鹽補骨脂飲片外表性狀與內在質量相關性分析

肖偉香　孫宜春　劉婭琴　李慧馨　吳珊珊　林昶　杜洪志　侯曉杰　李瑋

摘要［目的］考察鹽補骨脂飲片外觀性狀與內在成分含量之間的相關性，并篩選出對其質量具有重要影響性的內外指標。［方法］測定16批樣品的千粒重、長度、寬度、厚度及粉末色度值（L*、a*、b*、E*），采用HPLC測定5種香豆素類、5種黃酮類及1種酚類的含量，并進行主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）和相關性分析（CA）。［結果］ PCA表明新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂定、異補骨脂素、補骨脂素是影響內在成分綜合排名（ICCS）的重要指標。OPLS-DA標記了6個重要指標，分別為千粒重、E*、補骨脂酚、L*、b*、ICCS。CA表明外觀性狀與內在成分含量存在差異，其中L*、b*、E*均與補骨脂苷、異補骨脂苷呈極顯著正相關（P＜0.01），與補骨脂乙素呈顯著正相關（P＜0.05），與補骨脂寧呈極顯著負相關（P＜0.01）。a*與補骨脂苷呈極顯著正相關（P＜0.01），與異補骨脂苷、補骨脂甲素、補骨脂乙素呈顯著正相關（P＜0.05），與補骨脂寧呈顯著負相關（P＜0.05）。［結論］綜合3種分析方法得到鹽補骨脂飲片外觀性狀特征以粉末色度值（L*、a*、b*、E*）為主要指標，內在成分以補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂寧、補骨脂酚為主要指標。

關鍵詞鹽補骨脂飲片；外觀性狀特征；內在成分含量；主成分分析；正交偏最小二乘判別分析；相關性分析

中圖分類號R283文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）08-0194-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.045開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Correlation Analysis between External Appearance and Internal Quality of Salt-processed Psoralea corylifolia

XIAO Wei-xiang1，SUN Yi-chun2，LIU Ya-qin1 et al（1.College of Pharmacy， Guizhou University of Traditinal Chinese Medicine，Guiyang， Guizhou 550025;2. Sinopharm Tongjitang （Guizhou） Pharmaceutical Co.， Ltd.，Guiyang， Guizhou 550025）

Abstract［Objective］ To investigate the correlation between the quantification of appearance characteristics and the content of internal components in salt-processed Psoralea corylifolia， and to screen out the internal and external indicators that had important impact on their quality.［Method］ The 1 000 grain weight， length， width， thickness and powder chroma （L*， a*， b*， E*） of 16 batches of samples were determined，the contents of 5 coumarins， 5 flavonoids and 1 phenol compound were determined by HPLC， and principal component analysis （PCA）， orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA） and correlation analysis （CA） were performed.［Result］PCA showed that neobavaisoflavone， bavachinin， psoralenoside， isopsoralenoside， psoralidin， isopsoralen and psoralen were important indicators affecting the comprehensive ranking of internal components （ICCS）. OPLS-DA marked six important indicators， which were the 1000 grain weight， the E*， bakuchiol， L*， b* and ICCS. CA showed that there were differences between the quantification of appearance traits and the content of internal components， among which the L* value， b* value and E* value were highly significantly positively correlated with psoralenoside and isopsoralenoside （P<0.01）， significantly positively correlated with isobavachalcone（P<0.05）， and highly significantly negatively correlated with psoralidin （P<0.01）. The value of a* was highly significantly positively correlated with psoralenoside （P<0.01）， significantly positively correlated with isopsoralenoside， coryfolin and isobavachalcone （P<0.05）， and significantly negatively correlated with psoralidin （P<0.05）. ［Conclusion］ By synthesizing the three analytical methods， the main indicators of the appearance characteristics of salt-processed Psoralea corylifolia are the chromaticity values （L， a， b， E）， and the main indicators of the internal components are psoralenoside， isopsoralenoside，coryfolin， isobavachalcone， psoralidin and bakuchiol.

