鈣蛋白酶在TOCP誘導人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞自噬中的調節作用

石晟源, 肖雙, 胡澤慧, 龍鼎新

南華大學衡陽醫學院公共衛生學院 典型環境污染與健康危害湖南省重點實驗室,湖南衡陽 421001

三鄰甲苯基磷酸酯(tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)為一種有機磷酸酯類化合物,由于其暴露途徑多、毒性高及人類對其毒性作用認識不足,TOCP中毒事件在世界各地均有報道[1]。研究發現,自噬在TOCP誘導的神經毒性、生殖毒性中發揮關鍵作用[2],但確切作用機制并未完善。鈣蛋白酶系統主要由μ-鈣蛋白酶、m-鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制素構成。μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶都是鈣依賴性蛋白酶,均可被Calpastatin特異性抑制[3]。45Ca吸收試驗表明,TOCP增加了母雞腦突觸體對鈣的攝取[4],鈣通道阻滯劑維拉帕米(Verapamil)可消除TOCP增強的細胞器蛋白的磷酸化[5],而暴露于TOCP的母雞大腦表現出細胞溶質鈣濃度水平升高[6]。動物模型也證明,TOCP可激活鈣蛋白酶[7],線粒體自噬也與鈣蛋白酶相關[8]。因此,鈣蛋白酶可能與TOCP誘導的自噬機制相關。與未分化細胞相比,分化的SK-N-SH細胞的tau、MAP、神經絲蛋白表達顯著增加[9-10],本研究以未分化和分化的SH-SY5Y細胞作為實驗對象,探討鈣蛋白酶對TOCP誘導的自噬的調節作用,為揭示TOCP誘導的神經毒性機制提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞系來自中國科學院動物研究所(中國,北京)。DMEM培養基、全反式維甲酸(all-trans-retinoicacid,ATRA)、鈣蛋白酶抑制肽ac184-210(Calpastatin)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)、TritonX-100、鹽酸維拉帕米(Verapamil Hydrochloride)、TOCP、兔抗LC3多克隆抗體(L8918)、小鼠抗Beclin1單克隆抗體、小鼠抗β-肌動蛋白單克隆抗體購自Sigma公司(美國,圣路易斯)。熒光鈣蛋白酶底物Suc-LLVY-AMC(P-802)購自Enzolifesciences公司(瑞士,勞森)。2-APB購自阿拉丁公司(中國,上海)。HRP偶聯山羊抗小鼠IgG(H+L)和HRP偶聯山羊抗兔IgG(H+L)購自ZSGB-BIO公司(中國,北京)。

1.2 細胞培養和分化

SH-SY5Y細胞在含有10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM中培養,37 ℃、5%CO2飽和濕度下孵育,每2天更換培養基,每3～4天進行傳代培養。培養皿用錫箔紙包裹,用含10 μmol/L ATRA的DMEM培養基誘導細胞分化6天,使用倒置相差顯微鏡觀察細胞。如果細胞出現至少1個比細胞體長的突起,則認為細胞已分化,可被視為神經突。倒置顯微鏡隨機選擇視野測量至少100個細胞最長神經突的長度。

1.3 細胞處理和分組

分化和未分化的SH-SY5Y細胞用0～1.0 mmol/L TOCP處理12～48 h,用磷酸鹽緩沖鹽水(137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4、pH7.4)洗滌2次。分化和未分化細胞用20 μmol/L Verapamil或100 μmol/L 2-APB或20 μmol/L Verapamil+100 μmol/L 2-APB預處理15 min,然后用1.0 mmol/L TOCP處理48 h。分化和未分化細胞用1.0 mmol/L 3-MA預處理4 h或用500 nmol/L Calpastatin預處理6 h,然后用1.0 mmol/L TOCP處理48 h。Calpastatin和3-MA在使用前30 min溶解在DMEM中,其他試劑用DMSO溶解,細胞用0.4%DMSO處理作為對照組。

