中醫藥干預葡萄糖調節蛋白78（GRP78）表達在糖尿病周圍神經細胞凋亡的實驗研究進展

代金玲，金 珠，李 雯

糖尿病周圍神經病變是威脅糖尿病患者健康的重要隱患。在多民族成人2 型糖尿病的一項INTERPRET-DD 研究中，該病的總體患病率為26.71%［1］；據統計，2017 年世界范圍內糖尿病患者大約有4.51 億， 預計到2045 年被確診患有糖尿病的人將增長到6.93 億［2］?；颊叱霈F手足部麻木、痛覺過敏、或對稱性燒灼感等與周圍神經功能障礙相關的臨床表現，甚至雙足潰爛，最終可能導致截肢，這將大大降低患者的后期生存質量［3-4］。研究表明，在糖尿病大鼠神經細胞凋亡被抑制的狀態下，其坐骨神經的形態學損傷會明顯減輕，傳導速度也會得到提高［5］。在應用中醫、中藥治療糖尿病周圍神經病變的相關研究中，葡萄糖調節蛋白78（Glucose-Regulated Protein 78，GRP78）被作為觀測細胞凋亡的“指南針”。

GRP78 是重要的熱休克蛋白70 伴侶蛋白， 主要存在于內質網膜上，幫助多肽鏈正確折疊，防止不正確折疊的蛋白聚集［6］。在人類9 號染色體上，4532 個核苷酸編碼654 個氨基酸，組成GRP78。它是一種水溶性蛋白質，其中的小塊疏水性片段對于識別未折疊蛋白質，并將這些蛋白定向降解或重新折疊至關重要［7］。參與蛋白質的合成、折疊和轉運，以及減緩內質網應激過程中蛋白質折疊負荷、維持細胞正常生理功能，是GRP78 的兩個主要功能［8］。這主要依靠位于氨基末端的ATP 結合結構域（ATP binding domain，ABD）和位于羧基末端的底物結合結構域（substrate binding domain，SBD）來完成［9］?，F代研究表明，GRP78 純合敲除的小鼠在胚胎發育第3.5 天表現出嚴重的增殖缺陷，GRP78 幫助蛋白正確合成，維持細胞內環境穩態，保障細胞正常生理功能［10］。中醫藥可以通過調節GRP78 的表達水平， 影響線粒體和內質網途徑下游與凋亡相關因子的表達， 緩解糖尿病周圍神經細胞凋亡（圖1）［11］。

圖1 GRP78 結構功能域示意圖

1 中醫藥干預GRP78 表達調節線粒體途徑誘導的糖尿病周圍神經細胞凋亡

機體內大多數細胞凋亡皆是由線粒體控制，因此線粒體被喻為細胞凋亡的控制中心。高血糖造成線粒體膜電位降低或者消失，膜電位的下降意味著膜的膜通透性變強，這時膜內的細胞色素-C、Ca2+等促凋亡因子趁機流入到細胞質中，大量的促凋亡因子活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）；在Caspase-3 被激活后，它可以引起后續一系列與細胞凋亡相關的Caspase 級聯反應，這些反應迫使DNA 斷裂，最終致使細胞死亡［12-14］。GRP78 既可以穩定線粒體膜的通透性減少細胞凋亡，亦可以起到相反的作用增加細胞凋亡，通過中醫藥治療手段調節GRP78 的表達水平， 可以有效改善糖尿病周圍神經病變導致的細胞凋亡。

1.1 穩定線粒體膜的通透性減少細胞凋亡 GRP78 可以使線粒體膜的通透性恢復穩定， 抑制細胞色素-C 流入到細胞質中［15］。Caspase-3 活化的關鍵因子就是細胞色素-C，且在Caspase 級聯反應導致的細胞凋亡中， 許多反應皆是通過激活Caspase-3 實現的，Caspase-3 是Caspase 級聯反應發生的關鍵下游［16］。黃芪甲苷可以下調Caspase-3 的表達，保護線粒體結構和功能， 進而使背根神經節神經元細胞的死亡減少，緩解糖尿病大鼠周圍神經的損傷［17］。已經有研究表明，晚期糖基化終末產物處理可以使大鼠雪旺細胞中GRP78 表達水平明顯下降，Caspase-3 活性明顯增強， 細胞凋亡指數升高，而糖絡寧可以上調GRP78 的表達水平，降低Caspase-3 的表達，減輕坐骨神經病理損傷［18-20］。