Key wordsSalt-processed Psoralea corylifolia；Appearance characteristics；Internal components content；Principal component analysis （PCA）;Orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）;Correlation analysis （CA）

補骨脂為豆科植物補骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實。鹽補骨脂是通過凈補骨脂鹽炒所得［1］。補骨脂含有香豆素類、黃酮類、單萜酚類等化學成分，具有調節雌激素水平、抗腫瘤、神經保護及對心血管系統等方面有多重活性［2］。近年來，中藥的外觀性狀與內在成分含量的相關性研究較多［3-6］，逐漸成為中藥研究的熱點，為其質量評價提供了新的方法。目前，主要從補骨脂藥材指紋圖譜和內在成分含量一測多評法的建立［7-9］和鹽補骨脂飲片一測多評法的建立及其炮制工藝優選等方面［10-11］對補骨脂的質量進行評價，鮮有研究其外表性狀與內在質量的相關性。該研究收集了16批鹽補骨脂飲片，測定其外觀性狀特征值和內在成分含量，應用多元統計學方法進行分析，挖掘具有標志性的指標，為制定其質量評價體系提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料日本島津高效液相色譜儀（LC-16，蘇州島津）；色差儀（NR-200型，Nscing Es/蘇測）；補骨脂素對照品（批號66-97-7）、異補骨脂素對照品（批號523-50-2），購于貴州迪大生物科技有限責任公司；補骨脂苷對照品（批號905954-17-8）、異補骨脂苷對照品（批號90594-18-9）、新補骨脂異黃酮對照品（批號41060-15-5）、補骨脂甲素對照品（批號19879-32-4）、補骨脂寧對照品（批號53947-92-5）、補骨脂定對照品（批號18642-24-4）、補骨脂乙素對照品（批號20784-50-3）、補骨脂二氫黃酮甲醚對照品（批號19879-30-2）、補骨脂酚對照品（批號10309-37-2），均購于成都埃法生物科技有限責任公司；甲醇（色譜純，天津科密歐）；乙腈（進口色譜純，美國天地）；娃哈哈純凈水（貴陽娃哈哈昌盛飲料）；其余試劑均為分析純。

該研究收購了16批鹽補骨脂飲片，經貴州中醫藥大學魏升華教授鑒定為豆科植物補骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實，樣品信息見表1。

1.2試驗方法

1.2.1外觀性狀特征測定。采用四分法篩選出一部分樣品，隨機選取1 000粒稱重，即得千粒重；用游標卡尺測量樣品長度、寬度和厚度。

1.2.2粉末顏色特征測定。取適量樣品粉末（過3號篩），使用色度儀連續測量3次，查看并記錄色度值。L值代表明亮度，0 ～ 100表示從黑色至白色；a代表紅（+）綠（-）方向；b值代表黃（+）藍（-）方向。根據公式總色度值E*=（L＋a＋b），計算樣品的總色度值E［12］。

1.2.3內在成分含量測定。

1.2.3.1色譜條件。pntulipsBP-C Plus色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.3% 冰乙酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，15%B；5～35 min，15%～18%B；35～60 min，38% ～ 60%B；60～70 min，60%～95%B，70～75 min，95%～100%B），檢測波長246 nm，溫度20 ℃，進樣量20 μL，流速1.2 mL/min。

1.2.3.2對照品溶液制備。分別精密稱取補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂寧、補骨脂定、補骨脂乙素、補骨脂二氫黃酮甲醚和補骨脂酚對照品適量，加甲醇溶解，制成質量濃度分別為3.29、1.79、2.34、1.68、1.76、1.80、0.59、1.16、0.46、1.54、19.50 mg/mL的對照品儲備液。

1.2.3.3供試品溶液制備。取樣品粉末（過3號篩）0.25 g，置具塞錐形瓶中，加25 mL 70%乙醇溶液，稱重，超聲提取60 min，放冷，補足減失重量。濾過，備用。

