發酵纖維素陰離子衍生物的轉化與抗菌應用評價

崔艷麗，李順堯，張天宇，張敏燕，鮑祥祥，毛旸易

（1.浙江大學 化學系，浙江 杭州 310058；2.鄭州財經學院，河南 鄭州 450044；3.武漢大學，湖北 武漢 430072）

碳達峰碳中和是一個多維、立體、完整的系統工程。21 世紀已從“石油精煉”依賴向“生物精煉”時代開啟。纖維素是地球上最豐富的天然有機物，占植物界碳量的50%以上。纖維素由于具有可持續性、可降解性、生態協調性及多羥基衍生化能力強等特點廣受青睞，特別是對功能性纖維素衍生物的研究與開發。提取油脂后的米糠中大約含有50%纖維、20%蛋白質以及10%植酸鈣等。常見的纖維素結構修飾有物理修飾、化學修飾（硫酸化、磷酸化、乙?；龋┖蜕锕こ绦揎?。經生物改造后纖維素分子量和單糖的分布發生變化［1-2］。本文通過對發酵后的米糠纖維素進行化學改造，制備帶陰離子的纖維素衍生物，在文物保護、農產品保存、日常防護等中用于抗真菌。全世界有500 多萬種真菌，侵襲性霉菌問題日益嚴重，如文物保存中易受霉菌侵害，農作物在運輸、保存中由于受霉菌侵害被大量丟棄等，人類面臨變異微生物的劫難。以往用抗真菌劑進行接觸性消殺，對人體具有一定的毒性，且會引起微生物變異產生耐藥性。PERFECT［3］在抑制真菌途徑、靶點和作用機制的基礎研究中，對第1～第3 代抗真菌劑進行了總結，指出多糖衍生物是未來的抗菌劑前沿，其具有成膜性，能作為物理屏障阻礙病菌侵入，克服了現有技術的弱點，且對保護對象生態友好，易被接受；帶電荷的纖維素可通過其攜帶的電荷與微生物表面直接作用，由于其獨特的抗微生物途徑，不懼怕微生物的變異及不同的微生物品種來源，從而具有抑制微生物感染或直接殺傷微生物使其失去感染的能力［3-5］。

現有大多纖維素的衍生物反應條件有待提升，如利用離子液體、不易處理的DMSO 等有機溶劑、無機鹽混合物等，成本高、后處理麻煩、轉化率低等［6-10］。本文首次將經微生物改造的纖維素作為原料，在水相條件下采用陰離子醚化劑（3-氯-2-羥基丙磺酸鈉，CHPASA）通過一鍋法進行陰離子化，反應中使用的氫氧化鈉溶液既作為反應物，又作為溶劑，還具有催化劑作用；反應條件溫和，取代度適中，轉化率較高。采用元素分析、核磁共振、傅里葉紅外光譜（FTIR）等方法表征纖維素衍生物的組成和結構，并進行了抑真菌生物評估。纖維素陰離子衍生物具有可降解、生態環保、易接受等優點，可用于文保材料如皮革、紙張、石材等的抗菌保護；同時因其具有親和、低價等特點，可用于農產品的保存；在大范圍的防疫抗菌助劑等應用中亦具有潛力。

1 實 驗

1.1 主要儀器與試劑

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，上海），冷凍干燥器（FE-1A-50，上海），元素分析儀（vario MICRO cube，德國），紅外光譜儀（Nicolet iS 10，美國），核磁共振儀（Bruker Avance Ⅲ 500 MHz，德國）。發酵米糠（酵母發酵7 d，自制），3-氯-2-羥基-三甲基磺酸鈉（上海，分析純），氫氧化鈉（上海，分析純），鹽酸（上海，分析純），去離子水。

1.2 纖維素陰離子衍生物的制備

稱取干燥的發酵米糠1 g，置于燒瓶中，加入l4% NaOH 溶液18 mL，攪拌，隨后加入3-氯-2-羥基丙磺酸鈉。在一定溫度（室溫，50 ℃，70 ℃，90 ℃）下反應12 h，冷卻后用稀鹽酸溶液中和，用8 000 Da分子質量的透析袋透析48 h，冷凍干燥，稱重，放入干燥器備用。