1.2 提高線粒體膜的通透性增加細胞凋亡 另外，GRP78亦可以反其道而行之。有研究表明，GRP78 的表達水平的升高可以增加氧自由基產生，提高線粒體膜通透性，促進細胞色素-C、Ca2+釋放以及capase-3 活化并導致細胞凋亡［21］。糖尿病大鼠氧自由基會和不飽和脂肪酸在線粒體膜上發生脂質過氧化反應，引起線粒體膜通透性增大，允許Ca2+通過線粒體膜釋放至細胞漿，引起細胞內鈣超載，激活Caspase 級聯反應，導致DNA 斷裂，引發細胞凋亡［22］。筋脈通能夠顯著降低糖尿病大鼠背根神經節GRP78 的表達， 減少氧自由基的生成，緩解坐骨神經損傷［23-24］。

綜上，通過中醫藥手段干預GRP78 表達水平，可能成為阻斷線粒體途徑誘導Caspase 級聯反應導致糖尿病周圍神經細胞凋亡的新靶點。但因GRP78 對細胞凋亡具有雙向調節作用，所以，在疾病發展的各個階段，其最佳表達水平還有待進一探究。

2 中醫藥干預GRP78 表達調節內質網途徑誘導的糖尿病周圍神經細胞凋亡

當細胞暴露于高糖狀態下時，蛋白將不能正確折疊并且順利的從內質網中釋放，隨著這些不能正確折疊的蛋白在內質網腔中越積越多，將會導致內質網應激的發生。在應激狀態下，內質網會通過未折疊蛋白反應幫助這些不能正確折疊的蛋白恢復正確折疊或者直接把它們降解，未折疊蛋白反應本質上是內質網維持自身穩態的一種手段［25］。但內質網自身恢復的能力是有限的，隨著大量不正確折疊蛋白的長時間積累會導致未折疊蛋白反應失敗， 并通過CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白 （CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP） 通路以及Jun 氨基末端激酶 （Junami noterminal kinases，JNK）通路引起細胞死亡［26］。

當細胞處于內質網應激狀態時，GRP78 與蛋白激酶RNA 樣內質網激酶 （Protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）解離導致CHOP 表達增加，過表達的CHOP 通過增加Caspase-3 的表達誘使細胞發生凋亡［27-28］。研究表明，抑制PERK、CHOP 的表達，降低Caspase-3 的活性，可以顯著降低N2A 神經元細胞凋亡，對抗高葡萄糖誘導的神經毒性［29］。肌醇需要酶1（Inositol-requiring enzyme 1，IRE1）也是內質網膜上的感受器蛋白。在內質網應激條件下，GRP78 與IRE1 解離，IRE1 激活c-Jun 氨基末端激酶 （c-Junami no-terminal kinases，JNK），JNK 活化Caspase 級聯反應，誘導細胞凋亡［30-31］。研究表明，JNK 信號通路參與乙醇醛誘導的背根神經節和ND7/23 神經元細胞的死亡， 并且JNK活性被抑制后，ND7/23 神經元細胞死亡得到顯著改善［32］。

2.1 幫助蛋白質折疊減少細胞凋亡 GRP78 被認為是內質網應激的“信號燈”，在內質網應激條件下，GRP78 表達水平顯著增加［33］。它以自身SBD 中富含賴氨酸的結構域為媒介，與內質網中非正確折疊或尚未折疊的蛋白質結合，通過ABP與ATP 結合， 從ATP 水解中獲得能量幫助穩定蛋白質折疊并防止細胞凋亡［34-35］。草豆蔻有效成分生松素可以通過增加GRP78 蛋白的表達，促進未折疊蛋白折疊，減少內質網應激導致的腦神經元細胞凋亡，三甲基氧是一種化學伴侶，可以促進蛋白質正常折疊，抵消內質網應激，使糖尿病病程12 周大鼠保持正常的感覺神經傳導速度［36-37］。