1.2.3.4方法學考察。依據2020年版《中國藥典》（四部）［13］分析方法驗證指導原則進行方法學考察。以各待測成分峰面積的對數值（y）作為縱坐標、進樣量的對數值（x）作為橫坐標進行方程擬合，得到補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂寧、補骨脂定、補骨脂乙素、補骨脂二氫黃酮甲醚和補骨脂酚的回歸方程分別為y=2 674 060.62x-75 484.94（R=0.999 9）、y=3 173 628.77x-88 047.57（R=0.999 8）、y=7 366 040.95x+24 824.89（R=0.999 8）、y=7 326 364.86x-263 288.29（R=0.999 6）、y=4 299 851.84x+396 143.67（R=0.999 4）、y=2 214 904.83x+21 277.98（R=0.999 3）、y=7 626 885.09x-42 052.84（R=0.999 4）、y=2 421 031.89x+22 913.90（R=0.999 9）、y=1 511 043.71x+90 247.76（R=0.999 9）、y=1 779 439.25x+246 732.17（R=0.999 8）、y=1 165 021.42x+2 174 397.86（R=0.999 9），分別在0.20～6.38、0.14～3.51、0.33～2.39、0.37～2.79、0.39～2.82、0.18～1.44、0.12～0.34、0.37～1.73、0.26～1.95、0.71～2.16、5.01～24.01 μg進樣量范圍內與其峰面積的線性關系良好；精密度試驗中，峰面積RSD均小于3%（n=6）；重復性試驗中，各成分含量的RSD均小于3%（n=6）；穩定性試驗分別于0、2、4、8、12、24 h進行測定，峰面積的RSD均小于3%；平均加樣回收率分別為100.11%、100.10%、100.08%、99.93%、100.16%、99.97%、100.24%、99.99%、99.98%、100.32%、100.06%（n=6）。結果表明，該方法的精密度、重復性、準確性良好［14］。

1.2.3.5含量測定。精密吸取“1.2.3.3”供試品溶液20 μL，按照“1.2.3.1”色譜條件進行測定，分別計算補骨脂苷、異補骨脂苷等11個成分含量。補骨脂對照品溶液和供試品溶液的色譜圖見圖1。

1.3數據分析采用HemI 1.0.3.7-Heatmap Illustrator對樣品粉末顏色進行可視化處理；采用JASP 0.14.1進行主成分分析；采用SIMCA 14.1進行正交偏最小二乘判別分析；采用SPSS 26.0軟件進行相關性分析。

2結果與分析

2.1外觀性狀特征測定樣品千粒重、長度、寬度和厚度的測定結果見表2。

2.2粉末顏色特征測定樣品粉末色度值（L*、a*、b*、E*）的測定結果見表2。采用HemI 1.0.3.7-Heatmap Illustrator繪制粉末色度熱點圖如圖2，說明樣品間的色度值差異明顯。

2.3內在成分含量采用HPLC測定16批樣品中補骨脂苷、異補骨脂苷等11個內在成分的含量，結果見表3。從表3可以看出，樣品中補骨脂素和異補骨脂素的總量為0.78～1.77 mg/g，符合2020年版《中國藥典》［1］要求。對比香豆素類（補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂定）、黃酮類（新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂寧、補骨脂乙素、補骨脂二氫黃酮甲醚）和酚類（補骨脂酚）3類成分含量，發現酚類含量最高，其次是香豆素類，黃酮類含量最低。

2.4主成分分析以11個內在成分的含量為變量，通過JASP 0.14.1軟件進行主成分分析（簡稱PCA），計算得到特征值及方差貢獻率如表4所示。由表4可知，主成分分析特征值中前3個主成分的累計方差貢獻率為80.40%，用這3個主成分對全部指標進行概括分析。由主成分與變量的模型圖（圖3）可知，第一主成分（RC1）中新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮甲醚的正向影響大；第二主成分（RC2）中異補骨脂苷、補骨脂苷的正向影響大，補骨脂定的負向影響大；第三主成分（RC3）中異補骨脂素和補骨脂素的正向影響大。

