虱螨脲對棉鈴蟲葉酸一碳庫代謝途徑的影響

楊林 劉彩月 韓小強 陳明慧 陳閱新 張艷聰 周科瑾

摘要 為了探究虱螨脲對棉鈴蟲的作用機理，用虱螨脲（200 mg/L）處理棉鈴蟲3齡幼蟲，通過轉錄組測序、葉酸含量測定、葉酸飼喂試驗和分子對接技術分析了虱螨脲對棉鈴蟲葉酸一碳庫代謝途徑的影響。結果表明，棉鈴蟲幼蟲差異基因數量隨虱螨脲處理后時間的延長而增多，主要富集在葉酸一碳庫、氧化還原活性、幾丁質結合、氨基酸合成、嘌呤合成與代謝以及離子跨膜運輸等途徑上，其中葉酸一碳庫代謝通路在處理后0.5 h極顯著富集（P=6.35×10-5）。棉鈴蟲幼蟲的葉酸含量隨著虱螨脲處理后時間的延長而顯著降低，處理后24 h葉酸含量為4.53 μg/100 g，約為對照組的1/2;用含葉酸的飼料飼喂虱螨脲處理的棉鈴蟲幼蟲，能夠明顯降低其中毒癥狀。分子對接結果表明，胞質10-甲?；臍淙~酸脫氫酶（cytosolic 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase）與虱螨脲共形成12個氫鍵和6個鹵鍵，具有最低的結合能（-10.4 kcal/mol），推測其是虱螨脲的潛在作用靶標之一。研究結果進一步豐富了虱螨脲的作用機理，為以葉酸途徑為靶標的殺蟲劑開發提供了理論指導。

關鍵詞 虱螨脲;?棉鈴蟲;?葉酸一碳庫;?轉錄組;?分子對接

中圖分類號： S 482.37; Q 965.9; TP 391

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2021626

Abstract In order to explore the action mechanism of lufenuron on Helicoverpa armigera， the 3rd instar larvae of H.armigera were treated with lufenuron （200 mg/L）. The effects of lufenuron on folate and one-carbon metabolism of H.armigera were analyzed by transcriptome sequencing， folate content determination， folate feeding test and molecular docking technology. The number of differentially expressed genes （DEGs） increased with the extension of time after treatment， and their functions were mainly enriched in one-carbon pool by folate， oxidation-reduction process， chitin binding， amino acid synthesis， purine synthesis and metabolism， and ion transport across membranes. Among them， the one-carbon pool by folate pathway （P=6.35×10-5） was extremely significantly enriched in 0.5 h after treatment. The folate content in H.armigera larvae decreased significantly after treated with lufenuron， and the folate content of H.armigera treated with lufenuron was 4.53 μg/100 g after 24 h， about 1/2 of the control. The poisoning symptoms of H.armigera treated with lufenuron were obviously reduced by feeding H.armigera with folate. Molecular docking results showed that cytosolic 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase formed 12 hydrogen bonds and 6 halogen bonds with lufenuron. They had the lowest binding energy （-10.4 kcal/mol）， indicating that they were the potential targets of lufenuron. Our study helps to understand the action mechanism of lufenuron， and provides a theoretical guidance for the development of insecticides targeting folate pathway.

Key words lufenuron;?Helicoverpa armigera;?one-carbon pool by folate;?transcriptome;?molecular docking

虱螨脲（lufenuron）是一種選擇性好，對環境和非靶標生物安全的苯甲酰脲類昆蟲生長調節劑，具有觸殺和胃毒作用。對鱗翅目［1］、雙翅目［2］、鞘翅目［3］以及虱目［4］等害蟲有出色的防效，適于防治對擬除蟲菊酯和有機磷農藥產生抗性的害蟲，廣泛用于棉花、玉米、甜菜、馬鈴薯、葡萄、柑橘等作物。一般認為，虱螨脲干擾鱗翅目昆蟲的正常生長發育，但其具體的作用機理卻一直沒有定論。

關于虱螨脲作用機理的研究較多。如Dean等發現虱螨脲引起貓櫛頭蚤Ctenocephalides felis表皮細胞中細胞質減少，線粒體、核糖體、高爾基體等細胞器溶解，中腸細胞的分化被抑制［5］。Douris等認為虱螨脲直接作用于黑腹果蠅Drosophila melanogaster的幾丁質合成酶［6］。此外，虱螨脲能夠抑制卵幾丁質的合成，進而影響卵的呼吸代謝及胚胎發育過程中DNA和蛋白質代謝，致使卵內胚胎缺乏幾丁質而不能孵化或孵化后隨即死亡［7-10］。以上研究表明，虱螨脲的作用機理比較復雜。

