煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶1對視網膜發育過程中中央碳代謝穩定性的作用

金瀟,秦應祥,羅凱

(中國科學院大學重慶仁濟醫院1.眼科,2.藥劑科,重慶 400000)

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)在氧化還原代謝中發揮核心作用,煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶1(nicotinamide nucleotide adenylyltransferase 1,NMNAT1)還可作為許多酶的底物,包括SIRTs、PARPs、CD38、CD157 和 SARM1等,與衰老、細胞增殖、免疫、神經變性、分化和發育等多種生物學過程有關[1-5]。在哺乳動物組織中,視網膜似乎特別依賴于適量的NMNAT1來維持細胞生存和發揮生理功能[6-8]。NMNAT1是一種高度保守蛋白,可催化煙酰胺單核苷酸(NMN)或煙酸單核苷酸(NaMN)的腺苷?；饔靡孕纬蒒MNAT1,這是所有哺乳動物NMNAT1生物合成途徑的關鍵步驟[9-10]。目前NMNAT1的多種超出其在氧化還原代謝中典型作用的功能受到了廣泛的關注,本實驗旨在探討NMNAT1對小鼠視網膜中心碳代謝過程的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型

NMNAT1fl/fl小鼠(維通利華)與野生型 129/SV-E小鼠(維通利華)充分回交。將NMNAT1fl/fl小鼠與Six3啟動子下表達Cre重組酶的轉基因小鼠(Six3-Cre)雜交,獲得條件敲除小鼠[11]。雜交產生雜合的Nmnatfl/wt和Six3-Cre Nmnatfl/wt后代,它們與NMNAT1fl/fl小鼠進一步雜交以產生接近孟德爾比率的條件敲除(Six3-Cre Nmnatfl/fl)和同窩對照(NMNAT1fl/fl)小鼠。實驗小鼠定期與野生型129/SV-E小鼠回交以保持遺傳完整性。將實驗小鼠維持在標準的12 h光照/黑暗循環下,提供充足的食物和水。

使用來自耳部穿刺活檢的基因組DNA,通過PCR對小鼠進行基因分型。Six3-Cre引物:5′-GCCCTGGCAGTGTCTTAG-3′;5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。NMNAT 1引物:5′-CCTTGTACCTGACCATGTCAACA-3′;5′-CCTGGGAGGCATAGACCATGTA-3′。引物以0.75 μmol·L-1的終濃度添加到PCR反應中。熱循環條件為95 ℃ 2 min,隨后完成35個熱循環(95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s),最后延伸步驟72 ℃ 5 min。

1.2 液相色譜串聯質譜(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)靶向代謝組學

在出生后第4天,對NMNAT1敲除組和空白對照組小鼠視網膜組織中的涉及基本生化途徑的112種細胞代謝物的含量水平進行量化。將小鼠用斷頸法處死后摘除眼球,將視網膜解剖后置于漢克平衡鹽溶液(HBSS)中,并在液氮上快速冷凍。根據既往報道的方案[12]提取代謝物。代謝物提取物通過Shimadzu LC Nexera X2 UHPLC與QTRAP 5500 LC-MS/MS(AB Sciex)聯用進行分析。ACQUITY UPLC BEH Amide分析柱(2.1×50 mm,1.7 μCorp.,Milford,MA)用于色譜分離。流動相是含有10 mmol·L-1乙酸銨(pH 8.9) 的水(A)和含有10 mmol·L-1乙酸銨(pH 8.2)的乙腈/水(體積比為95/5)(B)(所有溶劑均為Fisher Scientific的LC-MS Optima級)?？傔\行時間為11 min。流速為 0.5 ml·min-1。進樣體積為5 μl,梯度洗脫為6 min時體積分數95%～61%(B)、8 min時體積分數61%～44%(B)、8.2 min時體積分數61%～27%(B)和9 min時體積分數27%～95%(B)。在每次運行結束時用體積分數95%(B)平衡色譜柱。碰撞氣體為N2。正負模式下的離子源條件為:氣簾(CUR)=25 psi,碰撞氣(CAD)=高,離子噴霧電壓(IS)=3 800/-3 800 V,溫度(TEM)=500 ℃,離子源氣體1(GS1)=50 psi,離子源氣體2(GS2)=40 psi。每種代謝物都使用標準品進行了調整,以獲得最佳轉換。 D4-煙酰胺(Cambridge Isotope Laboratories, Tewksbury, MA)用作內標。使用 MultiQuant 3.0.3 軟件(AB Sciex, Concord, ON, CA)對提取的 MRM 峰進行積分。

