴增培養12 h，使用無內毒素質粒小提試劑盒提取質粒并測濃度。對重組質粒進行單酶切和PCR 鑒定，將符合預期的重組質粒送至西安擎科生物科技有限公司測序，將測序結果與NCBI 上的序列進行比對，并將測序正確的重組質粒重命名為pcDNA3.1-mQki-5。

1.3.4 生物信息學分析 利用DNASTAR 及MEGA11 軟件對小鼠的Qki-5 基因和大鼠、人、山羊、綿羊、牛、牦牛、豬、馬、雙峰駝、斑馬魚、鯉魚的Qki基因CDS 區序列進行同源性比對，并構建系統進化樹；應用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件對小鼠QKI-5蛋白理化性質進行分析，包括蛋白分子式及分子質量、原子總數、氨基酸數、理論等電點、穩定系數、脂肪族系數等理化性質；應用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）在線軟件對小鼠QKI-5 蛋白氨基酸序列的親/疏水性進行預測；使用NetPhos 3.1 server（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）在線軟件對小鼠QKI-5 蛋白進行磷酸化位點預測；使用SingaIP5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）在線軟件預測小鼠QKI-5 蛋白信號肽；使用TMHMM2.0 Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在線程序進行跨膜區預測；使用PSORTII Prediction（https：//psort.hgc.jp/form2.html）在線軟件進行亞細胞定位預測；應用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線工具網站預測小鼠QKI-5 蛋白的二級結構；應用在線軟件SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預測山羊、小鼠和人QKI-5 蛋白的三級結構，并使用PyMOL 對預測模型進行比較；最后，使用STRING（https：//cn.string-db.org/）在線數據庫預測小鼠QKI-5蛋白的互作蛋白。

1.3.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測Qki-5基因在小鼠不同組織的表達譜 在同一時間點收取同一環境中3 只C57BL/6 雄鼠的肝臟、心臟、脾臟、腎臟、肺臟、十二指腸、結腸、全腦、肌肉組織、附睪脂肪組織、皮下脂肪組織以及睪丸組織，共12 個組織樣品，分別稱取各組織樣品20 mg，加入1 mL TRIzol，提取組織總RNA，并反轉錄為cDNA，稀釋至2.5 ng/μL 備用。使用Primer Premier 6.0 軟件設計小鼠的Qki-5 基因和36b4基因的引物序列（表1），使用CFX96 熒光定量儀器反應，檢測Qki-5 基因和36b4基因的表達。并以36b4基因為內參，使用2-ΔΔCt相對定量法計算不同組織Qki-5 基因的相對表達倍數[31]。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information

1.3.6 免疫組織化學技術（IHC）檢測QKI-5 在小鼠肝臟組織中的分布 使用多聚甲醛固定小鼠的肝臟組織，并將已固定的組織制成石蠟切片。使用二甲苯以及梯度酒精將石蠟切片脫蠟脫水；之后使用抗原修復液高火煮沸后調至中火維持20 min 斷續沸騰狀態，冷卻至室溫后，PBS 清洗3 次，每次5 min；0.2% TrionX-100室溫透膜30 min，PBS 清洗3次，每次5 min；使用1% BSA 室溫封閉1 h，之后甩干封閉液；QKI抗體（1：150 稀釋）或非特異性IgG 抗體（1：200 稀釋）在濕盒中4℃孵育過夜，分別為試驗組與陰性對照組，次日室溫孵育30 min 后，PBS 清洗5 次，每次5 min；使用免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP 試劑盒進行免疫組織化學染色，之后使用光學顯微鏡觀察QKI-5的分布并保存圖像[32]。

1.3.7 重組質粒轉染AML12 細胞 復蘇AML12 細胞，培養24 h 后，將生長狀態良好的細胞分別傳代至兩個6 孔板中，待細胞密度達到60%左右時進行轉染。將pcDNA3.1-Puro-N-3HA 空載體和pcDNA3.1-mQki-5 重組質粒按照Turbofect 轉染試劑說明書分別轉染至AML12 細胞。每個6 孔板中，對照組和試驗組各轉染3孔，轉染后培養24 h收取RNA樣品，48 h后收取蛋白樣品，分別用于檢測小鼠QKI-5在mRNA水平和蛋白水平的表達。

