云南省葡萄霜霉病菌群體遺傳結構的SSR分析

王境楊 張昊 孔繁芳 周連柱 楊敏 杜飛 鄧維萍 黃曉慶 朱書生

摘要 為明確云南特色葡萄產區葡萄霜霉病菌的群體遺傳結構，本研究采用7對SSR分子標記對采自云南3個地區的155株葡萄霜霉病菌進行了群體遺傳多樣性研究，并分析了病原菌群體遺傳結構與地域之間的關系。7對引物共檢測出41個等位基因，114種基因型，病原菌群體的Shannons信息指數和Neis無偏基因多樣性指數分別為0.942和0.600。分子方差分析和群體連鎖不平衡分析顯示，不同群體間存在相當大的遺傳變異。遺傳分化系數、基因流以及Structure分析表明，元謀群體與賓川、尋甸兩群體之間均具有較高的基因交流，賓川和尋甸兩群體間則存在一定的遺傳分化。上述結果表明，云南葡萄霜霉病菌群體存在較高水平的遺傳多樣性，且群體遺傳結構與地理距離之間存在一定相關性。

關鍵詞 葡萄霜霉病菌;?SSR分子標記;?遺傳多樣性;?遺傳結構

中圖分類號： S?436.631

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2021701

Abstract To clarify the population genetic structure of Plasmopara viticola in Yunnan province， the population genetic diversity of 155 strains of Plasmopara viticola collected from three regions was studied by seven pairs of SSR markers， and the relationship between population genetic structure and region was analyzed. A total of 41 alleles and 114 distinct genotypes were identified. Shannons information index and Neis unbiased gene diversity index were 0.942 and 0.600， respectively. The analysis of molecular variance and population linkage imbalance showed that there were considerable genetic variations among different populations. Based on genetic differentiation index， gene flow and Structure analysis， Yuanmou population had a high gene flow with Binchuan and Xundian populations， while Binchuan and Xundian populations showed genetic differentiation to some extent. In conclusion， there was a high level of genetic diversity in the populations of Plasmopara viticola in Yunnan， and there was a correlation between the population genetic structure and geographical distance to some degree.

Key words Plasmopara viticola;?SSR markers;?genetic diversity;?genetic structure

云南位于我國西南地區，氣候類型豐富，晝夜溫差較大，光照充足，適合葡萄種植［1］。所產葡萄具有成熟早、產量高、品質優的特點，是國內鮮食葡萄上市最早的產區［2］，在我國葡萄產業中占有重要地位。葡萄霜霉?。╣rape downy mildew）是危害葡萄產業最為嚴重的病害之一，病菌主要為害葉部，并侵染嫩梢、幼果、花穗等一切綠色組織［3］。一般病害流行年份減產30%～50%，嚴重時可減產80%［4］。云南省葡萄霜霉病常于葡萄掛果期及成熟期暴發流行，嚴重影響果實品質及產量［5］。引起該病害的葡萄霜霉病菌Plasmopara viticola是活體專性寄生的二倍體卵菌［6］，有無性繁殖和有性生殖兩種生殖方式，能夠在單個葡萄生長季完成多次侵染［7］，這就導致在每個生殖周期都有可能發生遺傳變異［8］。因此，不同地理環境，多樣化耕種方式以及較長的栽種時間等，可能給云南葡萄霜霉病菌群體的遺傳多樣性帶來影響。

進行葡萄霜霉病菌群體遺傳多樣性的研究，有助于了解云南霜霉病的發生流行情況，推測病原菌群體進化趨勢，豐富病原菌遺傳分化數據庫以及有針對性地制訂相應的防控策略。目前，尚沒有針對云南地區葡萄霜霉病菌群體遺傳多樣性研究的報道。對病菌群體遺傳多樣性的研究，傳統方法是對病原菌進行形態觀測、發病規律研究等［9］。隨著分子生物學的快速發展，分子標記被廣泛應用于病原菌群體遺傳多樣性的研究。本研究利用SSR分子標記技術對云南賓川縣、元謀縣、尋甸回族彝族自治縣3個地區的葡萄霜霉病菌群體進行了遺傳多樣性分析，以研究云南地區葡萄霜霉病菌群體遺傳結構，并分析葡萄霜霉病菌群體遺傳結構與地域的相關關系，從而為葡萄霜霉病菌的監測預警，及有效控制策略研發奠定理論基礎。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?供試菌株

