干預腎素-血管緊張素-醛固酮系統不同環節對肝纖維化大鼠腫瘤壞死因子-α的影響

焦占江 周杰

【摘 要】目的 探究干預RAAS系統的不同環節對大鼠肝組織中腫瘤壞死因子-α的影響。方法 選取50只SD大鼠，隨機分為對照組、模型組以及3個治療組（卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組），每組10只。對照組腹壁皮下注射橄欖油，其余組別的大鼠給予40% CCL4腹壁皮下注射；第2天開始，3個治療組分別給予卡托普利60 mg/kg、氯沙坦10 mg/kg、螺內酯100 mg/kg治療，模型組與對照組給予等量的生理鹽水，1次/d，第8周處死，取材后，通過Real Time-PCR檢測大鼠肝組織腫瘤壞死因子-αmRNA表達；病理染色，觀察大鼠肝組織的病理學改變。結果 3個治療組的肝纖維面積比較，差異有統計學意義（P<0.05）；3個治療組大鼠的肝纖維面積與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；對照組、3個治療組的大鼠肝纖維面積均低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）；3個治療組肝組織中TNF-α mRNA的表達比較，差異無統計學意義（P>0.05）；3個治療組肝臟組織中TNF-α mRNA的表達低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）；模型組、3個治療組肝臟組織TNF-α mRNA的表達高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 干預RAAS系統不同環節均可抑制肝纖維化形成，可能與抑制腫瘤壞死因子-α的表達有關。

【關鍵詞】RAAS系統；肝纖維化；腫瘤壞死因子-α

中圖分類號：R575 文獻標識碼：A 文章編號：1004-4949（2023）05-0028-04

Expression of Tumour Necrosis Factor-α in Hepatic Fibrosis of Rats After Local Blockage of Renin-angiptensin-aldosterone System at Different Links

JIAO Zhan-jiang1， ZHOU Jie2

（1.Department of General Surgery， the Second Peoples Hospital of Liaocheng， Liaocheng 252000， Shandong， China； 2.Department of Hepatobiliary Surgery， the Southern Hospital， the Southern Medical College， Guangzhou 510515， Guangdong， China）

【Abstract】Objective To observe the effects on the expression of tumour necrosis factor-α in hepatic fibrosis of rats after intervention of the renin-angiotensin-aldosterone system at different links. Methods Fifty SD rats were randomly divided into control group， model group and three treatment groups （captopril group， losartan group and spironolactone group）， with 10 rats in each group. The rats in the control group were subcutaneously injected with olive oil， and the rats in the other groups were subcutaneously injected with 40% CCL4. From the second day， the three treatment groups were treated with captopril 60 mg/kg， losartan 10 mg/kg and spironolactone 100 mg/kg， respectively， and the model group and the control group were given the same amount of normal saline， once a day. The rats were sacrificed at the 8th week， and the expression of tumor necrosis factor-α mRNA in rat liver tissue was detected by RealTime-PCR. Pathological staining was used to observe the pathological changes of rat liver tissue. Results There was significant difference in liver fiber area among the three treatment groups （P<0.05）. There were significant differences in liver fiber area between the three treatment groups and the model group （P<0.05）. The liver fiber area of rats in the control group and the three treatment groups was lower than that in the model group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in the expression of TNF-α mRNA in liver tissue among the three treatment groups （P>0.05）. The expression of TNF-α mRNA in liver tissue of the three treatment groups was lower than that of the model group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The expression of TNF-α mRNA in the liver tissue of the model group and the three treatment groups was higher than that of the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Intervention in different links of RAAS system can inhibit the formation of hepatic fibrosis， which may be related to the inhibition of tumor necrosis factor-α expression.