1.3.8 qRT-PCR 檢測Qki-5 基因在AML12 細胞的表達 轉染24 h 后，加入TRIzol 提取試驗組及對照組細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，稀釋至2.5 ng/μL 備用。使用qPCR 檢測Qki-5 基因和36B4基因在mRNA水平的表達（表1）。反應體系如下：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL、cDNA 5 μL（2.5 ng/μL），加ddH2O 補足至20 μL。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40 個循環；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s。使用熒光定量系統進行反應，并以36b4基因為內參，使用2-ΔΔCt相對定量法計算試驗組與對照組Qki-5基因相對表達量及相對倍數。

1.3.9 Western Blotting（WB）檢測QKI-5在AML12細胞中的表達 轉染48 h后收取細胞樣品，按說明書使用RIPA 裂解液提取試驗組與對照組的細胞總蛋白，之后使用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，并加入裂解液將樣品稀釋至統一濃度，之后加入上樣緩沖液，100 ℃ 水浴10 min，樣品放-20 ℃保存或直接進行SDSPAGE 凝膠電泳。電泳結束后，將蛋白轉印至PVDF 膜上，之后使用10%脫脂奶粉封閉2 h。封閉完后，使用TBST 洗膜3 次，每次10 min；之后將PVDF 膜置于兔抗HA 標簽的一抗工作液（1∶4 000），4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜3 次，每次10 min；之后將PVDF 膜置于山羊抗兔二抗工作液（1∶5 000），室溫孵育2 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。之后將膜在ECL發光液中浸泡2 min，于暗室曝光顯影并保存蛋白結果[33]。

1.3.10 在AML12細胞中檢測癌癥相關基因的表達 分別在mRNA 和蛋白水平驗證QKI-5在AML12細胞成功過表達后，使用Primer Premier 6.0 軟件設計引物序列（表2），使用熒光定量系統檢測Bcl2、P53、Ccnd1、CerbB2、Rasa1、Kras、Cdkn1a、Cdkn1b等8個癌癥相關基因的mRNA表達量，并以36b4基因為內參，使用2-ΔΔCt相對定量法計算不同基因的相對表達倍數。

表2 癌癥相關基因引物序列信息Tab.2 Primer sequence information for cancer-related gene

1.3.11 數據統計分析 采用2-ΔΔCt法將qPCR中的Ct值轉化為基因相對表達量，利用GraphPad Prism 6進行數據分析，并進行非配對t檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠Qki-5基因克隆及真核表達載體的構建

以小鼠肝臟cDNA 為模板，使用帶有同源臂的引物進行PCR 擴增，將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結果如圖1A 所示，擴增片段符合預期目的片段大?。? 026 bp）。將目的條帶進行膠回收，與使用BamHⅠ限制性內切酶線性化的載體進行同源重組連接，構建pcDNA3.1-mQki-5 真核表達載體。對重組載體與空載體進行單酶切鑒定，結果如圖1B所示，空質粒大小為5 211 bp，目的片段大小為1 026 bp，酶切結果符合預期。并將重組質粒pcDNA3.1-mQki-5進行測序分析，測序結果與NCBI數據庫中已公布序列完全一致。以上結果表明，pcDNA3.1-mQki-5真核表達載體構建成功。

圖1 小鼠Qki-5基因CDS擴增與pcDNA3.1-mQki-5真核表達載體鑒定結果Fig.1 Results of mouse Qki-5 gene CDS amplification and identification of pcDNA3.1-mQki-5 eukaryotic expression vector

