基于生物信息學分析兒童特發性血小板減少性紫癜的發病機制

周雪,陳團營,牛靜

(1.河南中醫藥大學 兒科醫學院,河南 鄭州 450000; 2.河南中醫藥大學第二附屬醫院 兒科,河南 鄭州 450002)

特發性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是自身免疫引起的出血性疾病。ITP在兒童中的發病率較高,每年每10萬兒童中有5～10人發病,并呈上升趨勢,在發病前期許多患兒無癥狀,血小板計數減少明顯[1-2]。對于有癥狀的患兒,出血是最常見的表現特征,可發生瘀點、紫癜和鼻出血等輕微出血或者是更嚴重的顱內、胃腸道或泌尿生殖系統等出血[3-4]。對于兒童ITP的治療目標一般集中在止血或預防出血,但是兒童自發性緩解的可能性較低,更容易出血[5]。目前一線治療方案主要包括糖皮質激素、靜脈注射免疫球蛋白以及生物制劑如利妥昔單抗等,但是最近的一項隨訪研究[6]提示某些特定的ITP患者亞組在使用利妥昔單抗時需要更加謹慎。Moulis等[7]發現ITP在2.4%的兒童中是繼發性的,其中原發性免疫缺陷是最常見的病因。繼發性ITP的病理機制差異很大,對感染的反應可能產生與血小板交叉反應的抗體,這在病毒性疾病或接種疫苗后的兒童ITP中常見。更有研究[8-9]顯示ITP與靜脈和動脈血栓形成以及疲勞和生活質量下降有關,具有比一般人群更高的死亡率,主要是由出血、感染、心血管事件和較高的血液病患病率造成的。由于基因與環境因素在人類常見疾病中的相互作用,我們需要一種更綜合的生物學方法來解決這些復雜性。因此,基于生物信息學所衍生的DNA微陣列技術是生物醫學研究的一項重要技術,它能夠同時識別數千個基因,甚至整個基因組。高通量數據的系統網絡分析是解釋生命科學重要意義的最有用的技術,在生物科學研究中至關重要。我們基于生物信息學分析兒童ITP的發病機制,報道如下。

1 資料與方法

1.1 差異表達基因(differential expression genes, DEGs)的篩選和獲取

檢索GEO(Gene Expression Omnibus database)數據庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),選擇“idiopathic thrombocytopenic purpura”或“immune thrombocytopenia”作為關鍵詞;“expression profiling by array”作為研究類型;種族選為“home sapiens”,選取ITP相關芯片數據集。 通過GEO2R(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)篩選ITP患兒和正常兒童之間的DEGs。將P<0.05和|Log fold change(FC)|>2.5設置為閾值。

1.2 基因本體論(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)分析

通過DAVID在線注釋、可視化和集成發現數據庫(https:∥david.ncifcrf.gov/)對DEGs進行GO注釋和KEGG通路富集分析,展示顯著富集結果圖。

1.3 蛋白質相互作用(PPI)網絡的構建以及核心基因的篩選

DEGs的PPI網絡構建和分析通過STRING在線數據庫(http:∥stringdb.org/)構建,并由Cytoscape軟件可視化。蛋白互作網絡中核心(Hub)基因(前10個)由CytoHubba插件計算獲得。

1.4 基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)

使用GSEA4.1.0軟件對ITP組和正常組進行GSEA分析,數據庫選擇c2.cp.kegg.v7.4. symbols.gmt[Curated],檢驗次數為1 000。以|NES|>1、P<0.05、FDRq<0.25為差異顯著。

1.5 免疫細胞浸潤(immune cell infiltration,ICI)分析

將獲取的ITP相關芯片數據進行ICI分析。采用CIBERSORT標準,以perm=1 000、P<0.05為篩選條件。

2 結 果

2.1 DEGs獲取

GSE46922數據集包含13個樣本,以P<0.05和|logFC|>2.5為篩選條件,獲得276個DEGs。其中上調的DEGs有191個,下調的有85個,并將|logFC|前20名上調和下調的差異基因的以熱圖形式展現,見圖1。

圖1 DEGs熱圖Fig 1 Heat map of differentially expressed genes

2.2 GO和KEGG分析

GO生物過程(BP)分析顯示,DEGs靶基因在細胞黏附及其負調控、細胞基質黏附力、肥大細胞激活的負調控、整合素信號通路以及細胞外基質組織等方面特別富集;GO細胞組分(CC)分析顯示,靶基因主要富集于早胞內體、血紅蛋白復合體、細胞表面及外區等方面;GO分子功能(MF)分析表明,靶基因在細胞外基質的結構組成、整合素結合、氧氣結合、氧轉運體活性等方面顯著富集。此外,KEGG通路分析顯示,DEGs靶基因顯著富集于在受體酪氨酸激酶的抑制劑、ErbB信號通路、蛋白質的消化吸收、Rap1信號通路、軸突導向、PI3K-Akt信號通路及補體及凝血系統等。見圖2、3。

圖3 KEGG分析氣泡圖Fig 3 The bubble chart of KEGG analysis

2.3 PPI網絡構建

將STRING數據庫構建的PPI網絡基因上傳至Cytoscape軟件,并使用Cytohubba插件篩選核心基因,獲取核心靶點基因有ITGB3、ARRB1、COL3A1、COL11A1、CFTR、HBB、ITGB5、KIFC1、CHEK1、MYBL2、DEPDC1、GTSE1等。見圖4。