1.3 視網膜RNA提取、測序和分析

將小鼠用斷頸法處死后摘除眼球,將視網膜解剖后置于含有少量 Trizol?試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司)的無菌微量離心管中,并在干冰上快速冷凍。用手持勻漿器勻漿解凍樣品并孵育5 min,提取總RNA。向每個樣品中加入 20 μl氯仿,將樣品短暫渦旋,在室溫下孵育4 min,然后以12 000 r·min-1離心10 min。將上清液移置含有50 μl異丙醇的離心管中,并在室溫下孵育10 min。最后,樣品再次以12 000 r·min-1離心10 min。去除上清液,用體積分數75%乙醇洗滌沉淀3次,干燥后重懸于DEPC處理過的水中。 全轉錄組測序在NovaSeq 6000平臺上使用 Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit進行,每個樣本的總讀數深度為100 M。使用FastQC驗證讀取質量,并使用BBTools 包的Bbduk實用程序修剪引物。使用HISAT2 2.1.0進行讀取比對,使用 StringTie 1.3.6組裝和量化轉錄本。使用DESeq2 R包鑒定差異表達的基因。

1.4 統計學處理

數據采用SPSS 25.0統計軟件進行分析。每組實驗結果均重復3次。采用獨立樣本t檢驗對數據進行假設檢驗,檢驗標準:α=0.05。

2 結 果

2.1 NMNAT1敲除小鼠視網膜的整體代謝改變

LC-MS/MS分析顯示,NMNAT1敲除小鼠視網膜中共有39種代謝物的含量發生了顯著改變(P<0.05)。代謝物集富集分析發現多種不同生化途徑的均受到了不同程度的破壞,主要包括氨基酸代謝、糖酵解/糖異生、煙酸和煙酰胺代謝以及嘌呤代謝(圖1)。

A.代謝組學實驗方法的示意圖;B.NMNAT1敲除小鼠視網膜中顯著變化的代謝物的集富集分析圖1 代謝組學富集分析A.Schematic diagram of the experimental approach to metabolomics;B.Set enrichment analysis of significantly altered metabolites in the retina of NMNAT1 knockout miceFig 1 Metabolomics enrichment analysis

2.2 視網膜NMNAT1缺乏對NMNAT1通路的影響

NMNAT1敲除組小鼠視網膜總NMNAT1水平和煙酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD) 水平降低約 40%(圖2A)。NMNAT1和NaAD均是 NMNAT1 的催化產物(圖2B)。下游代謝物NADP和煙酰胺(NAM)的水平分別降低了約25%和55%,而NADH 的水平略有降低(P>0.05)(圖2A)。 NAD前體煙酰胺核苷(NR)和煙酰胺單核苷酸(NMN)在NMNAT1敲除組小鼠視網膜中的顯著積累(圖2A);色氨酸水平沒有顯著變化,色氨酸是這個時期從頭合成NAD的起點(圖2A)。

A.質譜法評估小鼠視網膜中 NMNAT1通路代謝物的相對豐度;B.哺乳動物NMNAT1合成途徑(NMNAT1催化的步驟以星號表示)圖2 NMNAT1敲除小鼠視網膜組織NMNAT1通路代謝物含量的變化A.The relative abundance of NMNAT1 pathway metabolites in the retinas of mice assessed by mass spectrometry;B.Mammalian NMNAT1 synthesis pathway(steps catalyzed by NMNAT1 were indicated with asterisk)Fig 2 Changes of the content of NMNAT1 pathway metabolites in the retinal tissues of NMNAT1 knockout mice

2.3 NMNAT1敲除組小鼠視網膜組織中的糖酵解、三羧酸循環和肌酐代謝的變化

NMNAT1敲除組小鼠視網膜中顯著改變的代謝物中富含與糖酵解、糖異生和瓦博格效應相關的代謝物(圖1B)。 對這些途徑的進一步檢查顯示上游糖酵解代謝物葡萄糖、葡萄糖6-磷酸(G6P) 和果糖1,6-二磷酸(F16BP) 的水平大幅升高,同時磷酸二羥丙酮(DHAP)和葡萄糖 3-磷酸(G3P) 的水平大幅降低(圖3)。這表明葡萄糖利用的中斷,與這種效應一致的是,在NMNAT1敲除組小鼠視網膜中,三羧酸循環中間體 α-酮戊二酸(a-KG) 和琥珀酸的水平降低了約30%(圖3)。NMNAT1敲除組小鼠視網膜中ATP循環代謝物磷酸肌酸和肌酸的水平降低,但差異無統計學意義(P>0.05)(圖3B)。

A.質譜法評估NMNAT1敲除組小鼠視網膜中糖酵解、三羧酸循環和肌酐代謝物的相對豐度;B.根據(A) 中代謝物變化著色的糖酵解/三羧酸循環途徑(二磷酸果糖酶催化的步驟用單星號表示, GAPDH催化的步驟用雙星號標記)圖3 NMNAT1敲除組小鼠視網膜組織糖酵解、三羧酸循環和肌酐代謝的變化A.Mass spectrometry was used to assess the relative abundance of glycolysis, TCA cycle and creatinine metabolites in the retinas of NMNAT1 knockout group mice;B.Glycolysis/tricarboxylic acid cycle pathway coloured according to metabolite changes in(A)(steps catalysed by fructokinase diphosphate were indicated with a single asterisk, whereas those catalysed by GAPDH were marked with a double asterisk)Fig 3 Changes of glycolysis, tricarboxylic acid cycle and creatinine metabolism in retinal tissues of NMNAT1 knockout group mice