2.2 生物信息學分析

2.2.1 不同物種間Qki基因CDS 序列相似性比對及進化樹構建 利用DNASTAR 及MEGA11 對12 個物種的Qki基因CDS區序列進行同源性比對，并構建系統進化樹。相似性比對結果如圖2所示，小鼠Qki基因的CDS 區與人、大鼠、山羊、綿羊、牛、牦牛、豬、馬、雙峰駝、斑馬魚、鯉魚的相似性分別是96.4%、95.5%、94.5%、94.6%、94.2%、92.7%、95.6%、95.7%、89.8%、68.5%、67.8%，由此可知，小鼠Qki基因的CDS區與人的相似性最高，與鯉魚的相似性最低。系統進化樹的結果如圖3所示，這12個物種之間，小鼠Qki基因與大鼠的遺傳距離最近，其次是人、馬和豬等其他哺乳動物，與鯉魚的遺傳距離最遠。

圖2 Qki基因CDS區序列相似性比對Fig.2 Homology comparison of Qki gene’s CDS region

圖3 小鼠Qki基因的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Qki gene in mice

2.2.2 蛋白理化性質預測 應用ProtParam 在線軟件對小鼠QKI-5 蛋白理化性質進行分析，結果顯示小鼠QKI-5蛋白分子式為C1672H2713N463O493S15，原子總數為5 356，分子質量約為37.67 ku。QKI-5蛋白的氨基酸組成如表3 所示，共包含氨基酸341 個，其中色氨酸（Trp）含量最低，丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）和脯氨酸（Pro）含量較高，不含有吡咯賴氨酸（Pyl）和硒代半胱氨酸（Sec）。理論等電點為8.63，為堿性蛋白質；不穩定系數為35.08，為穩定蛋白質；總平均親水性（GRAVY）為-0.388；脂肪系數為87.01。

表3 小鼠QKI-5蛋白氨基酸組成Tab.3 Amino acid composition of mouse QKI-5 protein

2.2.3 親/疏水性預測 應用ProtScale 在線軟件對小鼠QKI-5蛋白氨基酸序列的親/疏水性進行預測，結果顯示，最低分值（-3.744）位于第134、135位氨基酸，表明親水性最強；最高分值（1.789）位于第217、218位氨基酸，表明疏水性最強；且該蛋白大部分位于親水區域，故小鼠QKI-5蛋白為親水性蛋白。

2.2.4 磷酸化位點預測 使用NetPhos 3.1 server在線軟件對小鼠QKI-5蛋白進行磷酸化位點預測，預測結果表明，QKI-5 蛋白含9 個絲氨酸（Serine）磷酸化位點，12 個蘇氨酸（Threonine）磷酸化位點，5 個酪氨酸（Tyrosine）磷酸化位點，共26個磷酸化位點。

2.2.5 信號肽及跨膜結構預測 使用SingaIP5.0 在線軟件預測小鼠QKI-5 蛋白信號肽。結果顯示，該蛋白不存在信號肽；使用TMHMM2.0 Server 程序進行跨膜區預測，結果表明，QKI-5 蛋白不存在跨膜區域；使用PSORTII Prediction 在線軟件進行亞細胞定位預測，結果顯示，該蛋白有56.5%定位于細胞核上，17.4%定位于細胞質中，8.7%定位于高爾基體，4.3%定位于分泌小泡、過氧化物酶體、線粒體和細胞骨架。

2.2.6 蛋白質二級結構預測 應用SOPMA 在線工具網站預測小鼠QKI-5蛋白的二級結構，預測結果表示：小鼠QKI-5 主要由α-螺旋、β 轉角、延伸鏈、無規則卷曲構成，其中α-螺旋占32.84%，β 轉角占4.40%，延伸鏈占14.96%，無規則卷曲占47.80%，推測無規則卷曲是QKI-5最大的二級結構原件。

2.2.7 蛋白質三級結構預測 應用在線軟件SWISS-MODEL 預測小鼠的QKI-5 蛋白（NCBI 登錄號：NP_001152989.1），以及人（NCBI 登錄號：NP_006766.1）和大鼠QKI 蛋白（NCBI 登錄號：NP_001108493.1）的三級結構，結果如圖4 所示。使用PyMOL 對預測模型進行比較，結果顯示，三者QKI 蛋白模型間原子位置均方根偏差（Root-Mean-Square Deviation，RMSD）均為0.00，說明小鼠預測QKI蛋白的三級結構與人和大鼠之間的三級結構沒有差異；并且將三者的氨基酸序列在NCBI 在線網站上進行比對，結果顯示小鼠與人的氨基酸序列完全相同，小鼠與大鼠的氨基酸序列相似率為91%。3 個物種之間的三級結構一致，說明其在功能上可能也具有高度相似性。

