基于網絡藥理學及代謝產物分析白首烏對乙醇性肝損傷的作用機制

宋婉鈺 李勇 李春陽 馮進 吳承東 馬永強

摘要：通過網絡藥理學及分子對接技術闡述一年生、多年生白首烏代謝產物對乙醇性肝損傷的作用機制。使用液相色譜-飛行時間質譜分析白首烏提取物的化學組成，通過PubChem數據庫及文獻查找方法篩選出具有生物活性的成分，預測成分靶點、獲取疾病靶點并通過構建蛋白質-蛋白質互作網絡，篩選關鍵成分及核心靶點，最后對交集靶點進行富集通路分析與分子對接及可視化處理。經過篩選發現，白首烏含有25種已認證的生物活性因子，其在多年生白首烏中的含量顯著高于一年生白首烏（活性成分有20種）；一年生白首烏中含量顯著高于多年生白首烏（活性成分有5種），驗證了白首烏主要活性成分中的多糖類、氨基酸類能與潛在作用靶點發生相互作用。最后得出，一年生白首烏中的成分是通過減少細胞色素活性及減輕炎癥反應來抑制乙醇性肝損傷及相關疾病，多年生白首烏中的成分則是通過影響基因表達及能量代謝途徑來實現保護肝臟的功能。

關鍵詞：白首烏；代謝產物分析；網絡藥理學；分子對接；乙醇性肝損傷

中圖分類號：R285.5??文獻標志碼：A??文章編號：1002-1302（2023）09-0166-09

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金［編號：CX（20）2006）］。

作者簡介：宋婉鈺（1996—），女，山東黃縣人，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：wanyu18545546152@126.com。

通信作者：李春陽，博士，研究員，研究方向為營養與活性功能。E-mail：lichunyang968@126.com。

白首烏（Cynanchum auriculatum Royle ex Wight）是蘿藦科鵝絨藤屬植物耳葉牛皮消的塊根，別稱隔山消、隔山撬、白人參、和平參、白木香、山花旗等，廣泛分布于華東、中南及河北、陜西、甘肅等地［1］。我國95%的白首烏產自江蘇濱海地區，2010年濱海白首烏獲得國家質監總局地理標志保護產品認證，并于2012年成為江蘇省地理標志產品。

目前，有關一年生白首烏功效的報道較多，主要集中在抗腫瘤［2］、保肝護肝［3］與免疫調節［4］等方面，而關于多年生白首烏活性成分組成、含量及生物功能性差異等方面的研究則鮮見報道。本研究基于液相色譜-飛行時間質譜（liquid chromatography-time of flight mass spectrometry，LC-QTOF/MS）及網絡藥理學技術，對一年生白首烏與多年生白首烏提取物的活性組成、含量進行較為系統的研究，同時對兩者生物活性功能進行比較及預測，以期為白首烏產品開發及工業化生產提供有效的理論依據。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

白首烏由鹽城果老首烏科技有限公司提供。分析純乙醇（批號：20200319），購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2?儀器與設備

LC-QTOF/MS高效液相色譜（安捷倫1260）串聯飛行時間質譜（AB SCIEX TOF 5600+），購自安捷倫科技有限公司；FD-2A真空冷凍干燥機，購自北京博醫康實驗儀器有限公司；L3-5K臺式低速離心機，購自湖南可成儀器設備有限公司；RE52-A旋轉蒸發儀，購自上海亞榮生化儀器廠。

1.3?試驗方法

1.3.1?LC-QTOF/MS分析白首烏提取液?將一年生白首烏、多年生白首烏凍干后研磨成粉末。稱取相同質量的白首烏粉末，以乙醇為溶劑，熱回流提取1.5 h，提取溫度為70 ℃，于4 500 r/min離心15 min并收集上清液。將白首烏殘渣經過2次提取離心后，合并2次離心所得上清液，減壓濃縮至無醇味，冷藏靜置2 h，過濾，得到白首烏提取液。

1.3.1.1?LC-QTOF/MS條件?參考劉啟月等的方法［5］。色譜柱：XSelect HSS T3（4.6 mm×150.0 mm，3.5 μm）；正電離模式流動相A為0.1%甲酸/水，流動相B為乙腈；負電離模式流動相A為0.005 mol/L乙酸銨，流動相B為乙腈。質譜條件：QTOF/MS全掃描模式，質量掃描范圍為50～1 000 質荷比；正、負電離模式的源電壓分別為 5 500、4 500 V；簾氣、霧化器和加熱氣體的流動壓力分別為25、50、50 psi；正、負模式離子源電壓分別為30、-30 V。