1.4 熒光分光光度法檢測鈣蛋白酶活性

先用20 μmol/L Verapamil或100 μmol/L 2-APB預處理15 min,然后用1.0 mmol/L TOCP處理48 h。然后,用含有1 mmol/L Na3VO4的冰冷PBS洗滌細胞2次,并在含有50 mmol/L HEPES(pH7.6)、150 mmol/L NaCl、1%TritonX-100、10 mmol/L 2-巰基乙醇、0.1 mmol/L PMSF和10 mg/L亮肽素的緩沖液中裂解30 min,4 ℃ 12 000 g/min離心15 min,留上清液,采用BCA法進行蛋白定量,將等體積的裂解物與50 μmol/L鈣蛋白酶底物Suc-LLVY-AMC在Hanks平衡鹽溶液中稀釋至200 μL,并在37 ℃下孵育15 min。加入100 μL 0.4 mol/L HCl終止反應,熒光分光光度計RF5301(日本島津公司)在380 nm和460 nm的激發和發射波長下測量熒光。使用BCA蛋白質定量試劑盒測定蛋白含量。為了計算相對鈣蛋白酶活性,將熒光增加率除以蛋白質濃度并歸一化為基礎活性。

1.5 Western blotting檢測自噬相關蛋白表達情況

細胞以1×107個/90 mm培養皿接種,在不存在或存在20 μmol/L Verapamil、100 μmol/L 2-APB、1.0 mmol/L 3-MA和500 nmol/L Calpastatin的情況下,用1.0 mmol/L TOCP處理48 h。Western blotting檢測細胞LC3和Beclin1水平。用冷PBS洗滌細胞2次,制備細胞提取物,在緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl、0.15 mol/L NaCl、1% TritonX-100、0.1%SDS、1%去氧膽酸鈉、1 mmol/L EDTA和1 mmol/L PMSF、pH7.4)中裂解30 min。將裂解物以14 000 g/min離心10 min,并使用BCA法測定蛋白含量。將裂解物(80 μg總蛋白)在15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳,然后轉移至Hybond ECL硝化纖維素膜并用一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。洗膜,加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000稀釋)孵育。使用標準ECL方法檢測蛋白質印跡。

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 未分化和分化的SH-SY5Y細胞

用含有10 μmol/L ATRA的DMEM培養基誘導細胞分化3天,觀察到SH-SY5Y細胞出現分化現象(圖1)。

圖1 顯微鏡觀察SH-SY5Y細胞(100×)

2.2 TOCP增加未分化和分化的SH-SY5Y細胞中鈣蛋白酶活性

未分化SH-SY5Y細胞在1.0 mmol/L TOCP處理24 h后,鈣蛋白酶活性開始顯著增加,分化細胞12 h后鈣蛋白酶活性即開始顯著增加;未分化和分化的SH-SY5Y細胞鈣蛋白酶活性均表現為濃度依賴性和時間依賴性增加(P<0.05,P<0.01;圖2)。

圖2 TOCP上調未分化和分化的SH-SY5Y細胞鈣蛋白酶活性a為P<0.05,b為P<0.01,與對照組比較。n=3。

2.3 鈣蛋白酶抑制劑緩解TOCP在未分化和分化的SH-SY5Y細胞中誘導的自噬

透射電鏡下,1.0 mmol/L TOCP處理48 h的SH-SY5Y細胞胞質中出現明顯自噬泡的形成,呈現聚集的空泡或液泡(藍色箭頭),提示TOCP確實能夠誘發SH-SY5Y細胞自噬的發生(圖3A)。實驗濃度下鈣蛋白酶抑制劑并不影響未分化和分化SH-SY5Y細胞的形態(圖3B)。1.0 mmol/L TOCP處理48 h后,未分化、分化的SH-SY5Y細胞LC3-II和Beclin1表達增加(P<0.01);Calpastatin可以部分降低TOCP在未分化、分化的SH-SY5Y細胞中誘導的LC3-II和Beclin1的表達(P<0.05,P<0.01;圖3C和D);表明TOCP誘導的自噬受鈣蛋白酶激活的調節。