2.4 NMNAT1敲除組小鼠視網膜糖酵解和三羧酸循環相關酶表達水平的變化

高通量mRNA測序分析顯示, NMNAT1敲除組小鼠視網膜中16種糖酵解和4種三羧酸循環酶的表達水平發生改變(圖4)。

圖4 NMNAT1敲除組小鼠(-/-)和對照組(+/+)糖酵解和三羧酸循環相關酶表達水平的熱圖Fig 4 Heat map of glycolysis and tricarboxylic acid cycle-related enzyme expression levels in NMNAT1 knockout mice(-/-) and controls(+/+)

2.5 NMNAT1敲除組小鼠視網膜組織磷酸戊糖途徑代謝物相對豐度的特異性改變

LC-MS/MS結果表明,NMNAT1敲除組小鼠視網膜組織中的赤蘚糖醇(Erythritol)水平顯著降低(P<0.05),提示戊糖磷酸途徑(PPP) 可能受到破壞(圖5)。這與NMNAT1敲除組小鼠視網膜組織中糖酵解通路的破壞和NMNAT1敲除組視網膜中 NADP水平的降低一致。

圖5 NMNAT1敲除組小鼠視網膜組織磷酸戊糖途徑代謝物相對豐度的特異性改變Fig 5 Specifically alteration of the relative abundance of pentose phosphate pathway metabolites in the retinal tissues of NMNAT1 knockout mice

3 討 論

NMNAT1在不同組織細胞中廣泛表達,并且其中許多突變會降低NMNAT1的催化活性或壓力相關穩定性[13-15], 目前已有超過30種NMNAT1基因突變被證明與Leber 先天性黑蒙和視錐視桿細胞營養不良有關[9-10,13-14,16-17]。但NMNAT1的突變很少會導致眼外表型[18],此外另外兩種 NMNAT 亞型(高爾基體相關 NMNAT2 和線粒體相關NMNAT3)均可在視網膜中檢測到但與失明無關[19],因此NMNAT1在視網膜中的作用備受關注。

此前有研究通過對光感受器中缺乏NMNAT1途徑酶NAMPT小鼠的研究,描述了視網膜中NMNAT1具有關鍵作用[6]。此外NMNAT1是迄今為止唯一與失明有關的NMNAT1途徑酶,因此NMNAT1異常導致的視網膜發育異常的機制有待進一步研究。最近已有幾項報告指出,視網膜NMNAT1部分或完全抑制時,小鼠在出生后第1周內開始出現視網膜變性,并在1個月大時基本完成視網膜變性[20],而小鼠中NMNAT1的整體缺失將導致小鼠在胚胎死亡[21]。目前的研究結果表明NMNAT1在視網膜中具有多種潛在的不同作用,體外研究表明 NMNAT1促進去乙?；腹δ芤源龠M視網膜祖細胞的存活[19],而成熟小鼠中NMNAT1的缺乏導致由NADase SARM1介導的光感受器快速死亡[22]。雖然這些研究表明視網膜 NMNAT1的多種功能超出其在氧化還原代謝中的典型作用,但這些功能重疊的程度以及動物模型和患者中NMNAT1相關視網膜營養不良嚴重程度的機制尚未被全面探索。

根據代謝組學結果可以推測出NMNAT1合成了視網膜總NMNAT1池中的約40%,這與之前的報道的模型[22]大致一致。糖酵解通量受損似乎是組織中NMNAT1耗竭的一個普遍特征,因為既往研究報告了投射神經元和骨骼肌肌管NAMPT抑制或缺失時,將導致GAPDH上游糖酵解代謝物的積累[23]。值得注意的是,Lundt等[23]提出了在NAMPT抑制的肌管中糖酵解通量逆轉的證據,因此我們認為這一效應可能解釋了我們模型中G3P和DHAP水平的下降。

除了糖酵解障礙,我們還檢測到NMNAT1基因敲除小鼠視網膜中嘌呤核苷酸和氨基酸代謝途徑的特異性缺陷。作為一種特別增生的組織,視網膜被認為高度依賴于足夠的核苷酸和氨基酸來支持細胞的轉錄和翻譯[24]。本實驗中的一些代謝變化,例如嘌呤前體黃嘌呤和氨基酸天冬氨酸的積累,似乎與NMNAT1不足或視網膜變性有更廣泛的聯系。另一方面,我們還確定了這些途徑中的一系列代謝變化,這些變化在NMNAT1基因敲除視網膜中尚未被報道,因此在未來的研究中有待進一步探索。

在這項研究中,我們通過生成和表征視網膜特異性NMNAT1敲除小鼠模型來研究 NMNAT1介導的NMNAT1代謝在視網膜中的作用。利用代謝組學和轉錄組學方法,我們證明了NMNAT1缺失會導致視網膜中嚴重的特異性代謝缺陷,并導致中央碳、嘌呤核苷酸和氨基酸代謝均受到損害,并且可能是導致嚴重視網膜變性的原因?？傮w而言,我們的結果揭示了 NMNAT1相關視網膜變性中以前未被重視的復雜性,為NMNAT1缺陷的視網膜特異性表現提供了可能的解釋,并為進一步研究視網膜中NMNAT1代謝奠定了基礎。