圖4 小鼠、人、大鼠QKI蛋白三級結構預測Fig.4 Prediction of the tertiary structure of mouse QKI protein in mouse，human and rat

2.2.8 QKI-5蛋白的互作蛋白預測 使用STRING 在線數據庫預測小鼠QKI-5蛋白的互作蛋白，預測結果如圖5所示，QKI-5蛋白主要與多聚胞嘧啶結合蛋白4（Poly rC binding proteins，PCBP4）、多重剪接RNA結合蛋白2（RNA binding protein with multiple splicing 2，RBPMS2）、真核翻譯起始因子4E 核輸入因子1（Eukaryotic translation initiation factor 4E nuclear import factor 1，Eif4enif1）、RNA 結合fox-1 同源物2（RNA binding fox-1 homolog 2，RBFOX2）、RNA 結合蛋白mRNA 加工因子（RNA binding protein mRNA processing factor，RBPMS）、遠上游元件結合蛋白（Far upstream element binding protein 3，FUBP3）、U2 小核RNA輔助因子2（U2 small nuclear RNA auxiliary factor 2，U2AF2）、多聚胞嘧啶結合蛋白29（Poly rC binding protein 2，PCBP2）、多聚嘧啶束結合蛋白2（Polypyrimidine tract binding protein 2，PTBP2）、核異質核糖核蛋白L樣（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L like，hnRNPLL）等蛋白之間存在互作。

圖5 小鼠QKI-5蛋白互作蛋白預測Fig.5 Prediction of proteins interaction with mouse QKI-5 protein

2.3 Qki-5基因在小鼠不同組織中的表達譜

提取3 只C57BL/6 雄性小鼠的12 個組織總RNA，反轉錄為cDNA 后，檢測小鼠Qki-5 基因的表達，以36b4基因為內參，計算Qki-5 基因的相對表達量，并均一化各組織表達量，分析12 個組織的表達相對變化，結果如圖6所示。在12個組織中，全腦的表達量最高，其次是肺臟、皮下脂肪組織以及附睪脂肪組織等，肝臟的表達量處于中等水平，十二指腸和結腸的表達量最低。

圖6 小鼠Qki-5基因mRNA在不同組織的表達豐度Fig.6 Expression abundance of mouse Qki-5 gene’s mRNA in different tissues

2.4 QKI-5蛋白在小鼠肝臟組織中的表達分布

通過免疫組織化學技術檢測小鼠肝臟中QKI-5 的表達分布，結果如圖7 所示，QKI-5 表達分布于肝細胞中，且主要定位于細胞核內。

圖7 QKI-5在小鼠肝臟組織中的表達分布Fig.7 The distribution of QKI-5 in mouse’s liver

2.5 QKI-5在AML12細胞中成功過表達

將pcDNA3.1-mQki-5 重組質粒和pcDNA3.1-Puro-N-3HA 空質粒分別轉染至AML12 細胞后，檢測QKI-5的表達水平。結果如圖8A 所示，pcDNA3.1-mQki-5試驗組Qki-5基因的mRNA 表達量升高，為對照組的5.78 倍（P＜0.01）。表明，pcDNA3.1-mQki-5 重組質粒轉染AML12 細胞中在mRNA 水平成功過表達。由圖8B可知，試驗組細胞樣品中經HA抗體孵育后，在約38 ku處有明顯的條帶出現，而在對照組中無條帶出現。該結果表明pcDNA3.1-mQki-5 重組質粒轉染AML12 細胞中在蛋白水平成功過表達。以上結果表明pcDNA3.1-mQki-5重組質粒轉染AML12細胞中在mRNA和蛋白水平均成功過表達。

