殺植物線蟲的Bt菌Cry蛋白研究進展

張麗婧， 林明賢， 顏培玉， 李欣欣， 張譯丹， 張 雪， 符安蕓， 宋靖雯， 張文飛

（熱帶動植物生態學省部共建教育部重點實驗室/海南師范大學 生命科學學院， 海南 ?？?571158）

線蟲（Nematodes）隸屬線蟲動物門（Nemathelminthes）線蟲綱（Nematoda），是一類兩側對稱假體腔無脊椎動物，種類繁多，數量豐富，分布廣泛。線蟲除了游離生活，還可進行寄生生存[1]。寄生于植物的線蟲叫作植物寄生線蟲（Plant parasitic nematode）[2]，蘚類、蕨類、藻類、裸子植物和被子植物中都發現了寄生線蟲。線蟲在植物體各個部位都可寄生，吸取寄主養分用于自身生長繁殖，對寄主造成傷害，也會導致外界病原如病毒、真菌、細菌的入侵，加重寄主植物的病害[3]。美國一項研究機構調查顯示，全球農林作物損失中，由寄生線蟲危害導致的損失高達800多億美元，其中破壞程度最為嚴重的是根結線蟲和囊腫線蟲，嚴重影響全球糧食作物產量與品質[4]。中國是傳統農業大國，幅員遼闊，大多數地區屬于溫帶氣候，線蟲的防控形勢非常嚴峻。資料顯示，在中國，寄生線蟲達400多種，近百種作物受到侵害，防治線蟲病害工作耗費了大量的人力和物力。

總體來說，防治植物寄生線蟲的方法主要為物理防治、化學防治和生物防治[5]。物理防治的操作空間有限，效果不明顯，易反復發作，防治不徹底?；瘜W防治主要是使用鹵代烴、有機磷等類型的農藥，采用浸苗、毒土和灌根等方式毒殺線蟲，其效果顯著卻存在諸多隱患，如長期使用會導致生態平衡被破壞，殘留的農藥很容易造成水和土壤的污染，并導致動物和人中毒。線蟲的生物防治是利用某些微生物或者植物所產生的殺線蟲代謝物及殺線蟲的細菌、病毒、立克氏體、放線菌、捕食性線蟲、渦蟲和原生動物等線蟲的自然天敵殺滅線蟲，可有效控制線蟲對作物的危害[6-7]。

目前，中國倡導的線蟲病害防治措施是以整體預防為主，綜合多種方法進行防治。物理和化學方法防治線蟲，都存在諸多缺點且不符合現代農業發展的需求。近年來，生物防治由于符合綠色農業可持續發展戰略需求，受到越來越多的關注。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種對生態環境友好、應用十分廣泛的生防細菌，其孢子形成過程中可產生Cry和Cyt毒素蛋白，營養期可產生Vip和Sip蛋白等多種毒素因子，其殺蟲譜廣泛，涉及鱗翅目、雙翅目、鞘翅目和直翅目等多個目的昆蟲。近年來，研究人員發現Bt菌對線形動物門中某些線蟲種屬具有活性[8]，其中Bt菌產生的抗線蟲Cry毒素最為引人注目。利用分子生物技術將這些抗線蟲Cry毒素基因導入作物的基因組，培育抗線蟲作物，將成為未來一種最直接、高效、經濟和環保的植物寄生線蟲防治途徑。

1 殺植物線蟲Bt菌株的發現

Bt菌是芽孢桿菌屬（Bacillus）的一員，芽孢桿菌科成員還包括為人熟知的炭疽芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等。Bt菌是一種革蘭氏陽性細菌，以蘇云金亞種、以色列亞種、庫斯塔克亞種及莫里斯亞種等為主，其芽孢期和生長期可分別產生伴孢晶體蛋白、營養期殺蟲蛋白，對昆蟲、線蟲、原生動物甚至人類的某些癌細胞具有特殊毒性。1961年，Ciordia等學者[9]首先報道Bt菌株具有毒殺線蟲活性，據研究，Bt菌能殺死牛腸道寄生線蟲（Trichostronglus colubriformis）的卵及幼蟲。1972年Prasad等[10]發現Bt菌產生的蘇云金素（β-外毒素）對植物寄生線蟲有活性。而國內鮮見Bt菌在線蟲體內功能的研究報道。