【Key words】Renin-angiotensin-aldosterone system； Hepatic fibrosis； Tumour necrosis factor-α

臨床中自身免疫性疾病、脂肪肝、病毒感染、過度飲酒等因素均可導致肝纖維化的發生。肝纖維化（hepatic fibrosis）是人體肝臟對各種慢性損傷的病理性修復反應，其能夠進一步導致纖維結締組織異常增生，肝纖維化處于早期時，是可以逆轉的，但是如果在肝纖維化早期時未及時加以阻斷，會進一步發展可引起肝小葉結構紊亂，肝細胞結節性再生，發展為肝硬化，這時候的病理改變不可逆，會嚴重危害到患者的生命安全[1，2]。TNF-α在肝纖維化的發生、發展中起著重要的作用[3]。RAAS為一內分泌系統，具有廣泛的生物學效應。肝纖維化的發展與RAAS系統密切相關[4-6]。盡管RAAS系統在肝病中的機制還沒有完全闡明，但這提示RAAS可能為抗肝纖維化治療的潛在靶點?；诖?，本研究通過干預RAAS不同環節對大鼠肝纖維化腫瘤壞死因子-α的影響，旨在為抗肝纖維化的治療提供一定的實驗依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取6周SD大鼠50只，體重180～220 g，購買于福建醫科大學動物實驗中心，動物合格證編號為：SCXK（閩）2012-0001，常溫常濕環境飼養。二抗購自Cellsignaling公司，TNF-α抗體、β-actin抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1動物的分組、模型的制備及用藥 50只大鼠按隨機區組設計分為模型組、對照組以及3個治療組，各10只。對照組大鼠皮下注射橄欖油，3 ml/kg；其余大鼠在腹壁皮下注射40%CCl4，3 ml/kg，首劑量要加倍，建立大鼠肝纖維化模型，每3 d注射1次；第2天起，3個治療組開始用藥，分別予以螺內酯100 mg/kg、氯沙坦10 mg/kg、卡托普利60 mg/kg，用10 ml的生理鹽水稀釋后灌胃；對照組和模型組給予10 ml生理鹽水1次/d灌胃，在第8周時，處死所有大鼠，取材備測。

1.3 觀察指標 ①一般情況：比如飲食、活動、體重、精神等；②大鼠肝組織病理學觀察：大鼠的肝組織固定，包埋，切片，進行HE染色和Masson染色；大鼠肝組織Masson染色后，每張病理切片選擇肝臟組織四周及中央區域，并選取膠原纖維含量最多的視野，用計算機圖像分析系統，記錄著色的面積和總面積，在100倍鏡下測定肝臟組織膠原纖維面積百分比，計算方法為：膠原纖維面積/肝組織面積×100%；采用肝纖維化半定量計分系統（semi-quantitative scoring，SSS）進行評分。

1.4 Realtime PCR的檢測 100 mg肝組織標本，用TRIzol法抽提組織總RNA。將總RNA進行逆轉錄獲得cDNA。引物由Invitrogen公司合成。序列是：TNF-α（148 bp）上游：5CTGGCCAATGGCATGGATCTCAAA3；下游：5ATGAAATGGCAAATCGGCTGACGG3；Real-Time PCR反應：根據引物序列設置擴增程序，94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s、72 ℃ 10 min；共40個循環。在200 μl的滅菌離心管中加入（25 μl反應體系）：模板cDNA 0.5 μl ；上游引物0.5 μl；下游引物0.5 μl；SYBR green supermix，12.5 μl；去離子水11 μl，將離心管放入PCR擴增儀，按擴增程序進行PCR擴增；數據采用儀器ABI Prism 7300 SDS Software的軟件分析，基因的表達量用2-△△Ct法計算。

1.5 統計學方法 采用SPSS 11.0統計軟件進行數據分析，計量資料以（x-±s）表示，組間比較行F檢驗；計數資料以[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗；以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀態觀察 各組大鼠均無死亡，模型組的大鼠精神不振，活動減少，對外界的反應變遲鈍，進食和飲水變的減少，大鼠體重下降明顯；對照組各項活動均正常，體重增加；3個治療組的大鼠精神、活動、反應、飲食、體重與模型組比較，均比較好。

2.2 各組肝組織病理變化比較 肝組織Masson染色，對照組大鼠肝組織中，可以看到膠原纖維只是在血管周圍有少量的表達，模型組大鼠肝組織中纖維有明顯的增生，形成了纖維間隔，有的區域形成了假小葉；3個治療組大鼠肝組織中膠原纖維減少，纖維間隔以及假小葉減少。HE染色見對照組大鼠的肝組織中，肝細胞以肝臟的中央靜脈為中心，向四周呈放射狀排列，且肝臟組織結構完整；模型組大鼠肝組織中，肝細胞排列紊亂，有的肝細胞甚至呈脂肪變性，匯管區增大，在部分肝組織中，匯管區和肝小葉內還能夠見到浸潤的淋巴細胞，甚至可以見到肝臟組織中有假小葉；3個治療組大鼠肝組織中可以見到肝細胞壞死減少，空泡變性減少。