棉鈴蟲Helicoverpa armigera （Hübner）是為害棉、糧、油、蔬菜等多種作物的重要害蟲，在全世界范圍內造成了重大的經濟損失［11］。為了進一步研究虱螨脲的作用機理，本研究通過轉錄組測序分析虱螨脲對棉鈴蟲3齡幼蟲代謝途徑的影響，在此基礎上利用鼠李糖桿菌法測定虱螨脲處理后不同時間棉鈴蟲體內葉酸含量的變化，并使用葉酸飼喂虱螨脲處理后的棉鈴蟲，觀察棉鈴蟲癥狀表現。進一步結合分子對接技術探究虱螨脲與棉鈴蟲葉酸一碳庫代謝途徑相關酶的作用關系，旨在深入地了解虱螨脲殺蟲作用機理，為棉鈴蟲的可持續防控提供指導。

1?材料與方法

1.1?供試材料

供試昆蟲：棉鈴蟲H.armigera幼蟲，購于河南省濟源白云實業有限公司。

供試試劑：97%虱螨脲原藥，武漢遠成共創科技有限公司;N，N-二甲基甲酰胺和Triton X-100，天津市光復科技發展有限公司;胰蛋白酶-EDTA消化液、98%葉酸，索萊寶科技有限公司。

供試儀器：昆蟲生長培養箱（Adaptis A1000IN），加拿大康威龍公司;實時熒光PCR儀（ABI 7500）、酶標儀（Multiskan FC），Thermo Fisher Scientific公司。

1.2?試驗方法

1.2.1?轉錄組樣本制備

將虱螨脲原藥溶于適量的N，N-二甲基甲酰胺中，配制成10 g/L的母液，用0.01% Triton X-100溶液稀釋成200 mg/L的供試藥液。以0.01% Triton X-100溶液為溶劑對照。采用浸蟲法處理棉鈴蟲［12］。將棉鈴蟲3齡幼蟲分別在200 mg/L虱螨脲藥液和0.01% Triton X-100中浸漬5 s，取出后用濾紙吸干多余藥液，轉入昆蟲生長培養箱，在溫度（26±1）℃，相對濕度（70±10）%，光周期L∥D=14 h∥10 h條件下單頭飼養并接入人工飼料。浸蟲時棉鈴蟲幼蟲口器保持在液面以上，減少胃毒作用干擾。分別取處理后0、0.5、1、3、6、12 h和24 h的棉鈴蟲幼蟲，在冰上放置2 min，用大頭針固定蟲體于蠟盤上，用鑷子、剪刀取下表皮組織，用預冷的0.9% NaCl溶液清洗干凈，-78°C保存后送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉錄組測序。每個處理重復3次，每重復30頭試蟲。

1.2.2?轉錄組數據分析

測序獲得的所有clean reads與棉鈴蟲參考基因組 （Harm_1.0）［13］比對，使用featureCounts計算映射到每個基因的reads數。根據基因的長度計算每個基因的FPKM （fragments per kilobase of transcript per million mapped fragments）。使用DESeq2 1.20.0進行虱螨脲各處理組與CK組兩兩組合之間基因的差異表達分析，通過clusterProfiler 3.4.4軟件實現差異表達基因的GO富集分析和KEGG通路分析。

1.2.3?差異基因的篩選和RT-qPCR驗證

由轉錄組分析得到差異表達基因后，將|log2（Foldchange）|>0 且Padj≤0.05 作為差異表達基因的篩選標準［14］。選取差異表達基因中與葉酸一碳庫代謝途徑相關的4個基因進行轉錄組數據的驗證，從NCBI網站下載目的基因序列，使用Primer-BLAST模塊設計基因引物（表1）。將棉鈴蟲RNA反轉錄為cDNA。qPCR按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix熒光定量試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）步驟進行。熒光定量PCR反應體系（10 μL）：10 mmol/L上、下游引物各0.5 μL，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL，RNase-Free ddH2O 3 μL、cDNA模板 1 μL。反應程序為：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃延伸1 min，循環40次。以棉鈴蟲的β-actin為內參基因。每個樣本設置3次重復。2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.2.4?棉鈴蟲葉酸含量測定