1.3.1.2?LC-QTOF/MS數據處理?用MS-DI-AL軟件進行相似性匹配來鑒定化合物?；衔镨b定后，采用RStudio進行主成分分析，隨后通過Excel 2016的T TEST公式進行計算，將表現為顯著（P<0.05）的數據采用TBtools進行聚類分析?；谝荒晟?、多年生白首烏差異代謝物，進一步通過PubChem網站、類藥五原則（lipinski rules）［6］及相關參考文獻對差異代謝物進行進一步分析注釋，篩選出具有生物活性功能的差異代謝物。

1.3.2?成分靶點預測及疾病靶點篩選?從PubChem網站獲得各個成分的Smiles化學結構式，首先將Smiles化學結構式上傳到Swiss Target Prediction網站，選擇“Homo sapiens”作為研究物種，獲得該成分可能的靶點蛋白信息。同時將Smiles化學結構式上傳到Similarity Ensemble Approach （SEA）網站，獲得預測靶點信息，再通過Excel篩選出“HUMAN”作為研究物種，得到可能的靶點信息。最后將2個數據庫得到的成分靶點蛋白信息進行去重，整合取并集，分別得到一年生白首烏、多年生白首烏潛在的作用靶點。

在KEGG DISEASE網站上檢索乙醇性肝損傷，得到“Alcoholic liver disease”，再以“Alcoholic liver disease”為關鍵詞，分別在Therapeutic Target Database（TTD）、PharmGKB、Drugbank和Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）數據庫中進行搜索，可得到與乙醇性肝損傷相關的疾病靶點，對得到的靶點進行去除假陽性、去重處理，得到與乙醇性肝損傷相關靶點的總和。

用Venny 2.1.0軟件繪制Venn圖，將成分與疾病的靶點蛋白相交，得到作為活性成分緩解抑制疾病的靶點。將活性成分與UniProt網站中獲取的靶點進行匹配，導入Cytoscape 3.7.2中繪制白首烏-成分-疾病靶點相互作用網絡圖。

1.3.3?PPI網絡構建?通過STRING 11.5數據庫，繪制蛋白質-蛋白質之間相互作用的網絡圖（PPI）。通過RStudio，將數據庫數據以大于中位值作為關鍵靶點的標準進行篩選后，導入Cytoscape 3.7.2中，對目前的相互作用靶點進行拓展，發現直接靶點與間接靶點之間產生的內在聯系，進而進行全面考察，最終得到治療疾病的關鍵靶點及其對應的活性成分。

1.3.4?富集分析?將活性成分的靶點蛋白通過DAVID數據庫中的“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”基因名進行識別，以“Homo sapiens”為研究對象，得到GO、KEGG及WIKI數據；再利用Bioinformatics網站中的富集分析工具對靶點進行信號通路分析。

1.3.5?成分-靶點分子對接驗證?在RCSB PDB數據庫中獲取靶點蛋白的3D結構，在PyMOL 2.5.0軟件中進行去除水分子、游離配體后，將其命名為受體文件；在PubChem數據庫中獲取小分子成分的3D結構，通過Open Babel軟件進行格式轉化，將其命名為配體文件。最后將受體蛋白、配體通過AutoDock 4進行分子對接。以最低結合能為標準篩選可能的分子對接結構，最后通過PyMOL 2.5.0軟件對對接結果進行可視化處理。

2?結果與分析

2.1?代謝產物分析

對檢測數據進行主成分分析（PCA）與聚類分析。由圖1可以看出，一年生白首烏（OA）、多年生白首烏（OB）表現為明顯的離散型，表明兩者在成分組成、含量方面確實存在顯著差異。這可能是因為隨著栽培年限的增加，白首烏次級代謝產物的種類、含量發生了顯著變化。

如圖1所示，一年生白首烏（a01、a02和a03）與多年生白首烏（b01、b02和b03）中含量存在顯著差異的成分有117種，其中烯丙基丁酮、檸檬酸及鳥氨酸等多種氨基酸成分在多年生白首烏中的含量顯著高于一年生白首烏中的含量，而煙酰胺、蔗糖及膽堿等成分在多年生白首烏中的含量卻顯著低于一年生白首烏中的含量（P<0.05）。