2.2 抑制感受器蛋白過度激活減少細胞凋亡 在內質網功能正常的情況下，GRP78 是以非活性形式與內質網上的無活性感受器蛋白結合， 所以當GRP78 更多的與感受器蛋白結合時，其表達水平應該是減少的，這與GRP78 為內質網應激的“信號燈”，GRP78 表達水平下降表明細胞內質網應激的程度得到緩解是一致的［9，38］。研究表明， 紅花黃色素能降低GRP78 表達，使高糖狀態下由于內質網應激引起的小鼠足細胞死亡得到緩解［39-40］。另外，在降低高糖狀態下細胞GRP78表達水平緩解細胞凋亡實驗中， 感受器蛋白PERK、IRE1 以及下游與細胞凋亡相關的物質CHOP、JNK、caspase 家族成員的表達水平也會隨之下降［41-43］。因此認為通過降低GRP78表達水平可減少細胞凋亡， 實質上可能是通過促進GRP78與感受器蛋白結合，抑制感受器蛋白過度激活導致下游與細胞凋亡相關物質的產生。因此，通過中醫藥手段增強GRP78與感受器蛋白的結合能力可能是糖尿病周圍神經病變治療的新方向。

2.3 促進GRP78 與caspase-12 結合減少細胞凋亡caspase-12 是caspase 家族的第1 個內質網相關成員， 在內質網應激過程中，caspase-12 被特異性切割活化， 并進一步觸發caspase-3 的活化，從而通過caspase 級聯反應誘使細胞凋亡，當caspase-12 的活性被特異性抑制以后，細胞凋亡顯著減少［44］。一項通過針刺保護糖尿病大鼠周圍神經的研究結果顯示，電針肺俞、脾俞、足三里等穴位減少caspase-12 在糖尿病大鼠坐骨神經中的表達， 亦可以減輕坐骨神經損傷［45］。有研究表明，GRP78 的異位表達可與caspase-7 和caspase-12 形成復合物，抑制caspase-12 介導的細胞死亡，糖絡寧可以上調GRP78 的活性， 從而使在糖尿病周圍神經病變大鼠坐骨神經中檢測到的Caspase-12 的表達顯著降低，減緩高糖狀態下的細胞凋亡（圖2）［46-47］。

圖2 GRP78 調節糖尿病周圍神經細胞凋亡示意圖

3 總結與展望

祖國醫學認為糖尿病周圍神經病變是因消渴日久，氣陰俱損，血脈瘀痹所致，屬本虛標實之證。晉《針灸甲乙經》云：“衛氣不行則為不仁，經曰：營衛不能相將，三焦無所仰，身體痹而不仁?！北砻鳉馓摬蛔阋酝苿友哼\行，三焦氣化不利，水谷精微運行輸布障礙，無以溫養四肢百脈，導致肢體麻木不仁。近代醫家對于糖尿病周圍神經病變的治療也多以益氣養陰，和血化瘀為主［48-49］。由此可見，“虛”是該病發病的內在原因，虛則無以濡養全身，導致氣血不足、血脈瘀阻、皮肉失養而痿痹，這與西醫所講的細胞凋亡不謀而合。通過中藥、針刺、湯劑等方法多途徑、多靶點調節GRP78 表達水平，抑制糖尿病狀態下最為重要的caspase 級聯反應導致的周圍神經細胞凋亡，進而阻止內質網應激導致的細胞死亡，最終影響疾病的預后和轉歸。

糖尿病周圍神經病變起病隱匿，不易發現，一旦出現癥狀或明顯缺陷， 就無法逆轉，10% ~ 18% 的患者在確診為糖尿病時，就被發現有神經病變，這表明神經元損傷發生在疾病的早期階段［50-51］。因此，早期診斷、及時干預是預防糖尿病神經病變發展的重要手段。GRP78 在大鼠血糖持續升高時，最先出現上升趨勢，對糖尿病周圍神經病變的預防和治療皆有重要意義［52-54］。然而，縱觀目前的研究，大部分文獻僅提到通過中醫藥手段干預GRP78 表達水平對細胞凋亡有影響，并未說明其具體作用機制。因此，應進一步探索和研究其中的奧妙，以便更準確的調控GRP78 的表達，將中醫藥診療方法更好的應用于糖尿病周圍神經病變的治療。