按照1.2.1的方法處理試蟲，分別取處理后0.5、1、3、6 h和24 h的棉鈴蟲整蟲液氮研磨制備樣品。分別取1 g制備的棉鈴蟲樣品和 20 mg 豬胰酶（豬胰酶P1750，Sigma-Aldrich公司）加入50 mL離心管中，加入30 mL磷酸鹽緩沖液，搖勻后37℃黑暗條件下孵育4 h;95℃水浴30 min，12 500 r/min離心5 min，吸取上清液過0.2 μm 無菌濾膜后備用。葉酸含量測定和葉酸標準曲線的制備方法按照試劑盒（葉酸試劑盒P1001，德國VitaFast公司）說明書進行，葉酸含量計算公式：葉酸（μg/100 g）=吸光值對應標準曲線的濃度×稀釋倍數/樣品重量。

1.2.5?葉酸飼喂試驗

選取發育狀態良好的棉鈴蟲3齡幼蟲，饑餓處理24 h后，按照1.2.1的方法處理試蟲。處理后分別飼喂葉酸含量為0和0.1%（質量百分比）的飼料0.3 g/頭，每濃度重復3次，每重復12頭試蟲。待試蟲取食完含葉酸飼料后繼續飼喂正常飼料，藥后第7天記錄試蟲癥狀。

1.2.6?分子對接

通過轉錄組測序結果，結合葉酸含量測定和飼喂試驗，挑選了4個在虱螨脲處理后下調或連續下調表達的基因（表2），從NCBI（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載目的基因編碼的氨基酸序列，導入在線服務器Swiss-model （https：∥swissmodel.expasy.org/）進行同源建模，再將同源建模結果上傳到SAVES 6.0 （https：∥saves.mbi.ucla.edu） 在線服務器，使用Verify3D和拉氏圖（PROCHECK）模塊對蛋白模型進行結構評價。使用AutoDock Vina軟件進行分子對接，蛋白質模型和虱螨脲加氫、去水、加電荷等操作，對接參數exhaustiveness=24進行精細對接。用Discovery Studio 2021 client進行虱螨脲與蛋白質相互作用分析，使用PyMOL 2.3軟件繪制虱螨脲和蛋白的結合圖［15］。

2?結果與分析

2.1?轉錄組結果分析

2.1.1?差異表達基因分析和GO富集分析

相比于對照，虱螨脲處理棉鈴蟲幼蟲后0 h共有1 151個基因差異表達，其中上調表達基因400個，下調表達基因751個;處理后0.5 h共有1 053個基因差異表達，其中上調表達基因364個，下調表達基因689個;處理后1 h共有1 573個基因差異表達，其中上調表達基因691個，下調表達基因882個;處理后 3 h共有1 486個基因差異表達，其中上調表達基因677個，下調表達基因809個;處理后6 h共有939個基因差異表達，其中上調表達基因385個，下調表達基因554個;處理后12 h共有1 685個基因差異表達，其中上調表達基因843個，下調表達基因842個;處理后24 h共有2 174個基因差異表達，其中上調表達基因1 167個，下調表達基因1 007個。

GO分析篩選出69個有顯著差異的分類條目（Padj＜0.05），主要歸屬于生物過程、細胞組分和分子功能。在生物過程上，氧化還原過程、碳水化合物衍生物代謝、幾丁質代謝和藥物代謝條目富集基因較多，分別有314、109、74個和72個基因。

藥物代謝過程涉及外來化學物質如藥物在蟲體內的化學反應和途徑，氧化還原過程涉及一個或多個電子與質子的轉移。幾丁質屬于高分子多糖類物質，是昆蟲表皮結構的重要組成成分，幾丁質代謝過程涉及氧化還原過程和碳水化合物衍生物代謝。生物過程的富集結果表明虱螨脲處理后，棉鈴蟲幾丁質代謝出現異常，虱螨脲可能干擾了氧化還原過程。

在細胞組分上，細胞外區域條目被富集多次，表明細胞外區域的正常生化反應受到影響。在分子功能上，結構分子活性、表皮結構成分和輔酶結合條目富集到基因較多，表明試蟲表皮結構物質的代謝受到影響。