2020年－2021年采集了云南省大理白族自治州賓川縣（以下簡稱“賓川”）、楚雄彝族自治州元謀縣（以下簡稱“元謀”）、昆明市尋甸回族彝族自治縣（以下簡稱“尋甸”）3個地區的葡萄霜霉病病葉，挑取單孢囊梗，經分離、純化后共得到155株病原菌。其中，采自賓川的菌株共75株，采自元謀的菌株共65株，采自尋甸的菌株共15株。

1.1.2?接種材料

病原菌的純化擴繁選用中國農業科學院廊坊中試基地葡萄園內新鮮、健康的‘里扎馬特嫩葉。

1.1.3?葡萄霜霉病菌的培養

采集新鮮、健康的‘里扎馬特葡萄嫩葉，用1%的次氯酸鈉水溶液消毒30 s后用去離子水沖洗2～3次，并用濾紙吸干水分。使用直徑15 mm的打孔器打取葉片，葉背面向上放置于1%水瓊脂培養基上，對葡萄霜霉病菌進行活體培養。

1.2?試驗方法

1.2.1?病菌的采集與純化擴繁

田間采集新鮮、無雜菌污染，并且近期未施用殺菌劑的葡萄霜霉病病葉，置于鋪有濕潤濾紙的培養皿中，表面噴上無菌水，于溫度21℃，光周期L∥D=16 h∥8 h的人工氣候箱內保濕培養。待長出新鮮霉層后，在體視顯微鏡下挑取單孢囊梗，接種在提前制備好的葉圓盤中央（事先滴加20 μL滅菌水，提供孢子萌發所需的水環境）。在21℃，黑暗處理24 h 后，用滅菌濾紙吸干水分，繼續在21℃，L∥D=16 h∥8 h條件下保濕培養6 d，葉盤上長出濃密的菌層，即為葡萄霜霉病菌純系菌株。刮取純培養的菌株霉層，加入去離子水充分振蕩，制成濃度為1×105個/mL的孢子囊懸浮液，接種于新的葉圓盤上并按上述培養條件進行菌株的擴繁，以此獲得大量純系菌株，用于提取DNA。

1.2.2?DNA的提取

從葉圓盤片上刮取一定量的霜霉病菌，利用OMEGA Fungal DNA Mini Kit （D3309-02）提取菌株DNA，提取方法參照試劑盒說明書。用NanoVue plus紫外可見分光光度計檢測DNA濃度及質量，合格后放-20℃凍存備用。

1.2.3?簡單重復序列的擴增

SSR引物的選取參照Gobbin等［10］，Rouxel等［11］的方法，篩選出7對適合研究葡萄霜霉病菌遺傳多樣性的SSR特異性引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并用FAM或HEX熒光進行標記（表1）。以提取的DNA為模板，利用選取的7對SSR引物進行擴增。

PCR反應采用20 μL體系：2×Taq mix 10 μL，ddH2O 8 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL。PCR擴增程序：95℃預變性5 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環35次;72℃再延伸10 min;最后4℃保存。PCR反應結束后取5 μL擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格產物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.3?數據統計與分析

使用GenAIEx 6.51b2（Microsoft office Excel加載宏）計算遺傳多樣性參數［12］，包括等位基因數（observed number of alleles， Na），有效等位基因數（effective number of alleles， Ne），稀有等位基因數（number of private alleles， PA），Shannons信息指數（Shannons information index， I），期望雜合度（expected heterozygosity， He），遺傳分化系數（genetic differentiation index， Fst），估算基因流（gene flow， Nm），并進行分子方差分析（analysis of molecular variance， AMOVA）。

使用R軟件的poppr包對供試菌株個體進行克隆矯正，進而測定多位點基因型數目（number of multilocus genotypes observed， MLG），多位點基因型數目期望值（the number of expected MLG at the smallest sample size， eMLG），Nei無偏基因多樣性（Neis unbiased gene diversity， Hexp），標準化連鎖指數（the standardized index of association， rbarD），顯著性水平（P-value， P）。

使用Structure 2.3.4進行群體結構劃分，根據每個獨立個體的遺傳背景進行結構劃分， 選用混合祖先模型［13］，將缺失數據標記為“-9”并嘗試設定K值（亞群數）范圍為2～6，設定“length of burnin period”為10 000，然后選擇馬爾科夫蒙特卡洛（MCMC）法進行10 000次迭代，設定每個K值重復運行5次［14］，其他參數按照默認設置，不做更改。