2.3 各組大鼠肝纖維化半定量評分比較 3個治療組大鼠肝纖維化評分低于模型組（P =0.000、0.000、0.000）；3個治療組間大鼠肝纖維化評分相比，差異無統計學意義（P=1.000、0.980）；對照組、3個治療組大鼠肝纖維化評分低于模型組（P=0.000、0.000、0.000），見表1。

2.4 各組大鼠肝纖維面積比較 3個治療組的肝纖維面積比較，差異無統計學意義（P =0.779、0.422）；對照組、3個治療組肝纖維面積均低于模型組（P=0.000），見表2。

2.5 各組大鼠肝臟TNF-α表達情況比較 RealtimePCR結果分析顯示，3個治療組間TNF-αmRNA的表達比較，差異無統計學意義（P=0.663、0.082）；3個治療組TNF-αmRNA表達均低于模型組（P=0.000）；模型組、3個治療組TNF-αmRNA的表達高于對照組（P=0.000），見表3。

3 討論

肝纖維化是人體肝臟組織對損傷的愈合修復反應[7]。研究表明[10]，各種各樣的因素導致慢性肝病在發展過程伴有肝纖維化的發生，肝纖維化早期的時候如不能得到有效控制，可能會發展為肝硬化，肝癌[8，9]。研究表明[11，12]，大部分肝纖維化患者治療后肝纖維化可逆轉至正常。肝臟纖維化是肝臟中的細胞外基質增生和降解平衡被打破，從而造成肝臟內纖維結締組織異常沉積、肝臟結構和功能改變的結果。以往認為RAAS是人體一個內分泌系統，近年來研究發現[13]，它與肝纖維化的形成有密切關系，它的激活是肝纖維化形成的重要病理機制。TNF-α是一種與內毒素無關的、可引起腫瘤出血壞死的活性分子。TNF-α在肝纖維化的產生及發展中起著重要的作用，研究發現[14]，TNF-α刺激肝臟星狀細胞后，可讓它的形態學和功能學發生相關的改變，可讓它轉化為成為纖維細胞，儲脂能力喪失，并且表達α-平滑肌肌動蛋白，隨著時間的延長，其激活效應反而增加。在正常情況下，肝組織中不表達或微量表達TNF-α，當受到損傷因素刺激時，大量的TNF-α被釋放出來，參與肝損傷過程，促進肝纖維化的發生、發展[15]。研究表明[16]，肝組織局部炎癥反應時，TNF-α等炎癥因子大量釋放，促進肝星狀細胞的增殖、分化，使HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN等細胞外基質合成增多，間接引起纖維化形成。有研究表明[17]，有一部分中藥提取物，可能有抗肝纖維化作用，其作用機制可能與降低血清中TNF-α等細胞因子水平有關。

本研究結果顯示，采用Real time PCR對大鼠的肝臟組織TNF-αmRNA進行了檢測，發現3個治療組大鼠肝組織中TNF-αmRNA的表達情況比較，差異無統計學意義（P均>0.05）；3個治療組大鼠肝組織中的TNF-αmRNA表達卻低于模型組，差異有顯著意義（P<0.01）；模型組、3個治療組大鼠肝組織中的TNF-αmRNA表達高于對照組，差異有顯著意義（P<0.01），說明干預于RAAS的不同環節均能夠減弱大鼠肝纖維化中TNF-αmRNA的表達。

此外，本研究通過CCL4建立的大鼠肝纖維化模型，病理學結果顯示，3個治療組大鼠較模型組大鼠的肝纖維化程度減輕，提示干預RAAS不同環節對大鼠肝纖維化具有比較好的抑制作用。Realtime PCR結果顯示，模型組大鼠肝臟組織TNF-α的表達增強，但3個治療組肝臟組織TNF-α的表達減弱。

綜上所述，干預RAAS不同的環節對大鼠肝纖維化的作用機制可能和TNF-α的表達減弱有關系。

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編輯 柴泛宇