2.1.2?差異表達基因的KEGG富集

KEGG分析發現葉酸一碳庫途徑在每個處理組中都有顯著富集，其中0.5 h時極顯著富集（P=6.35×10-5）。有1 053個差異基因被富集到93個代謝通路，共獲得12條顯著性代謝通路（表3），包括葉酸一碳庫、DNA復制、錯配修復、嘌呤代謝、酪氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、氨基酸生物合成、N-多糖生物合成、乙醛酸二羧酸代謝、壽命調節通路以及昆蟲激素生物合成，其中葉酸一碳庫代謝通路最顯著。葉酸一碳庫主要與葉酸及其衍生物的一碳單位代謝過程相關，在DNA復制、核酸甲基化修飾和一碳單元轉運等方面發揮重要作用［16］。將富集到的葉酸一碳庫的差異基因進行組間比較時發現，在所有處理組中參與葉酸一碳庫途徑的差異表達基因共有10個，這些基因在虱螨脲處理后呈現不同的表達模式（圖1）。三功能嘌呤生物合成蛋白腺苷-3 （trifunctional purine biosynthetic protein adenosine-3）、雙功能嘌呤生物合成蛋白水解酶（bifunctional purine biosynthesis protein PURH）和胞質絲氨酸羥甲基轉移酶（cytosolic serine hydroxy methyltransferase）基因都連續上調表達，氨甲基轉移酶（aminomethyltransferase）、二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase）、胸苷酸合酶（thymidylate synthase）和C-1-四氫葉酸合酶（C-1-tetrahydrofolate synthase）基因都先上調表達，然后下調表達，最后又上調表達;5-甲酰四氫葉酸環連接酶（5-formyltetrahydrofolate cyclo-ligase）基因的表達先下調，然后上調，最后又下調表達;雙功能亞甲基四氫葉酸脫氫酶 （bifunctional methylene tetrahydrofolate dehydrogenase）和胞質10-甲?；臍淙~酸脫氫酶（cytosolic 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase）基因表達呈現持續的下調表達模式。

2.2?差異基因的RT-qPCR驗證

KEGG通路分析表明，葉酸一碳庫代謝途徑相關基因在虱螨脲處理的棉鈴蟲轉錄本中顯著的差異表達（圖2）。cytosolic 10-formyltetra-hydrofolate dehydrogenase基因（FDH）是葉酸代謝酶基因，主要功能是調節葉酸量和葉酸結合甲基量以及參與嘌呤從頭合成等［17］。5-formyltetrahydrofolate cyclo-ligase基因（ALDH1L1）是唯一的將5-甲酰四氫葉酸催化成5，10-甲酰四氫葉酸的酶基因［18］。bifunctional methylenetetrahydrofolate dehydrogenase基因（FTHFDH）是一類依賴于NADP，主要催化四氫葉酸衍生物之間相互轉化的基因［19］。C-1-tetrahydrofolate synthase基因（FTHFS）是葉酸一碳庫途徑中的中心酶基因，將5，10-甲酰四氫葉酸催化成5，10-次甲基四氫葉酸［20］。虱螨脲處理后，棉鈴蟲3齡幼蟲的這4個酶的基因大致呈現先上調表達后下調表達的趨勢，其中HaFDH（圖2a）的FPKM值變化趨勢和RT-qPCR一致，在處理后24 h基因表達量顯著下降;HaALDH1L1 （圖2b）也具有類似的規律。HaFTHFS （圖2c）基因FPKM值和RT-qPCR試驗所測值在處理后6 h和12 h處表現不一致，但整體趨勢兩者相似。 HaFTHFDH （圖2d）在處理后0～12 h FPKM值變化趨勢和RT-qPCR試驗所測值相同，但在處理后24 h基因FPKM值增大而RT-qPCR試驗所測值變化不大。

2.3?虱螨脲對棉鈴蟲葉酸含量的影響

為了進一步驗證虱螨脲對棉鈴蟲葉酸代謝的影響，采用鼠李糖桿菌法測定了虱螨脲處理后棉鈴蟲幼蟲體內的葉酸含量（葉酸的標準曲線方程為y=0.547 2x-0.000 2，R2=0.998 7）。虱螨脲處理棉鈴蟲后，蟲體內的葉酸含量隨著處理后時間的延長而下降，處理后6 h和24 h葉酸含量分別為4.27 μg/100 g和4.53 μg/100 g，約是CK組葉酸含量的一半;除處理后0.5 h的葉酸含量高于CK外，其余時間點都顯著低于CK（圖3）。

虱螨脲處理后棉鈴蟲表現出典型的“雙頭囊”癥狀，部分蟲體出現蛻皮困難，新表皮和舊表皮同時存在，表皮顏色變黑，毛片突出（圖4a）。虱螨脲處理過的棉鈴蟲再飼喂含葉酸飼料后，未出現雙頭囊癥狀，中毒癥狀明顯減輕，表明葉酸對虱螨脲處理的棉鈴蟲具有治療效果（圖4b）。