2?結果與分析

2.1?引物多態性

采用7對引物對采集的155株葡萄霜霉病菌DNA進行擴增，獲取片段大小后，使用poppr克隆矯正得到116個獨立菌株。7對引物在3個群體中共檢測出41個等位基因（表2），每個引物位點的等位基因數目是4～8個，平均等位基因數為5.857個。對每個位點的等位基因數進行比較，多樣性最多的位點是Pv138（Na=8），多樣性最少的是Pv61（Na=4）。引物預期雜合度（He）范圍在0.554～0.684之間，各引物之間雜合度差異不大，等位基因多樣性較為豐富。

2.2?不同地區葡萄霜霉病菌群體的遺傳多樣性

由表3所示，116株病原菌共存在114個多位點基因型（MLG），14個稀有等位基因（PA），其中賓川群體的稀有等位基因數量最多，有10個，元謀群體有4個稀有等位基因，尋甸群體則無稀有等位基因。利用Nei無偏基因多樣性（Hexp）和Shannons信息指數（I）估算了3個群體的遺傳多樣性水平，Hexp值在0.535～0.559，I值為0.817～1.014。從以上兩個指標可知，3個群體遺傳多樣性程度差別不大，其中元謀種群遺傳多樣性最高?？傮w而言，云南葡萄霜霉病菌群體的遺傳多樣性較高，Hexp=0.600，I=0.942。群體連鎖不平衡分析如圖1所示，賓川、尋甸群體rbarD值均較低，P賓川=0.164，P尋甸=0.149，表明其群體內的標準化連鎖系數與理論值不存在顯著差異，群體內的基因型分布符合連鎖平衡，表現為隨機交配群體，群體內個體間存在充分的有性生殖。元謀群體rbarD值為0.062（P元謀=0.01），顯著偏離遺傳平衡，說明群體內個體間基因交流非常有限。

2.3?葡萄霜霉病菌群體的遺傳分化與基因流

分子方差分析（表4）顯示，云南3個地區葡萄霜霉病菌的群體內、群體間均存在顯著的遺傳變異（P < 0.001）。群體內遺傳變異占72%，群體間占28%，說明遺傳變異主要產生于每個地區葡萄霜霉病菌群體內的菌株之間，且群體間也存在較大的遺傳變異。按照Wright［15］對遺傳分化系數（Fst）的界定標準，當0 < Fst ≤ 0.05時表示群體間分化程度低;0.05 < Fst ≤ 0.15時為中度分化;0.15 < Fst ≤ 0.25表示分化程度較高;Fst > 0.25 表明分化程度極高。由表5可見，各群體間的遺傳分化系數分布在0.077～0.111，表明不同群體兩兩間均存在中度程度的遺傳分化;其中，賓川和尋甸群體間遺傳分化系數最大，為0.111，相應的群體間基因流最小，為2.007。賓川和元謀群體間遺傳分化系數最低，為0.077，群體間基因流最大，為3.014。

2.4?不同地區葡萄霜霉病菌的群體遺傳結構

Structure群體遺傳結構表明群體的遺傳結構與地區之間有一定關聯，選取K=2，將葡萄霜霉病菌群體劃分為兩個理論群（圖2）。其中，雜合菌株14株，占群體的12.1%;cluster 1（黑色）58株，占群體的50.0%;cluster 2（灰色）44株，占群體的37.9%。賓川群體中90.9%是cluster 1（黑色），9.1%是混合菌株;元謀群體中14.9%是cluster 1（黑色），14.9%是混合菌株，70.2%是cluster 2（灰色）;尋甸群體中78.6%是cluster 2（灰色），14.3%是混合菌株，7.1%是cluster 1（黑色）。3個群體間遺傳結構存在一定差異，元謀群體在結構劃分上類型最為豐富，并且與賓川、尋甸群體交流都比較頻繁。