圖8 qPCR及Western Blotting檢測結果Fig.8 Results of qPCR and WB analysis

2.6 AML12細胞過表達Qki-5對癌癥相關基因表達的影響

基于結果2.5，進一步檢測對照組和試驗組原癌基因Bcl2、Kras、Ccnd1、CerbB2以及抑癌基因P53、Rasa1、Cdkn1a、Cdkn1b8 個癌癥相關基因的相對表達量，結果如圖9 所示，與對照組相比，試驗組的P53mRNA 水平顯著增加至3.32 倍（P＜0.01），試驗組的Ccnd1mRNA 增加至1.69 倍（P＜0.05），Bcl2、CerbB2、Rasa1、Cdkn1a、Cdkn1b、Kras基因的mRNA水平均未見變化。

圖9 癌癥相關基因mRNA相對表達量Fig.9 Relative mRNA expression levels of cancer related genes

3 結論與討論

近年來，隨著科學技術的發展，人們對于RBPs 的研究不斷深入，逐漸證明RBPs 在許多生理過程中都發揮重要作用。QKI蛋白是一類重要的RNA 結合蛋白，而QKI-5作為其重要轉錄本所編碼的蛋白，在RNA 轉錄后調節的過程中也發揮著重要作用。QKI-5作為重要的轉錄因子，人們對其的生理、病理功能的認識尚不全面。目前，對于RNA 結合蛋白QKI-5 的研究主要集中在其對于乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的影響作用[11-15,34]，而其在肝癌發生發展過程中作用的研究未見報道。癌癥在動物中的發生率和死亡率很高，嚴重威脅著動物的生命與健康。因此，本研究構建了小鼠Qki-5基因真核表達載體，通過生物信息學在線軟件對QKI-5 蛋白的結構和功能特征進行預測分析；檢測QKI-5 在不同組織的表達譜以及在小鼠肝臟中的表達分布；并對于在AML12 細胞中過表達QKI-5 后對癌癥相關基因的影響進行研究，以期為后續研究QKI-5在不同生理、病理過程中的功能以及在小鼠AML12細胞中影響癌癥相關基因表達的作用機制提供前期材料。

蛋白質互作預測結果表明，與QKI-5蛋白相互作用的前十位蛋白中，主要包括PCBP4、RBPMS2、RBPMS、RBFOX2 以及FUBP3。其中，RNA 結合蛋白PCBP4 是p53 的靶蛋白，在細胞周期中發揮作用，并參與肺腫瘤的抑制作用。Yan 等[35]研究結果表明PCBP4 缺乏的小鼠容易發生肺腺癌、淋巴瘤和腎腫瘤，并且PCBP4缺乏的小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）表現出細胞增殖增加但細胞衰老減少。Notarnicola 等[36]發現，RNA 結合蛋白RBPMS2具有調節雛雞胃腸道平滑肌發育的作用，其持續表達可通過抑制骨形態發生蛋白的活性，來抑制平滑肌細胞分化標志物的表達，從而刺激平滑肌細胞的增殖。此外，Rabelo-Fernandez 等[37]的研究證據表明，RBPMS 可作為抑癌基因發揮作用，降低RBPMS 水平可以促進卵巢癌細胞增殖，降低細胞對順鉑敏感性，促進卵巢癌細胞對順鉑的耐藥。研究證據表明，在糖尿病的發展過程中，RBFOX2 通過與靶基因AS結合，破壞正常的基因在心臟的表達模式，從而引起糖尿病早期心肌病的發生[38]。遠上游元件結合蛋白FUBP3具有抵抗豬流行性腹瀉感染的功能，研究證據表明，FUBP3可以降解豬流行性腹瀉病毒核衣殼蛋白并誘導I型干擾素的產生[39]。上述證據表明，QKI-5可能參與調控癌癥、心臟相關疾病以及參與免疫等眾多生理、病理過程，但該功能僅為初步預測分析結果，仍需進一步驗證。