2.4?分子對接

以上研究結果表明，虱螨脲可干擾棉鈴蟲葉酸一碳庫途徑基因的表達，并顯著影響棉鈴蟲體內的葉酸含量，為了進一步探究虱螨脲影響棉鈴蟲葉酸一碳庫代謝途徑的作用機理，使用分子對接技術探究虱螨脲處理后葉酸一碳庫途徑的4個基因所編碼蛋白與虱螨脲的關系。結果表明，虱螨脲對5-formyltetrahydrofolate cyclo-ligase、cytosolic 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase、C-1-tetrahydrofolate synthase、bifunctional methylenetetrahydrofolate dehydrogenase蛋白的結合能都低于-8 kcal/mol，其中對cytosolic 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase結合能最低，為-10.4 kcal/mol。結合能越小表示虱螨脲與蛋白質結合程度越強，故推測cytosolic 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase和虱螨脲的結合程度強，可能是虱螨脲的潛在作用靶標之一。

結合虱螨脲與蛋白模型組成復合體時的相互作用關系分析，cytosolic 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase和虱螨脲之間的氫鍵和鹵鍵數最多，共形成12個氫鍵和6個鹵鍵（圖5a）。而bifunctional methylenetetrahydrofolate dehydrogenase與虱螨脲只形成6個氫鍵，不存在鹵鍵（圖5b）。5-formyltetrahydrofolate cyclo-ligase和虱螨脲之間存在6個氫鍵和6個鹵鍵（圖5c）。C-1-tetrahydro-folate synthase與虱螨脲形成3個氫鍵和4個鹵鍵（圖5d）。由于虱螨脲特殊結構以及氮原子和氯原子所處的特殊位置關系賦予虱螨脲影響棉鈴蟲葉酸一碳庫途徑中基因表達和葉酸含量的生物活性。

3?結論與討論

虱螨脲處理后，棉鈴蟲幼蟲的差異基因GO富集主要集中在結合蛋白活性、催化活性和代謝過程，這與虱螨脲作用于甜菜夜蛾Spodoptera exigua Hübner的結果類似［21］。虱螨脲處理貓櫛首蚤后，其表皮細胞發生降解，細胞器數量顯著少于對照組［5］，表明虱螨脲對DNA復制過程也產生了抑制作用，阻止表皮細胞正常增殖。轉錄組分析表明，虱螨脲處理棉鈴蟲后幾丁質代謝、表皮細胞組分相關基因顯著富集，藥物代謝途徑、嘌呤合成途徑、嘌呤核苷酸代謝過程、蛋白質合成以及氧化還原途徑也有明顯的富集。以上結果表明虱螨脲通過多種途徑影響棉鈴蟲的生長發育。

葉酸一碳庫代謝為昆蟲的生命活動提供一碳單位，發揮一碳供體和受體的作用［22］，參與嘌呤和胸腺嘧啶的合成以及DNA、RNA和蛋白質的甲基化過程［23］。本研究表明，虱螨脲顯著影響棉鈴蟲葉酸一碳庫代謝途徑相關基因的表達，虱螨脲處理后棉鈴蟲幼蟲的葉酸含量顯著下降，飼喂含有葉酸的飼料可明顯緩解棉鈴蟲的中毒癥狀。進一步的分子對接結果表明，虱螨脲與5-formyltetrahydrofolate cyclo-ligase、cytosolic 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase、C-1-tetrahydrofolate synthase和bifunctional methylenetetrahydrofolate dehydrogenase等4種酶都有較好的結合作用。研究表明，通過干擾鱗翅目害蟲的葉酸一碳庫代謝途徑可達到殺蟲的目的，如葉酸拮抗劑2，4-二氨基嘧啶類化合物對多種鱗翅目害蟲都有較好的防治效果，對美洲棉鈴蟲H.zea （Boddie） LC50為0.5 mg/ L，對煙芽夜蛾Heliothis virescens的LC50為0.2 mg/ L［24］。氨甲蝶呤可通過抑制二氫葉酸還原酶（DHFR）的活性影響果蠅的生殖和后代的生長發育過程，并造成果蠅的生長發育異常以及畸形等癥狀［25］。

綜上所述，本研究通過轉錄組測序首次分析出葉酸一碳庫代謝途徑為虱螨脲作用于棉鈴蟲的潛在途徑之一，葉酸含量測定和飼喂葉酸試驗進一步證實了該機理，并通過同源模建和分子對接技術預測了虱螨脲與葉酸一碳庫代謝途徑相關蛋白的結合模式，研究結果可為研究虱螨脲的作用機理提供線索，為以葉酸途徑為靶標的殺蟲劑開發提供理論指導。

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（責任編輯：楊明麗）