2 殺植物線蟲的晶體蛋白

Bt菌產生的毒素蛋白包括營養期殺蟲蛋白（vegetative insecticidal proteins, VIPs）和晶體蛋白（包括Cry和Cyt蛋白，前者居多）[11]。Bt菌還產生許多具殺蟲活性的酶類，如金屬蛋白酶Bmp1（metalloproteinase）、膠原蛋白酶ColB（collagenase）和幾丁質酶（chitinase）等。1987年Bone等[12]和崔哲雨等[13]報道Bt菌以色列亞種和庫斯塔克亞種晶體蛋白能殺死蛇形毛圓線蟲（Trichostronglus colubriformis）的幼蟲和卵，其半致死量（LC50）為2.7 mg/L，這是Bt晶體蛋白在線蟲體內顯示毒殺活性的第一個報告。目前國內外學者已經從昆蟲、蜘蛛及某些細菌體內分離出一些與晶體蛋白相似的蛋白質。1988年Osman等[14]報道了Bt伴胞晶體蛋白毒殺植物寄生線蟲的方法。1998年Vos等[15]發現番茄中存在的Mi-1基因對根結線蟲具有抗性，2003年Wei等[16]證明大鼠腸道線蟲對一些殺線蟲晶體蛋白敏感，說明在自然界中存在著一些能抑制線蟲生長、繁殖及誘導線蟲產生抗藥性的物質。美國Mycogen公司研究者發現，Bt伴孢晶體蛋白在10余個屬的植物寄生線蟲中表現出活性，同時確定了Cry蛋白的主要毒性組分的分子量是45～65 kD和65～155 kD，有廣闊的應用前景[15]。迄今已報道的殺線蟲蛋白基因有cry1、cry5、cry6、cry12、cry13、cry14、cry21和cry55等[17]。對這些基因編碼蛋白進行分子聚類分析后發現，這些殺線蟲Cry蛋白主要包括Cry5亞家族和Cry6亞家族[18]，這兩個亞家族都是由原本屬于一個保守結構域的蛋白質組成，其中，Cry5 亞家族包括Cry5Aa 和同源性大于45%的Cry5Ab、Cry5Ac、Cry5B，以及同源性小于45%的Cry12A、Cry13A、Cry14A、Cry21A，共6種蛋白[19]。

2.1 典型的3D-Cry蛋白

大部分Bt菌的Cry蛋白活性區域由3個結構域（three-domains，3D）組成，稱為3D-Cry蛋白，同時包含有保守的短氨基酸序列（block）[11]。3D-Cry 蛋白主要參與毒性肽的合成。毒性肽的N-端是由7 個疏水的α-螺旋形成的Domain Ⅰ，負責插入和空隙形成；Domain Ⅱ是3個反向平行的β-折疊結構，不同毒素氨基酸序列差異顯著；Domain Ⅲ位于毒性肽的C-端，是緊裹在一起的β-三明治結構，可以提高毒素分子的結構穩定性，防止毒素蛋白被水解，并可以促進靶膜通透性[20]。通過X射線衍射方法已測出Cry1Aa、Cry3A等一些晶體蛋白的結構。由他們的結構特征可以推測Domain Ⅰ關系到昆蟲中腸細胞離子孔道的形成，Domain Ⅱ關系到毒素蛋白與昆蟲中腸細胞受體結合，Domain Ⅲ可能與晶體形成和毒素穩定性有關。富含β-折疊的Domain Ⅱ和Domain Ⅲ決定了Cry蛋白與昆蟲細胞受體的結合[21]。不同的晶體蛋白可針對靶標害蟲引發特異的殺蟲活性，其活性的高低依賴于蛋白晶體的結構。關于不同蛋白晶體結構相對應的三維結構，目前還沒有一個明確的研究定論，還需進一步研究。