3?結論與討論

葡萄霜霉病的嚴重發生給云南葡萄產業帶來了巨大經濟損失，葡萄霜霉病菌有很強的繁殖進化能力，能在一個生長季發生多次再侵染。SSR分子標記技術操作簡單，成本低，目前被廣泛用于葡萄霜霉病菌群體遺傳多樣性和遺傳結構研究。本研究結果顯示，采自云南賓川、元謀、尋甸3個地區的葡萄霜霉病菌，經SSR引物擴增后，共產生41個等位基因（其中包括14個稀有等位基因），共存在114種基因型。Nei無偏基因多樣性（Hexp）和Shannons信息指數（I）分別為0.600、0.942。與周婷婷［16］、李卓［17］、于舒怡等［18］、Yin等［19］利用SSR分子標記技術對我國其他地區葡萄霜霉病菌遺傳多樣性分析所得的Nei無偏基因多樣性和Shannons信息指數相比，云南地區的霜霉病菌群體比新疆、遼寧、北京、天津、河北、山東、江蘇、廣西、寧夏等地區群體具有更高水平的遺傳多樣性。

病原菌的遺傳多樣性由不同因素相互作用決定，包括生殖方式、防治方法和耕作方式等。根據群體連鎖不平衡分析顯示，賓川、尋甸兩群體符合連鎖平衡，表明群體內菌株間能進行充分的隨機交配，兩群體均以有性生殖為主，這就造成病原菌會形成新的基因型，群體遺傳多樣性豐富。在葡萄生產中常以化學防治為主，同時配合抗病品種的種植以及避雨栽培等技術防治葡萄霜霉病，各地區不同的防治措施對病菌群體產生了不同的選擇壓力，也可能造成葡萄霜霉病菌遺傳多樣性水平的不同。另外，云南具有獨特的地理氣候，復雜的生境條件，并且3個地區均處在我國少數民族聚居區，多民族集居導致的多樣化耕種方式和相對較長時間的葡萄規?；苑N等因素，也可造就云南地區葡萄霜霉病菌群體具有較高的遺傳多樣性水平［20］。

另外，分子方差分析（AMOVA）顯示，不同群體間遺傳變異占比28%，說明不同地理群體間存在較高水平的遺傳變異，揭示了云南葡萄霜霉病菌群體遺傳結構可能與地理位置存在一定的關系，3個地區的群體結構產生了一定差異。兩兩群體間遺傳分化系數為0.077～0.111，基因流為2.007～3.014，3個群體兩兩間均存在中等程度的遺傳分化。相比而言，元謀群體與賓川、尋甸兩群體有較高的基因流，較低的遺傳分化系數;賓川、尋甸兩群體則存在較低的基因流以及較高的遺傳分化系數。Structure群體遺傳結構分析也表明，當將云南葡萄霜霉病菌群體歸于2個亞群時，元謀群體在結構劃分上類型最為豐富，與賓川、尋甸群體均有一定程度的基因交流;相反，賓川、尋甸兩群體之間交流較少，在遺傳結構上存在一定分化。這與元謀在地理位置上介于賓川和尋甸之間有一定的關系，表明元謀群體在群體基因交流中充當“橋頭堡”作用，葡萄霜霉病菌群體遺傳結構與地理距離之間存在一定相關性，并且隨著距離的增大，群體間基因交流程度會下降，遺傳結構差異增加。就上述而言，3個地區菌株群體間雖存在一定程度的基因交流并可能在元謀地區進行交會，但也存在中度的遺傳分化。

與本研究結果類似的是，周婷婷［16］對新疆不同地區的葡萄霜霉病菌進行遺傳分析的結果表明群體內變異是霜霉病菌遺傳變異的主要來源，病菌群體間的親緣關系與地理分布之間具有一定相關性。之后李卓［17］對新疆地區葡萄霜霉病菌進行聚類分析的結果也表明群體間的親緣關系與地理分布具有相關性。李榮［21］進行了湖南省霜霉病菌的系統發育分析顯示，病原菌的親緣關系與地理位置有一定程度的聯系。

葡萄霜霉病菌群體內部既存在有性生殖又存在無性繁殖，根據病害風險模型假說［22-23］，有性生殖對病原菌的新基因型的產生具有重要作用，無性繁殖則有助于病原菌在盛發期大規模繁殖，更有助于病原菌對殺菌劑產生抗藥性。因此，研究云南葡萄霜霉病菌群體遺傳多樣性和遺傳結構，對于了解云南地區病害發生情況，做好地區病害流行監控，進行病害預測預報，制定省內病害防控措施，防止病害在省內各產區間大規模傳播有一定的積極作用。

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（責任編輯：楊明麗）