通過對117種存在含量差異的成分進行Lipinski篩選，以相對分子量＜500、脂水分配系數＜5、氫鍵供體數＜5、氫鍵受體數＜10和旋轉鍵＜10為標準，找出了67種符合標準的成分，又根據在PubChem網站中的查找結果及參考大量文獻，發現白首烏含有25種已認證的生物活性因子，其中在多年生白首烏中含量顯著高于一年生白首烏的活性成分有20種，在一年生白首烏中含量顯著高于多年生白首烏的活性成分有5種。對各成分進行功能注釋，并將結果匯總于表1，發現上述20種多年生白首烏成分主要具有緩解乙醇性肝損傷和抗腫瘤等功能，而一年生白首烏中的5種活性成分則主要表現為抗氧化及保肝護肝等功能。

2.2?成分靶點預測及疾病靶點篩選

將一年生白首烏中5種活性成分的Smiles化學結構式上傳到Swiss Target Prediction網站和SEA網站，得到預測靶點，進行去重整合后，得到189個作用靶點。從TTD、OMIM、PharmGKB及DrugBank這4個數據庫中搜索與乙醇性肝損傷相關的靶點，去除假陽性及去重后，得到583個疾病靶點，將一年生白首烏中的活性成分靶點和乙醇性肝損傷疾病靶點相交，得到11個相交靶點（圖2-A）。同時，對多年生白首烏中20種活性成分的701個作用靶點與乙醇性肝損傷疾病靶點相交，得到35個相交靶點（圖2-B）。將相關信息導入Cytoscape 3.7.2軟件后，得到白首烏-成分-疾病靶點相互作用網絡圖。如圖2-C、圖2-D所示，在一年生白首烏中，間可他酮有5個靶點，煙酰胺有2個靶點，谷氨酸有3個靶點；在多年生白首烏中，腺苷、色氨酸各有10個靶點，海戈寧、酪氨酸各有9個靶點，丹皮酚有5個靶點，賴氨酸有4個靶點，焦谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、哌啶甲酸及對羥基苯甲酸甲酯分別有3個靶點，谷氨酰胺、天冬酰胺及剩余氨基酸分別有2個靶點。

2.3?PPI網絡的構建

將多年生白首烏及一年生白首烏與乙醇性肝損傷的共同靶點上傳至STRING 11.5數據庫中，得到PPI網絡。將結果通過RStudio以大于中位值作為關鍵靶點的標準進行篩選后得到核心靶點。圖 3-A 為一年生白首烏成分干預下的乙醇性肝損傷靶點相互作用網絡，其中CYP3A4、REN、NR3C1及IL6為一年生白首烏成分緩解抑制乙醇性肝損傷的4個關鍵靶點。圖3-B中的NOS3、EGFR、REN、NT5E、CYP3A4、PPARA、MTOR、FASN、PPARG、NR3C1、 ALB及ADORA2A為多年生白首烏成分緩解抑制乙醇性肝損傷的12個關鍵靶點。

2.4?富集分析

通過Bioinformatics網站中的富集分析工具對一年生白首烏、多年生白首烏干預乙醇性肝損傷的靶點基因進行分析，得到如圖4、圖5的富集結果。如圖4所示，一年生白首烏預防乙醇性肝損傷的靶點參與了對脂多糖、氨基酸和糖皮質激素等的反應過程，這些靶點主要集中在蛋白復合物、細胞質及細胞外液等部位，具有結合類固醇、細胞增殖、中性粒細胞介導免疫、精氨酸分解代謝、正向調節趨化因子的產生和調節血壓等功能，靶點主要集中在血管緊張素轉化酶抑制劑通路、尿素循環及轉錄因子在脂肪形成中的調控等相關途徑。由圖5可知，多年生白首烏預防乙醇性肝損傷的靶點參與了對過氧化氫、維生素A、有機氮化合物及固定激素等反應過程，這些靶點主要集中在等離子體膜、細胞質以及細胞外液等部位，具有結合蛋白、激活轉錄因子及信號轉導等功能，這些靶點主要富集在胰島素、脂肪細胞因子、AMPK、HIF-1、mTOR、cAMP、PI3K-Akt與ErbB等信號通路及淀粉、蔗糖和藥物等代謝途徑。