2.1.1 Cry5毒素

Cry5 毒素表現出Cry 蛋白的保守性，作為一種殺線蟲3D-Cry 蛋白被廣泛研究。Cry5B 和Cry1Ab 具有24%同源性，晶體蛋白（約570個氨基酸）3個結構域中相似性為44%。Cry5伴胞晶體蛋白通常具有5個保守序列區，趙新民等[22]發現Cry5Aa具有典型的3D結構域特征，Domain Ⅰ的α-螺旋一段插入序列結構有獨特性，Cry5Aa Domain Ⅰ的α2螺旋一段插入序列表面具有較高的正電勢且包含特殊的四脯氨酸結構，該插入序列具有較大的柔韌性，其運動與其他氨基酸殘基的相關性較小。此外，分別位于Domain Ⅰ、Domain Ⅱ和Domain Ⅲ的殘基123、殘基397和殘基567及其鄰近部位也具有較大的柔韌性，這為了解Cry5Aa對線蟲的毒殺作用機制提供了條件。

Cry5B是Kostichka等[23]首次從Bt菌AB88培養液上清液中分離獲得的，該蛋白是一種輸出蛋白質，在Bt菌穩定期表達產生。與Cry1Ab 相似，Cry5B 殺蟲晶體蛋白含有3 個功能域，但Cry5B 中比較特殊的區域是Domain Ⅱ，其結構類似于香蕉凝集素（lectin），這個結構決定了Cry5B 的殺蟲特異性。雷夢英等[24]改造了cry5Ba3基因并成功構建其表達質粒，通過農桿菌介導法將cryBa3基因整合到番茄灰霉病菌基因組中，利用生物測定法測定了cry5Ba3轉化體對松材線蟲的毒力。

2.1.2 Cry14毒素

Baghaee等[25]發現Bt菌Cry14毒素對爪哇根結線蟲（Meloidogyne javanica）具有殺蟲活性，鑒定出2株含有cry14基因的Bt 菌T oIr65和T oIr67對爪哇曲線蟲孵化的幼蟲和卵具有殺線蟲活性。菌株T oIr65和T oIr67具有雙錐體和立方體伴胞晶體。在實驗室和盆栽條件下，對細菌懸浮液（BS）、孢子和晶體混合物（SCM）2種形式的細菌分離物進行了測試，以評估其對爪哇曲線蟲的作用效果，結果表明T oIr65和T oIr67的伴胞晶體蛋白具有70%的體外殺線蟲活性。盆栽試驗中，T oIr65和T oIr67均較對照顯著降低了番茄植株的蟲癭數，并提高了植株的生長參數。據報道，Bt 菌株KAU 50 含有Cry6、Cry16、Cry20，Bt 菌株KAU 424 含有Cry1 和Cry14。KAU 424的Cry 14蛋白具有殺線蟲的特性，Cry 1蛋白對鱗翅目昆蟲有毒性。因此，這種特殊的Bt菌株的殺線蟲特性可能歸因于Cry 14蛋白。然而，迄今為止尚未見KAU 50基因表達產物具有殺線蟲特性的報道。值得注意的是，在自然界不同的Bt菌株中可能存在較新的殺線蟲蛋白，必須進行進一步的蛋白質分析、分離和鑒定，以確定特定Bt菌株具有殺線蟲特性的蛋白質[26]。

2.1.3 Cry21毒素

Sato 等[27]從Bt 菌克隆了一個編碼新型晶體蛋白Cry2lBal 的基因，cry21Ba1的開放閱讀框（ORF）大小為3 858 bp，基因起始密碼子上游具有特定的啟動子序列，終止密碼子下游同時具有反向重復序列。Cry2lBal蛋白由1 286個氨基酸編碼而成，其氨基酸序列與已知的殺線蟲蛋白Cry2lAal的氨基酸序列同源性為67%。Cry2lBal原蛋白由3個結構域和1個原蛋白特異性C末端延伸組成，原毒素的C端延伸可以被線蟲腸中的蛋白酶準確消化。Cry2lBal與Cry2lAal在由結構域II和結構域III組成的區域中氨基酸序列存在顯著不同，表明這些Cry蛋白在受體識別和結合特性上存在差異。