1.3 元素分析與取代度

采用元素分析儀測試陰離子纖維素衍生物樣品中的含硫量（S%），推算陰離子基團取代度（DS）。DS 為纖維素大分子每個失水葡萄糖單元上被取代基團的平均羥基數。S%與DS 的關系為

1.4 紅外光譜與取代基團

干燥樣品在研缽中與KBr 混合研磨，壓片后在400～4 000 cm-1范圍進行FTIR 表征分析。

1.5 體外抑真菌活性評價

調整好菌懸液（選用黑曲霉、出芽短梗霉和嗜松青霉）的密度，并均勻涂布于凝結的平板培養基。先對標準濾紙（直徑6 mm）滅菌，分別蘸取一定濃度發酵纖維素陰離子衍生物Y1 的水溶液，風干后貼于平板表面，其中1 片為滅菌后的濾紙，用于空白對照，3 片為處理后的濾紙，在平板培養基上25 ℃下培養48 h，測定抑菌圈大小。

2 結果與討論

2.1 纖維素與CHPASA 反應

纖維素是由D-吡喃葡萄糖單元以β-1，4 苷鍵脫水而成的均多糖，具有復雜的四級結構。每個葡萄糖殘基上有3 個羥基，其中6 位上的屬于伯羥基，2，3位上的屬于仲羥基。一般情況下伯羥基的反應能力比仲羥基強，且具有空間位阻小的優勢；在氫氧化鈉作用下，陰離子醚化劑自身發生反應，即3-氯-2-羥基丙磺酸鈉的氯與鄰位的羥基形成環氧化合物，環氧化合物活性高，在堿性條件下迅速與纖維素發生親核取代反應，將陰離子基團引至纖維素羥基的氧原子上，獲得陰離子纖維素衍生物，具有綠色環保的特點，不需要有機溶劑，與醚化劑共同作用，便可打開纖維素的氫鍵網絡。同時發酵的纖維素，也會破壞一定的分子高級結構，去掉部分基團，從而使纖維素大分子羥基更易反應。

2.2 反應體系的選擇

纖維素大分子內部及分子之間存在氫鍵，難以在常規的溶液或熔融狀態下發生反應，因而其應用大受限制。已有報道認為，所有的有機溶劑、無機混合溶劑和離子液體等都是為了破壞其高級結構。進攻纖維素羥基的反應，首要的是破壞其氫鍵網絡。本文采用經酵母發酵7 d 的米糠纖維素，通過脫油、脫水獲得易參與反應的粗纖維；為方便后處理且降低成本，將一定濃度NaOH 溶液作為反應體系，在此體系中，NaOH 不僅可以作為溶劑，破壞纖維素的高級結構，而且可作為反應試劑，進攻CHPASA 的氯原子，同時可作為催化劑，去掉纖維素羥基中的氫，改變其環氧結構，使親核反應更易進行。實驗初期，體系為棕色分散液，隨著反應的進行，纖維素網絡被打開，得到半透明渾濁液，說明纖維素分子已遭其他分子攻擊，二級結構被破壞，得到新的纖維素衍生物分子，其形態亦由不透明的棕色固體原料變為淺黃色固體產物。陰離子醚化劑先生成反應活性強的環氧化合物，其實質就是用堿催化烷氧基進攻羥基形成醚。

圖1 纖維素結構與氫鍵分布［12］Fig.1 Cellulose structure and its hydrogen bond distribution

圖2 陰離子醚化劑與纖維素的反應Fig.2 Etherification of fermented cellulose with CHPASA

2.3 反應條件對取代度的影響

前期的探索實驗表明，反應溫度、反應體系的NaOH/CHPASA 物質的量之比、CHPASA/纖維素物質的量之比均可影響產物的反應取代度。反應時間取12 h。

溫度對纖維素衍生物取代度的影響結果見表1。由表1 可知，適當升高溫度，可加快分子的運動，有利于促進親核反應，提高取代度，但是溫度過高，醚化劑會產生副反應，不利于主反應的發生。

表1 溫度對陰離子纖維素取代度的影響Table 1 Effect of temperature on degree of substitution of anionic cellulose