2.5?分子對接驗證

在靶點的PPI網絡圖中，多年生白首烏的12個關鍵靶點對應的成分為腺苷、海戈寧、腺嘌呤、丹皮酚（2-羥基-4-甲氧基苯乙酮）及L-焦谷氨酸等，由于靶點蛋白是執行功能的主要物質，因此選擇EGFR、REN、NT5E、MTOR、FASN、NR3C1及ADORA2A對應的成分進行分子對接驗證。在一年生白首烏中選擇CYP3A4、IL6對應的煙酰胺、間可他酮進行分子對接驗證。如圖6所示，所選分子對接的能量均小于0，同時每個成分都結合在靶點蛋白的空腔內 因此可以推測每個組分在細胞內都可以與靶點自發結合形成靶點-配體二元復合物。

3?結論與討論

根據數據庫查詢結果對差異成分進行靶點預測及比較，發現多年生白首烏對肝臟具有更好的保護作用。在多年生白首烏中，色氨酸、酪氨酸和賴氨酸等成分具有較多靶點，經過關鍵靶點篩選后，得到的關鍵靶點對應的成分為腺苷、海戈寧、腺嘌呤、丹皮酚及L-焦谷氨酸，表明這些成分在保護肝臟方面都具有一定作用，其中腺苷［7］、海戈寧［8］、腺嘌呤［9］、丹皮酚［10］及L-焦谷氨酸［11］起到了主要作用，而其他成分則通過促進靶點與關鍵靶點的相互作用來保護肝臟。

有研究發現，一次性或長期大量飲用含有乙醇的飲品后，乙醇及其代謝物在人體內代謝進入肝臟，刺激各種細胞釋放出三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），被水解的一磷酸腺苷再用胞外CD73（5′-nucleotidase，NT5E）將其水解成腺苷，大量腺苷積聚后啟動免疫反應，釋放出炎癥因子，使機體在短期內形成乙醇性肝損傷，長期的炎癥因子刺激肝星狀細胞活化后分泌膠原，從而形成慢性乙醇性肝纖維化［12］。除循環腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）外，活化的肝星狀細胞高表達肝臟局部RAS能以不同分泌方式在肝細胞脂肪沉積、調節肝臟功能等方面發揮重要作用［13］，并且抑制CD73、CD39可以阻斷腺苷A2A（adenosine A2a receptor，ADORA2A）和腺苷A2B受體的激活及TGF-β/Smad3通路的形成，從而阻止星狀細胞的活化，緩解急性乙醇性肝損傷、慢性乙醇性肝纖維化。靶點表皮生長因子受體erbB1（epidermal growth factor receptor erbB1，EGFR）就是ATP-CD39-CD73信號通路和ATP代謝通路中緩解抑制乙醇性肝損傷的預防靶點［14］。長期大量攝入乙醇會過度激活肝細胞MTOR復合物1，表現為肝細胞蛋白磷酸化水平升高。依賴絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase，MTOR）相互作用蛋白的MTOR復合物1受到抑制時，會減弱由乙醇誘導的細胞質積聚，阻止抑制脂肪酸氧化，對人類乙醇性脂肪變性、炎癥和肝損傷有潛在治療作用［15］。生脂基因激活、肝細胞中脂質積聚是通過糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，NR3C1）的反式激活和N6-甲基腺苷去甲基化來減少脂質積聚的，可以防止肝臟脂肪變性［16］。減少脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）含量及活性是預防乙醇性肝損傷及保護肝臟的關鍵［17］。因此，從NT5E、REN、ADORA2A、EGFR、MTOR、NR3C1以及FASN這些靶點的研究結果可以推測：多年生白首烏活性成分是通過影響基因表達及能量代謝途徑來達到保護肝臟的功能。

非乙醇性脂肪肝病和糖尿病與肝臟細胞色素P450 3A4（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）活性降低有關，通過抑制CYP3A4酶含量對肝損傷具有保護作用［18］。植物提取物對肝臟有一定的保護作用，研究發現，白細胞介素-6（interleukin-6，IL6）就是通過減輕炎癥反應來減少肝臟脂肪變性和肝細胞壞死的靶點之一，通過減輕炎癥反應和氧化應激可以保護肝臟，預防乙醇性肝損傷［19-20］。通過對CYP3A4、IL6這2個靶點的研究，推測一年生白首烏中的成分是通過減少細胞色素的活性及減輕炎癥反應來抑制乙醇性肝損傷及相關疾病。分子對接的可視化結果顯示，通過分子之間的相互對接驗證了上述靶點確實對乙醇性肝損傷起到了重要作用。

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