6個高州油茶無性系葉片形態結構及耐熱性比較

劉慧斌　朱周俊　趙君茹　盧元賢　吳凱　袁德義

關鍵詞：高州油茶；葉片；解剖結構；耐熱性

中圖分類號：S794.4 文獻標識碼：A

高州油茶（Camellia gauchowensis Chang）屬山茶科（Theaceae）、山茶屬（Camellia）常綠喬木。具有樹形高大、壽命長、果實大、單株產量高、出油率高等優點，主要分布在我國廣東大部分地區和海南等地區[1-2]。油茶的正常生長發育需要適宜溫度和充足的水分，溫度過低或者過高都會影響果實生長。近年來全球氣候變暖，溫度持續升高，當溫度高過植物承受的范圍，植物就會受害，產量就會降低，因此研究油茶耐熱性，選育出耐熱性較強的樹種相當重要。

目前有關耐熱性的研究主要集中在生理生化的水平上，研究高溫脅迫條件下的相對電導率、葉綠素含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性等變化，反映植物的耐熱性強弱[3-4]。植物的生理生化指標在短期內環境的變化較為明顯，而植物的形態結構是長期特定環境下形成的，也可以作為研究耐熱性的參考指標[5]。葉片是植物進行光合作用、呼吸作用和蒸騰的重要器官，葉片表皮是直接與外界接觸的組織，對高溫變化較為敏感，葉片表皮結構的變化也能反映植物對環境的適應能力，葉片是研究耐熱性的主要器官[6]。目前，有關葉片解剖結構與植物耐熱性的研究在礬根[3]、洋水仙[4]、珙桐[7]、獼猴桃[8]、杜鵑花[9]、報春[10]等植物上已有報道。而有關對油茶葉片解剖結構與耐熱性關系的研究較少，僅陳萍等[11]在海南油茶開展了相關研究。有關高州油茶葉片解剖結構與其耐熱性關系的研究未見報道。本研究以6 個高州油茶無性系為試材，觀察比較不同高州油茶無性系葉片形態、解剖結構和氣孔的相關指標，運用相關性分析和隸屬函數法對其耐熱性進行綜合評價，為高州油茶耐熱品種的選育、引種栽培等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2020 年9 月在廣東省清遠市古朕茶油發展有限公司高州油茶資源圃進行，實驗材料為6 個高州油茶無性系，編號分別為HM19、HMZ25、HMZ24、A11、A5 和A16。

1.2 方法

1.2.1 葉片形態測量 隨機挑選30 片葉片，利用圖像掃描儀對所選葉片進行掃描， 采用Image-Pro-plus 軟件測量葉片的長度、寬度和葉片面積。

1.2.2 葉片解剖結構測定 采用石蠟切片法進行葉片橫切面解剖結構制作：取出經卡諾固定液固定后的葉片，經酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋制成切片（厚度8 μm）、番紅固綠染色、封片，于光學顯微鏡下觀察、拍照。

采用Image-Pro-plus 軟件測量其葉片厚度（leaf thickness， LT）、上表皮厚度（upper epidermisthickness， TU）、下表皮厚度（lower epidermisthickness， TL）、柵欄組織厚度（thickness ofpalisade tissue， TP）、海綿組織厚度（thickness of spongy tissue， TS）、主脈厚度（thickness of mainvein， TMV）、木質部厚度（xylem thickness， XT）、韌皮部厚度（phloem thickness， PT）和維管束厚度（vascular bundle thickness， VB）。計算柵海比（palisade tissue-spongy tissue ratio， P/S）、葉片緊實度（tightness of tissue structure， TST）、葉片疏松度（looseness of tissue structure， TSL）及變異系數（coefficient of variation， CV）。其中，柵海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度；葉片組織緊實度=柵欄組織厚度/葉片厚度；葉片結構疏松度=海綿組織厚度/葉片厚度。

1.2.3 氣孔觀察 采用指甲油印記法制片，在顯微鏡及其成像系統下觀察、拍照[12] 。采用Image-Pro-plus 軟件測量氣孔密度（stomatal density，SD）和氣孔長度（stomatal length， SL）。

1.3 數據處理

使用Microsoft Excel 2010 軟件進行原始數據的整理和簡單的分析，采用SPSS 25.0 軟件對數據進行相關性分析和系統聚類分析。相關指數公式[13-14]為：