圖3 鈣蛋白酶抑制劑緩解TOCP在未分化和分化的SH-SY5Y細胞中誘導的自噬A為SH-SY5Y細胞的超微結構(8 000×),藍色箭頭為自噬泡;B為鈣蛋白酶抑制劑對SH-SY5Y細胞形態的影響(100×);C和D分別為未分化和分化SH-SY5Y細胞LC3-II、Beclin1的表達。a為P<0.05,b為P<0.01,與DMSO組比較;c為P<0.05,d為P<0.01,與TOCP組比較。n=3。

2.4 鈣通道阻滯劑在未分化和分化的SH-SY5Y細胞中抑制鈣蛋白酶活性

與TOCP組比較,Verapamil和2-APB處理后,未分化和分化的SH-5Y5Y細胞均觀察到鈣蛋白酶活性顯著降低(P<0.01;圖4)。但Verapamil+2-APB+TOCP組并沒有較Verapamil+TOCP組和2-APB+TOCP組進一步降低(圖4)。這些結果表明,TOCP通過外部鈣流入和內質網釋放的鈣離子等鈣紊亂激活鈣蛋白酶活性。

圖4 鈣通道阻滯劑抑制TOCP誘導的SH-SY5Y細胞鈣蛋白酶活性上調a為P<0.05,b為P<0.01,與DMSO組比較;c為P<0.05,d為P<0.01,與TOCP組比較。n=3。

2.5 鈣通道阻滯劑調節TOCP在未分化和分化的SH-SY5Y細胞中誘導的自噬

圖5A為鈣通道阻滯劑作用下分化和未分化SH-SY5Y細胞的形態。在Verapamil預處理的未分化和分化SH-SY5Y細胞中,TOCP誘導的LC3-II表達完全抑制(P<0.01)。然而,2-APB并未降低TOCP誘導的LC3-II水平,未分化SH-SY5Y細胞的LC3-II表達與TOCP組比較無統計學意義;相反,在分化的SH-SY5Y細胞中,與TOCP組相比,LC3-II表達被2-APB顯著上調(P<0.01);在未分化和分化的SH-SY5Y細胞中,Verapamil+2-APB+TOCP組顯示出部分抑制作用(P<0.05;圖5)。以上表明TOCP誘導的細胞自噬可能與細胞內鈣紊亂導致鈣蛋白酶激活相關。

圖5 鈣通道阻滯劑調節TOCP在未分化和分化的SH-SY5Y細胞中誘導的自噬A為鈣通道阻滯劑作用下SH-SY5Y細胞的形態(100×);B和C分別為未分化和分化SH-SY5Y細胞LC3-II的表達。a為P<0.05,b為P<0.01,與DMSO組比較;c為P<0.05,d為P<0.01,與TOCP組比較。n=3。

3 討 論

TOCP在工業上應用廣泛,由于人們對其認識不足,TOCP中毒事件常有報道。TOCP的毒作用機制至今未能完全闡明,近年來,自噬機制作為研究熱點受到廣泛關注[11]。相關研究發現,TOCP可增加分化和未分化SH-SY5Y細胞的自噬活性[12-13],但TOCP如何誘導自噬的詳細機制仍未闡明。細胞在分化過程中形態和功能將出現一定的變化。本研究發現,TOCP處理導致鈣蛋白酶呈濃度和時間依賴性激活,分化細胞比未分化細胞對TOCP的處理更敏感,提前出現鈣蛋白酶升高,但在整體趨勢上并無統計學差異。