一般情況下醚化劑的投料更多，因為1 個葡萄糖殘基有3 個未反應的羥基，CHPASA/纖維素物質的量之比為9，說明針對一個單糖殘基的1 個羥基有3 個醚化劑參與進攻反應；由表2 可知，一味增加CHPASA/纖維素物質的量之比，雖能提高取代度，但提高有限甚至有所減小，綜合考慮環保與成本，取CHPASA/纖維素物質的量之比為7。

表2 CHPASA/纖維素物質的量之比對陰離子纖維素取代度的影響Table 2 Effect of CHPASA/cellulose molar ratio on degree of substitution of anion cellulose

體系的酸堿度對反應影響很大，當堿性偏強時，醚化劑產生很多副產物，影響主反應。但需保持適當的堿性，以保證環氧的形成和羥基的去質子化。由表3 可知，當NaOH/CHPASA 物質的量之比為1時，取代度最高。

表4 纖維素陰離子衍生物Y1 的抑菌效果Table 4 Antifungal effect of cellulose derivative Y1

綜上，優化反應條件為反應溫度65 ℃，NaOH/CHPASA 物質的量之比1、CHPASA/纖維素物質的量之比7。

2.4 核磁共振圖

圖3 為纖維素陰離子衍生物Y1 的1H-13C NMR譜圖（溶劑：D2O，溫度：25 ℃），橫坐標為1H 化學位移，縱坐標為13C 化學位移。

圖3 發酵纖維素陰離子衍生物Y1 的二維NMR 譜圖Fig.3 2D 1H-13C NMR spectrum of cellulose derivative Y1

從圖3 中可看到，Y1 中有9 種碳，與氫譜的化學位移大小對應，并且是單取代；（5.31×10-6，99.33×10-6）處為葡萄糖單體異頭碳的化學位移［11］；相關點并不雜亂，貌似單糖產物的圖譜，說明經過發酵后纖維素更易反應，并且其大分子已展開，無其他基團存在；化學位移（3.10×10-6，53.73×10-6）處為與磺酸基連接的亞基，這充分說明已成功引入了陰離子醚化劑基團；其他7 個點的氫譜化學位移從3.49×10-6至4.20×10-6不等，碳譜化學位移從60.09×10-6至76.13×10-6分別為葡萄糖單元5 個碳與醚基上另外2 個碳的歸屬。

2.5 傅里葉紅外光譜圖

圖4 為400～4 000 cm-1的發酵纖維素與發酵纖維素陰離子衍生物的FTIR 譜。產物與原料比較，呈現了一些特異吸收峰。由圖4 可知，3 415.96 cm-1附近出現的較強吸收峰是由分子O—H 伸縮振動引起的；2 926.81 cm-1處出現的吸收峰由亞甲基伸縮振動引起；1 639.97 cm-1附近的峰為羥基與自由水形成的氫鍵吸收峰；這3 個吸收峰構成了多糖的特征吸收峰。在1 043.33 cm-1處，由C—O 伸縮振動產生；在615.94 cm-1附近有1 個S—O 特征吸收峰。核磁共振譜圖亦證明，纖維素與陰離子醚化劑反應后，帶陰離子的基團被成功引入大分子中。

圖4 發酵米糠纖維素陰離子衍生物Y1 與發酵米糠纖維素FTIR 譜圖Fig.4 Comparison of infrared spectra between cellulose derivative Y1 and fermented cellulose

3 抑制真菌實驗

抑制真菌實驗選定的含菌量約為1×107～2×107CFU·mL-1，纖維素陰離子衍生物Y1 的濃度為40 mg·mL-1。纖維素陰離子衍生物Y1 對3 種真菌的抑菌效果均表現為中敏，對黑曲霉的抑菌效果相對較強?？紤]纖維素陰離子衍生物Y1 具有生態、可降解等優勢，在文物保護、農產品儲存及長期抗疫防護等方面具有應用潛力。

4 結論

研究了發酵纖維素轉化為陰離子衍生物的綠色策略，得到的優化條件為反應溫度65 ℃，NaOH/CHPASA 物質的量之比1、CHPASA/纖維素物質的量之比7，獲得了取代度為0.65 的纖維素衍生物。通過元素分析、核磁共振、FTIR，表征了纖維素衍生物的結構。