圖4 DEGs的PPI網絡靶點Fig 4 PPI network target of DEGs

2.4 GSEA富集通路分析

GSEA富集通路分析顯示,顯著富集于神經活性配體-受體相互作用、黑色素瘤、細胞外基質受體相互作用、調節肌動蛋白細胞骨架、黏著斑等方面。見圖5。

圖5 GSEA富集通路分析圖Fig 5 The diagram of GSEA enrichment pathway analysis

2.5 ICI分析

ICI分析顯示,B細胞與靜息的記憶CD4+T細胞,激活的CD4+T細胞分別與中性粒細胞、M2巨噬細胞、單核細胞、激活的肥大細胞呈正相關,激活的肥大細胞分別與中性粒細胞、M2巨噬細胞、單核細胞呈正相關,調節性T細胞與激活的NK細胞、M0巨噬細胞、漿細胞也都呈正相關;CD8+T細胞與靜息的CD4+T細胞、激活的CD4+T細胞、中性粒細胞、激活的樹突狀細胞、激活的肥大細胞呈負相關,激活的樹突狀細胞與靜息的肥大細胞呈負相關。見圖6。

圖6 免疫細胞表達相對含量相關性分析Fig 6 The relative content correlation analysis of immune cell expression

3 討 論

兒童ITP的發病機制目前尚未明確,但是隨著測序技術和生物信息學的發展,可通過大數據基因差異分析來探究ITP的發病機制。本研究提取GSE46922中數據,進而篩選ITP與正常兒童之間的DEGs。最終篩選得到276個DEGs,其中上調的DEGs有191個,下調的有85個,上調明顯的有GRP180、IL-23R、LCORL等,下調明顯的有FOSL2、LDB2、NXF3等。研究[10-11]表明,IL-23R基因多態性rs1884444在隱性遺傳模型中與ITP易感性顯著相關,IL-23刺激記憶CD4+T細胞產生IFN-γ,激活巨噬細胞產生IL-1、TNF等促炎細胞因子,而且IL-23R是致病性Th17信號的關鍵組成部分,在細胞介導的免疫中發揮作用[12-13]。

GO和KEGG分析結果表明,ITP可能與細胞黏附及其負調控、血紅蛋白復合體、細整合素信號通路、細胞外基質組織等方面密切相關。Zeng等[14]使用抗αvβ3抗體預處理MKs,抑制黏附誘導的局灶性黏附激酶和原癌基因酪氨酸-蛋白激酶Src的磷酸化,發現針對整合素的自身抗體αvβ3通過阻礙MK遷移和黏附到血管生態位,加重ITP患者的血小板減少癥。此外,KEGG通路分析顯示,DEGs顯著富集于在受體酪氨酸激酶的抑制劑、ErbB信號通路、Rap1信號通路、軸突導向、PI3K-Akt信號通路及補體和凝血系統等。

Samira等[15]研究發現,ITP患者Notch通路被ErbB信號通路取代,從而表現出慢性期癥狀,而Notch信號通路與造血密切相關,涉及造血系統的進化產生造血干細胞以及T細胞等免疫細胞的發育。也有研究表明ITP的發病機制可能與PI3K-Akt信號通路介導的細胞凋亡有關,而且PI3K和Akt還是血小板中整合素αIIbβ3激活最重要的中介因子[16-17]。

通過構建PPI網絡,獲取的核心靶點基因有ITGB3、ARRB1、COL3A1、COL11A1、CFTR、HBB、ITGB5、KIFC1、CHEK1、MYBL2等。Nam等[18]研究發現,ITGB3在ITP中的表達明顯下調,ITGB3可以促使整合素受體αIIbβ3改變構象,使纖維蛋白原結合,在血栓收縮中起主要作用,并有助于增強血栓。通過GSEA分析,我們發現通路主要富集于神經活性配體-受體相互作用、黑色素瘤、細胞外基質受體相互作用、調節肌動蛋白細胞骨架、黏著斑等方面。有研究發現神經活性配體-受體相互作用和癌癥通路與ITP有著密切的聯系,可能與血小板生成素受體激動劑有關[19-20]。

ICI結果表明ITP患兒M2巨噬細胞和濾泡輔助性T細胞相對含量增加,激活的樹突狀細胞和靜息的記憶CD4+T細胞相對含量減少。研究表明巨噬細胞在ITP的免疫耐受擾動中活躍[21],尤其是在Fcγ受體激活與抑制的平衡紊亂中發揮重要作用。Chen等[22]研究發現,ITP患者的濾泡輔助性T細胞水平顯著高于正常對照組,其相關的趨化因子CXCL13和凋亡血小板水平異常高,表明濾泡輔助性T細胞可能成為評估ITP疾病過程的潛在生物標志物。

綜上所述,兒童ITP的發病可能是由于ITGB3、ARRB1、COL3A1、COL11A1、CFTR等基因的異常表達,通過神經活性配體-受體相互作用、整合素受體結合、細胞黏附調節等生物過程,以及介導ErbB和PI3K-Akt信號通路,從而造成免疫細胞的異常表達和血小板的減少。本研究從生物信息學角度對ITP發病機制進行探究,為臨床研究提供了一定的數據支撐,但是這里使用的數據集的樣本量不夠多。而且此次研究是僅基于公共數據庫的預測,還需要進一步的體內和體外實驗來驗證我們的分析,期待今后進一步研究論證。