以3個主成分各自的方差貢獻率為權重，通過分析得RC1的得分Y，RC2的得分Y，RC3的得分Y，構建綜合評價模型，計算樣品內在成分含量的綜合得分（以下簡稱ICCS），ICCS=0.44Y+0.23Y+0.10Y，分別計算得到樣品的ICCS并排名，見表5。樣品S3排名第1，S14排名最后，產地均是云南省。表明同一產地不同廠家的鹽補骨脂飲片內在質量差異明顯。

2.5正交偏最小二乘判別分析采用SIMCA 14.1軟件對16批樣品全部指標進行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），模型區分參數RX、RY分別為0.92、1.00，預測能力參數Q為0.73，表明模型穩定可靠，可用于評價樣品質量［15］，得分散點圖見圖4。以樣品粉末顏色深淺程度進行了分類，分為3類，S、S、S為第1類，總色度值E*為21.58～22.60；S、S、S、S、S、S、S、S、S、S為第2類，總色度值E*為18.39 ～ 20.82；S、S、S為第3類，總色度值E*為15.30～17.79。這3類樣品的投影點相聚比較遠，說明組間總色度值存在極顯著差異（P<0.01）。

通過OPLS-DA模型的變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）可以初步篩選出組間差異成分，以VIP > 1為標準，如圖5所示，共標記出6個貢獻較大的成分，分別為千粒重（VIP=1.97）、E*（VIP = 1.82）、補骨脂酚（VIP = 1.65）、L*（VIP = 1.59）、b*（VIP = 1.44）、ICCS（VIP = 1.09）。以上6個指標是影響樣品質量差異的標志性指標，其中，粉末色度值（L*、b*、E*）和千粒重是鹽補骨脂飲片的重要外在特征指標，補骨脂酚和ICCS是內在成分的重要指標。

2.6指標之間相關性分析鹽補骨脂飲片質量評價體系需要尋求外觀性狀與內在質量的相關性，采用SPSS 26.0軟件對16批樣品的內在成分與外觀性狀指標進行兩兩相關的Pearson相關性分析（簡稱CA），結果如表6所示。由表6可知，樣品中千粒重、長度、寬度、厚度與內在成分均無顯著相關（P>0.05）。樣品中L*、b*、E*均與補骨脂苷、異補骨脂苷呈極顯著正相關（P＜0.01），與補骨脂乙素呈顯著正相關（P＜0.05），與補骨脂寧呈極顯著負相關（P＜0.01）。a*與補骨脂苷呈極顯著正相關（P＜0.01），與異補骨脂苷、補骨脂甲素、補骨脂乙素呈顯著正相關（P＜0.05），與補骨脂寧呈顯著負相關（P＜0.05）。結果表明，外觀性狀以粉末色度值（L*、a*、b*、E*）為主要指標；內在成分以補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂寧為主要指標。

3討論與結論

中藥傳統性狀鑒別主要通過感官評價，存在主觀性較強且難以量化等缺點，采用現代相關檢測設備將中藥外觀性狀特征以數字化的形式表示出來，有助于更加客觀準確地評價中藥外觀性狀特征［16］。中藥的“辨狀論質”即根據藥材外觀性狀所表現出來的特點，來判斷藥材的真偽優劣，從而闡明其本質，這就是“辨狀論質”的涵義和依據。藥材的外表性狀與內在質量是有一定聯系的［17］。

綜合PCA、OPLS-DA、CA這3種分析方法，得到鹽補骨脂飲片外觀性狀特征以粉末色度值（L*、a*、b*、E*）為主要指標，內在成分以補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂乙素、補骨脂寧、補骨脂甲素、補骨脂酚含量為主要指標。該研究挖掘出影響鹽補骨脂質量的主要指標，為鹽補骨脂飲片的質量體系提供了一定的理論依據。

在品質評價過程中，補骨脂具有肝毒性，有研究報道補骨脂素［18］、補骨脂二氫黃酮甲醚［19］、補骨脂酚［20］等具有肝毒性，但其又是藥效的相關成分，是否將肝毒性納入補骨脂品質評價中有待進一步研究。

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