2004 年，Iatsenko 等[28]發現Bt 菌DB27 產生的2 種新的原毒素Cry21Fa1 和Cry21Ha1 對線蟲具有協同作用，并發現Bt菌DB27通過腸道損傷殺死了一些自由生活和動物寄生線蟲。Cry21Fa1和Cry21Ha1對秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）的50%致死濃度(LC50)分別為13.6 μg/mL 和23.9 μg/mL，與Cry5B的殺線蟲活性相當。同時，Cry21Ha1與Cry21Ba1兩種原毒素表現出協同作用，其協同因子數值為1.8 ～ 2.5，表明自然分離新菌株和新型毒素資源非常重要。

2.1.4 Cry1E毒素

Bt菌BRC-XQ2含有4種cry1類基因（cry1Aa、cry1Cb、cry1Ea和cry1Ia），其伴胞晶體和芽孢混合物對松材線蟲表現出明顯殺蟲活性，50%致死濃度（LC50）為32.13 μg/mL。Huang 等[29]在大腸桿菌中成功表達了來自BRC-XQ2的cry1Ea11基因（ORF為3 516 bp），在24 h和48 h測定的純化Cry1Ea11毒素表達蛋白的LC50分別為32.53 μg/mL和23.23 μg/mL。與此同時，用NHS羅丹明標記的GST-Cry1Ea11飼喂松材線蟲，能夠檢測到GST-Cry 1Ea11通過管心針進入松材線蟲體內，因此，Cry1Ea毒素極有可能是抗線蟲的關鍵活性成分，是首次證明鱗翅目活性的Cry1蛋白對植物寄生線蟲有活性。Cry1Ea11是一種高活性的殺線蟲蛋白，可用于控制松材線蟲引起的松材線蟲病，顯著拓寬了Cry1蛋白的殺蟲譜。

2017年Chen等[30]發現長期種植表達cry1Ab/1Ac基因的Bt水稻可以減少稻田中植物寄生線蟲的數量，但對其他線蟲參數（線蟲總數、游離線蟲豐度和相對豐度、屬豐富度、多樣性指數、土壤食物網條件和群落組成）沒有影響。但研究發現，這些變量具有明顯的季節和年際變化，表明環境因素的影響大于Bt 毒素的影響。綜上所述，Bt水稻在土壤健康和可持續性發展方面存在潛在生態風險，值得進一步研究，以探究各種混雜環境因素的影響[31]。

2.2 非典型3D-Cry蛋白

2.2.1 Cry6毒素

Cry6不具有Cry蛋白典型的三維結構，屬于α-螺旋類穿孔毒素，與大腸桿菌中的溶血素 E及蠟樣芽孢桿菌中的溶血素HblB和非溶血素NHEA相似[11]。Cry6亞家族包括具有約50% 同源性的Cry6A和Cry6B，但他們與Bt菌中其他Cry蛋白的同源性較低，沒有共同的5個保守序列區域[16]，Wei等[16]發現Cry6A蛋白含有一個由31～1 146個氨基酸殘基構成的毒力活性中心區域。賈永強等[32]對Cry6A進行了毒殺秀麗線蟲的生物活性測定，結果發現帶有空載體的大腸桿菌JM103平板（對照）上的線蟲在3 d后都沒有死亡，而Cry6A的試驗平板上的線蟲有不同程度的死亡，其50%致死濃度為37.33 ng/cm2，表明Cry6A具有較強殺線蟲活性 。但是迄今為止，尚未有任何介紹Cry6B具有殺線蟲活性的研究報道。

2.2.2 Cry65毒素

2011 年，吳寒[33]從菌株Sbt003 中克隆得到新殺蟲蛋白基因cry65Aal，其編碼的蛋白與Cry41Aa1 有28%的相似性，而Cry41Aa1 是一類parasporin-like 蛋白，為非典型3D-Cry 蛋白。Cry65Aal 蛋白對秀麗隱桿線蟲并沒有表現出明顯毒性。但吳寒所在實驗室鑒定克隆的一個與Cry65Aa1 相似性為30%左右的Cry65-like蛋白卻表現出對線蟲的明顯活性。cry65Aa1基因操縱子包含一個下游基因，編碼一個輔助蛋白，研究發現ORF1 是Cry65Aa1 表達和結晶所必需的，其功能是Cry65Aa1 的C 端結晶結構域。ORF1 由512 個氨基酸組成，被預測為分子量為58 kDa的蛋白質，與對線蟲有毒性的Cy21Bal的C端半段有98%的相似性。