鈣蛋白酶在細胞周期、細胞骨架重塑、自噬、細胞凋亡等生理過程中發揮著重要調節作用[3],在異丙酚通過d-天冬氨酸受體抑制腫瘤壞死因子-α介導的海馬神經元自噬機制中,m-鈣蛋白酶發揮著關鍵作用[14]。自噬過程的發生主要包括自噬信號誘導、囊泡成核、自噬體延長封閉、自噬體與溶酶體融合并對底物進行降解[15],吞噬細胞膜擴張和ATG5與鈣蛋白酶切割相關[16]。研究發現,抑制鈣蛋白酶可恢復自噬活性并防止線粒體斷裂[17],鈣蛋白酶通過促進感染后的自噬調節CVB3誘導的病毒性心肌炎[18],鈣蛋白酶6在炎癥環境中也能抑制自噬[19],而缺血誘導的鈣蛋白酶1激活會損害溶酶體功能并抑制自噬體形成[20]。在神經退行性疾病的治療中,鈣蛋白酶抑制劑將受到重視[21],Calpain-1 C2L結構域肽已發揮抗氧化作用[22]。然而導致鈣蛋白酶活性變化的原因眾多,內源性蛋白Calpastatin作為Calpain 1和2的特異性抑制劑,已在研究中廣泛使用。3-MA是一種特異性自噬抑制劑,通過Ⅲ類PI3K通路抑制自噬體的形成,可顯著抑制TOCP誘導的LC3-II和Beclin1的表達。本研究中,3-MA處理作為抑制自噬的陽性對照,結果發現鈣蛋白酶抑制劑Calpastatin可以抑制未分化和分化的SH-SY5Y細胞中TOCP誘導的自噬水平,提示TOCP可以在未分化和分化的SH-SY5Y細胞中通過影響鈣蛋白酶活性而調節自噬。

同樣,由于鈣蛋白酶是鈣依耐性的,鈣蛋白酶活性增加可能是鈣水平升高和鈣蛋白酶抑制素豐度降低的結果[23],細胞鈣穩態將直接影響鈣蛋白酶的活性。而TOCP會擾亂細胞內鈣含量,鈣可以通過胞外流入細胞質。T型和L型鈣通道是質膜上電壓門控鈣通道,Verapamil通過抑制T型和L型鈣通道保護細胞器蛋白免受TOCP誘導的磷酸化[5]。鈣也可以由內部鈣儲存庫釋放進入細胞質,即可通過蘭尼堿受體和肌醇三磷酸(inositol triphosphate 3,IP3)受體激活而引起內鈣釋放增加。蘭尼堿受體鈣通道在心肌和骨骼肌中占主導地位,IP3受體不斷介導鈣從內質網釋放,而2-APB是一種IP3受體拮抗劑。研究發現,Piezo1介導細胞外Ca2+內流導致細胞內鈣過載,從而導致鈣蛋白酶的激活[24]。本實驗通過維拉帕米和2-APB阻斷鈣通道后發現,SH-SY5Y細胞鈣蛋白酶活性受到抑制。鈣是細胞信號轉導中重要一環。據報道,鈣信號可以調節自噬[25-27]。內質網中Ca2+的減少會激活鈣釋放激活鈣(Ca2+release activated Ca2+,CRAC)通道,導致胞外Ca2+內流,高濃度2-APB通過抑制CARC電流限制胞質鈣離子補充。當同時用Verapamil和2-APB預處理時,鈣蛋白酶活性未出現進一步下降,可能是由于在Verapamil和2-APB分別處理時,鈣蛋白酶活性已降至最低。上述結果表明,外部鈣流入和內部鈣儲存釋放所導致的胞質內鈣含量升高是TOCP誘導鈣蛋白酶激活的原因之一。自噬相關蛋白LC3-II的檢測結果提示,Verapamil可以抑制TOCP誘導的自噬。因此,鈣蛋白酶調節由TOCP誘導的自噬可歸因于通過電壓門控鈣通道的外部鈣流入。然而,2-APB在分化的SH-SY5Y細胞中增加了TOCP的自噬水平,可能是由于2-APB不是特異性IP3受體抑制劑,還能通過影響鈣庫操作的鈣通道和SERCA泵調節自噬。

綜上,TOCP通過調節電壓門控鈣通道和IP3受體鈣通道上調鈣蛋白酶活性,進而導致SH-SY5Y細胞自噬。