此外，本研究通過qPCR檢測小鼠Qki-5基因在不同組織表達分布，結果表明該基因在所檢測的12個組織中均有表達且在全腦中表達量最高，其次是肺臟。由于全腦主要與神經系統相關功能有關，因此推測QKI-5可能在調控神經系統和肺臟的生命活動過程中具有一定作用。研究發現，Qki基因的突變會導致中樞和周圍神經系統髓鞘形成障礙而引起頻繁震顫，嚴重可于胚胎早期死亡，也因此得名為Quaking[40]。Hayakawa-Yano 等[41]研究發現QKI-5可以抑制神經元遷移并誘導異位有絲分裂細胞，在神經干細胞中發揮功能。Wang等[12]研究結果表明，QKI-5可以調控肺癌細胞骨架基因ADD3的可變剪接，反映了QKI-5的對肺癌的抑制作用；Zhou等[42]研究發現QKI-5可以通過抑制β-catenin信號通路，從而抑制肺癌細胞的侵襲性。以上結果表明Qki-5基因在神經系統調節以及肺臟相關疾病的發生發展中發揮一定作用。

有許多研究表明QKI-5 對于多種癌癥的發生發展具有一定影響作用，因此筆者在小鼠肝細胞中過表達QKI-5 后檢測對癌癥相關基因的影響。由圖9 結果可知，QKI-5 過表達后會引起P53和Ccnd1的相對表達量顯著升高，而Bcl2、CerBb2、Rasa1、Cdkn1a、Cdkn1b、Kras未見明顯變化。P53基因是重要的腫瘤抑制因子，可以保護細胞免受癌基因激活、輻射、有絲分裂應激、核糖體應激等一系列生理應激反應[43]。在AML12 細胞中過表達QKI-5 后引起P53基因表達水平升高，說明在正常細胞中QKI-5 的過表達可以激活P53的水平升高，從而可以產生一定的抑癌作用。細胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）由位于11號染色體第一區3號帶（11q13）的Ccnd1基因編碼，是一種調控細胞周期的蛋白，在細胞周期G1/S轉變中發揮重要作用[44]，能夠造成細胞增殖甚至惡性增長，具有腫瘤因子的性質。有研究結果表明，在口腔鱗狀細胞癌中，QKI-5的低表達可增加Ccnd1的表達，從而促進口腔鱗狀細胞增殖。而在AML12細胞中過表達QKI-5 后，Ccnd1的mRNA 水平升高，說明在正常細胞中過表達QKI-5 不能抑制Ccnd1的表達，反而會造成Ccnd1的水平升高，通過該結果推測QKI-5 在正常細胞中不能通過抑制Ccnd1發揮抑癌作用，推測QKI-5 主要通過Ccnd1mRNA 抑制癌細胞的增殖而發揮抑癌作用，對正常細胞沒有抑癌作用。通過P53和Ccnd1基因表達結果，可推測對于癌癥疾病QKI-5可能在正常細胞中通過激活P53的表達而具有預防作用，而在正常細胞中QKI-5并不通過Ccnd1產生抑癌作用。

本研究成功構建了小鼠Qki-5基因真核表達載體，并通過生物信息學分析預測了其蛋白功能。獲得了不同組織的表達譜，Qki-5基因在小鼠體內表達，且不同組織間表達量有明顯差異，在全腦、肺臟中表達量較高。在小鼠肝臟中，QKI-5表達分布于肝細胞中，且主要定位于細胞核內。在AML12細胞中，QKI-5的過表達引起P53和Ccnd1的水平升高，提示QKI-5在正常細胞中可通過激活P53而發揮抑癌作用，在正常細胞中QKI-5并不通過Ccnd1產生抑癌作用。本研究結果提示QKI-5可能參與調控神經系統、心臟疾病等生理、病理過程，并證明QKI-5對于小鼠AML12細胞中癌癥相關基因的表達具有一定影響。

致謝：國家衛生健康委員會時間生物學重點實驗室2022 年度開放基金（NHCC-2022-01）同時對本研究給予了資助，謹致謝意！