3 Cry蛋白的殺線蟲機制

目前，對Cry蛋白殺線蟲機制的研究還不是很深入，主要包括穿孔模型和細胞壞死途徑。

3.1 穿孔模型

穿孔模型是一種被廣泛接受的3D-Cry 蛋白殺蟲模型，其在昆蟲體內的作用機理較為明確。3D-Cry 蛋白經昆蟲吞食后進入腸道，在堿性條件下蛋白溶解為可溶性原毒素，然后昆蟲腸道中的一些酶對原毒素N端與C端的非毒性區域進行切割，使毒素蛋白激活?；罨亩舅氐鞍紫扰c位于昆蟲中腸柱狀上皮細胞（BBMV）上的膜受體APN或ALP以較低的親和力結合，繼而在細胞膜上富集毒素形成寡聚體誘導毒素蛋白空間構象發生改變。毒素蛋白空間結構的變化使其可在脂筏處插入細胞膜，孔洞由此形成?？锥吹某霈F破壞了細胞膜的完整性，引發細胞滲透失衡，從而使中腸細胞發生膨脹和裂解，最終導致腸道裂解，蟲體因感染致死[11]。

研究發現，秀麗隱桿線蟲細胞膜上的糖脂為Cry5B的功能受體，是介導Cry5B殺蟲活性的重要部位。石建偉[11]對Cry5B 的進一步研究表明，Cry5B 可引起靶向線蟲的細胞內病理變化，線粒體對Cry5B 敏感，是Cry5B 的重要細胞內靶點。GPI 錨定蛋白RBT-1 是Cry6A 的功能性受體，位于秀麗隱桿線蟲腸細胞膜脂筏中，具有N端信號肽和糖基化位點，rbt-1的缺失會引起線蟲對Cry6A的抗性。經典的穿孔模型仍然是被廣泛接受的3D-Cry的作用模式，但是關于經典穿孔模型細胞機制研究的信息卻很少。

3.2 細胞壞死途徑

Zhang等[34]研究了晶體蛋白Cry6Aa對秀麗隱桿線蟲的活性作用，發現了壞死通路中的一個關鍵缺陷部位，該壞死通路的缺陷賦予了Cry6Aa毒素的耐受性。另外，Cry5Ba的氨基酸序列與Cry6Aa的氨基酸序列不同，在線蟲內誘發細胞壞死的是Cry6Aa而不是Cry5Ba。并且，Cry6Aa誘導的壞死途徑需要天冬氨酸蛋白酶（ASP-1）。此外，ASP-1對Cry6Aa的抗性也有一定的抑制作用，首次證實失去壞死通路可對Bt晶體蛋白產生耐受性，Cry6A激活了線蟲的壞死通道，這是一種針對線蟲新的壞死類型。

另外，Cry5Ba在非宿主環境中是沉默的，這種表型取決于sRNABtsR1對Cry5Ba的負調節。沉默的毒素基因可以掩飾Bt菌的毒性，從而騙過線蟲對Bt菌的拒絕，使Bt菌更容易成為線蟲的食物。當Bt菌被寄主吞噬后，沉默的性能就會消失，Cry5Ba的大量表達和快速殺滅進一步獲得了Bt菌的生存優勢。

4 展望

Bt菌被長期廣泛應用于防治各類農業害蟲，獲得了很好的安全口碑。目前歐美等國及跨國生物公司投入大量的人力物力分離Bt菌的抗線蟲毒素蛋白序列，然后將序列編入作物的基因組中，以培育抗線蟲的轉基因植物。國內外學者在Bt晶體蛋白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等特殊毒殺作用的研究較為深入，但Bt菌對線蟲活性的研究卻相對較少，尤其是國內尚無成熟的實例。

目前非典型3D-Cry 蛋白（如Cry6亞家族）對線蟲活性的研究仍有較大空白，而實驗室內已發現對典型3D-Cry蛋白（如Cry5B）產生抗性的線蟲。因此，發掘具有殺線蟲活性的Cry6類毒素可為解決線蟲抗性問題提供有效途徑。開發殺線蟲基因、構建殺線蟲工程菌株、培育轉基因抗線蟲新品種，是當前農業可持續發展的最直接、最有效、最具前景的技術手段。