2 結果與分析

2.1 葉片形態特征

6個高州油茶無性系的葉長、葉寬、葉面積均存在顯著差異（P<0.05，表1）。葉長在6.73～9.16 cm之間，平均為8.17 cm，A11 最長，A5 最短；葉寬在3.40～4.50 cm 之間，平均為3.86 cm，HMZ25葉片最寬，A5 葉片最窄；葉面積變化范圍為16.58～26.71 cm2，其中HMZ25 葉面積最大，A5葉面積最小。A5 的葉長、葉寬、葉面積均為最小。

2.2 葉片解剖結構特征

2.2.1 葉表皮和氣孔 高州油茶葉片結構由上表皮細胞、柵欄組織、海綿組織和下表皮細胞組成（圖1）。油茶葉片為異面葉，上表皮和下表皮均由一層長形、圓形、橢圓形細胞緊密排列組成，且上表皮厚度均大于下表皮。氣孔位于下表皮，氣孔為橢圓形或者扁圓形（圖2）。

6 個高州油茶無性系上表皮最厚為HM19，厚度35.11 μm，下表皮最厚為HM19，厚度21.61 μm；上下表皮最薄為A5，分別為23.13、13.85 μm。油茶氣孔分布在下表皮，6 個高州油茶無性系葉片氣孔密度在126.75～183.09 個/mm2 范圍內，氣孔長度為24.61～30.33 μm。氣孔密度最大為HMZ25，最小為A16。氣孔長度最長為A16，最短為HMZ24（表2）。

2.2.2 葉肉組織結構 6 個高州油茶無性系的柵欄組織和海綿組織形態有明顯差異（圖1）。其中HMZ24 和A5 的柵欄組織由兩層細胞組成，HMZ24 兩層柵欄組織長度相近，排列疏松，A5上層柵欄組織要長于下層，上層排列緊密，緊挨海綿組織的下層柵欄組織排列疏松。HM19、HMZ25、A11、A16 只有一層柵欄組織，HM19柵欄層細胞細長且排列較緊密，HMZ25、A11、A16 柵欄層細胞短粗且排列疏松。海綿組織排列疏松，細胞大小和形狀明顯不同。

高州油茶的葉肉解剖結構存在顯著性差異（表3）。6 個高州油茶無性系的柵欄組織厚度在82.43～137.41 μm 范圍內，其中最大為HMZ24，最小為HMZ25。海綿組織厚度變化范圍在153.63～183.47 μm 之間，厚度最大為HM19，最小為A16。海綿組織厚度均明顯高于柵欄組織厚度，柵海比均小于1，在0.49～0.90 之間，最大為A16，最小為HM19。葉片結構緊實度范圍在0.27～0.41 之間，最大為A16，最小為HM19。葉片疏松度范圍在0.46～0.58 之間，最大為HMZ25，最小為A16。

2.2.3 主脈組織結構 主脈主要由上下兩層表皮細胞、排列緊密的厚角組織、半月形輻射狀排列的木質部、韌皮部組成（圖3）。對6 個高州油茶無性系主脈組織結構進行比較發現，主脈厚度、木質部厚度、韌皮部厚度、維管束厚度均達到顯著差異水平（表4）。6 個油茶無性系主脈厚度在566.23～821.28 μm 范圍內，最大為A16，最小為HMZ24。維管束厚度在262.12～403.07 μm范圍內，最大為A16，最小為A11。

2.3 6 個高州油茶無性系耐熱性綜合評價

2.3.1 篩選高州油茶耐熱性指標 高州油茶的葉片指標在品系間達到顯著性差異，選出具有代表性的指標來代表耐熱性。首先對6 個高州油茶無性系葉片形態和解剖結構的14 項指標運用SPSS軟件進行聚類分析，14 項指標可以分為4 類：第1 類包括葉長、葉寬、葉面積；第2 類包括葉厚、柵欄組織厚度、葉片結構緊實度、柵海比；第3類包括上表皮厚度、下表皮厚度、葉片結構疏松度、海綿組織厚度、氣孔密度；第4 類包括主脈厚度和維管束厚度（圖4）。運用SPSS 軟件對14項指標進行相關性分析，獲得相關系數矩陣（表5）。指標間的相關系數反映了各指標間的相關性。根據聚類分析結果和相關矩陣，按照公式（1）計算4 類中各指標的相關指數，然后根據相關指數大小對其進行排序（表6）。4 類指標中的典型指標分別為：第1 類為葉面積；第2 類為柵欄組織厚度；第3 類為海綿組織厚度；第4 類為維管束厚度（表6）。

2.3.2 6 個高州油茶無性系耐熱性綜合評價 根據表6 篩選出的耐熱性密切相關的4 項指標（葉面積、柵欄組織厚度、海綿組織厚、維管束厚度），應用隸屬函數法，運用公式（2）、（3），求出平均隸屬函數值，對6 個油茶無性系的耐熱性進行綜合評價。隸屬函數值越大，耐熱性越強。結果表明6 個高州油茶無性系的平均隸屬值在0.125～0.793 之間，其中A16 平均隸屬值最高，為0.793，HMZ25 平均隸屬度最低，為0.125。6 個油茶無性系耐熱性強弱依次為：A16>A5>HMZ24>A11>HMZ19>HM25（表7）。

3 討論

溫室效應導致氣候變暖，溫度升高會使植物產生熱害，直接影響植物的外部形態和植物體內活性酶以及滲透調節物質[15]，植物的光合作用也會受到影響[16]。植物葉片是直接感受外界環境變化最大的器官，對外界環境的變化較為敏感，是植物進化過程中可塑性最大的器官，其結構特征能夠在一定程度上體現植物本身對所在環境的適應性變化，長期的高溫對植物葉片造成外部形態以及內部結構發生變化[17]。

不同無性系的高州油茶的柵欄組織厚度、維管束厚度、海綿組織和葉面積與耐熱性的排序基本一致，油茶耐熱性與柵欄組織厚度、維管束厚度呈正相關，與海綿組織厚度和葉面積呈負相關。柵欄組織厚度大小順序為： A16>A5>A11>HMZ25，海綿組織厚度大小順序為：HMZ25>A11>A5>A16，柵欄組織厚度較大，海綿組織厚度較小，耐熱性較強，與前人結果[7， 9， 18]相似，柵欄組織可以增強植株在光合作用中對水分和光能的利用效率，減少葉表面水分蒸發[19]。海綿組織厚度主要反映植物對弱光環境或中生、濕生環境的適應，這些環境往往溫度較低、植株耐熱性較弱[20]。在植物感受到外界高溫脅迫時，為了適應環境而增加柵欄組織厚度，減少海綿組織厚度，使海綿組織細胞結構變疏松。葉脈維管束是植物葉片主要的輸導組織，為葉片提供無機養分和水分，并往地下部分輸送光合產物，并具有保水、貯水功能各器官[21-22]。葉脈維管束組織厚度越大，養分和水分的利用效率越高，植物體的生命力越旺盛，其抗逆性越強[23-24]。主脈厚度和維管束厚度能增強植物的耐熱性，本研究中維管束厚度大小順序為：A16>A5>HM19>HMZ25，與耐熱性順序基本一致。葉片面積最大為HMZ25，耐熱性較差，葉面積最小為A5，耐熱性較強，表明葉片的面積大小與耐熱性呈負相關性[25]。在6 個高州油茶無性系中，耐熱性最強的A16 維管束厚度最大，海綿組織厚度最小，耐熱性最差的HMZ25 柵欄組織厚度最小，葉面積最大，A5 葉面積最小，HM19海綿組織厚度最大，維管束厚度最小為A11。

單一指標不能準確評定耐熱性，平均隸屬函數法通過整合平均具有代表性的耐熱性指標來綜合評價，減少單方面指標帶來的誤差，是一種常用的綜合性評價方法[26-28]。本研究通過系統聚類、相關性分析與隸屬函數分析法，將14 項指標分為4 類，再從4 類中通過相關指數，選出典型的耐熱性指標，通過隸屬函數法進行綜合性評定。葉片的4 項葉片解剖結構指標（葉面積、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、維管束厚度）可以作為高州油茶的耐熱性的評定指標，研究結果表明：6個高州油茶無性系耐熱性順序為： A16>A5>HMZ24>A11>HMZ19>HM25。