羊肉風味基料的工藝優化及風味分析

劉慧 邢佳浩 范敏 王夢松 潘琳 魏超昆

摘? 要：以羊骨粉為原料，通過美拉德反應制備羊肉風味基料。采用二次酶解法對羊骨粉進行酶解后外加L-半胱氨酸、L-谷氨酸、D-木糖和葡萄糖進行美拉德反應，以褐變度、感官評價和色差為指標研究不同反應條件（反應溫度、加熱時間和初始pH值）對美拉德反應的影響，結合響應面試驗優化羊肉風味基料的加工工藝，采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用對該風味基料揮發性成分分析。結果表明：最佳生產工藝為2 g/100 mL L-半胱氨酸、3 g/100 mL L-谷氨酸、2 g/100 mL D-木糖和1 g/100 mL葡萄糖，反應溫度110 ℃、加熱時間50 min、初始pH 6.0；共鑒定出51 種揮發性物質，其中醛類14 種、醇類7 種、酮類6 種、酸類7 種、酯類3 種、醚類1 種、烴類7 種、含硫化合物3 種、雜環類3 種；能使羊肉風味基料產生肉香味的主要物質有（E）-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇、（E）-2-壬烯醛和（E，E）-2，4-癸二烯醛。

關鍵詞：羊骨粉；酶解；美拉德反應；羊肉風味基料；固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用

Abstract： Mutton-like flavoring base was prepared from sheep bone meal by Maillard reaction. Sheep bone meal was sequentially hydrolyzed by alcalase and flavourzyme and was subjected to Maillard reaction with L-cysteine， L-glutamic acid， D-xylose and glucose. The effects of different reaction conditions （heating temperature， time and initial pH value） on the browning degree， sensory evaluation and color difference of Maillard reaction products were investigated. The reaction conditions were optimized by response surface methodology （RSM）， and the volatile components of the flavoring base were analyzed by solid phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry （SPME/GC-MS）. The results showed that the optimal reaction conditions were as follows： L-cysteine concentration 2 g/100 mL， L-glutamic acid concentration 3 g/100 mL， D-xylose concentration 2 g/100 mL， and glucose concentration 1 g/100 mL， reaction temperature 110 ℃， heating time 50 min， and initial pH 6.0. A total of 51 volatile substances were identified in the flavoring base， including 14 aldehydes， seven alcohols， six ketones， seven acids， three esters， one ether， seven hydrocarbons， three sulfur-containing compounds and three heterocycles. The main substances contributing to the meaty aroma of the flavoring base were （E）-2-octenal， 1-octene-3-ol， （E）-2-nonenal and （E，E）-2，4- decadienal.

Keywords： sheep bone meal; enzymatic hydrolysis; Maillard reaction; mutton-like flavoring base; solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20221230-162

中圖分類號：TS201.2? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：

引文格式：

劉慧， 邢佳浩， 范敏， 等. 羊肉風味基料的工藝優化及風味分析[J]. 肉類研究， 2023， 37（5）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20221230-162.? ? http：//www.rlyj.net.cn

LIU Hui， XING Jiahao， FAN Min， et al. Optimized preparation and flavor analysis of mutton-like flavoring base[J]. Meat Research， 2023， 37（5）：? . （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20221230-162.? ? http：//www.rlyj.net.cn

我國是羊肉生產和消費大國，截至2022年，羊出欄量33 624 萬只，羊肉人均年消費量高達18.80 kg，約占全球1/3[1-2]。羊骨是畜產品加工過程中重要的副產品，營養豐富[3]，含有維持人體所必需的營養物質。羊骨中的膠原蛋白約占體內總蛋白的30%[4]，可促進代謝，延緩機體衰老[5]。膠原蛋白是三螺旋結構，不易被機體吸收利用，所以可對羊骨粉進行水解，增加其生物利用度，不僅可以獲得較多的游離氨基酸和多肽，而且可以促進鈣、磷等無機鹽離子的釋放，大大提高其營養價值[6]。張琪等[7]以羊骨粉為原料，利用雙酶水解法對羊骨粉的工藝進行研究；馮雅蓉等[8]制備出降血壓活性較高的羊骨肽；李曉葉等[9]以羊骨粉為原料，利用堿性蛋白酶酶解制備具有抗氧化活性的酶解多肽液，為制備羊肉風味基料提供了技術參考。王雪琦等[10]以酶解-發酵法制備羊骨膠原蛋白肽-鈣螯合物，對其結構表征和穩定性進行分析，為開發新型鈣補充劑和促進羊骨的利用提供了理論依據。因此，利用禽骨開發新型、天然和綠色的營養食品及食品添加劑，提高肉品加工企業的綜合效益，具有廣闊的應用前景。

風味基料可以賦予食品良好的色、香、味，從而提高食品的感官品質。隨著生活水平的提高，消費者對于風味基料的品質要求越來越高。以往那些成分單一、口感單一的傳統風味基料不能滿足消費者的需求，而以動物骨或肉原料，通過現代加工技術制備的具有特殊風味、營養價值高、方便等優點的食品風味基料深受消費者喜愛[11-12]，因此復合風味基料的制備工藝研究逐漸成為行業熱點。很多研究以羊骨為原料，通過酶解法對羊骨進行預處理，利用美拉德反應制備羊肉風味基料[13-14]。張婷等[15]通過固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用（solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）和電子舌對制備的羊肉復合風味基料進行分析，確定美拉德反應可以增強復合風味基料的整體風味。因此，羊骨風味基料對獲得高附加值的產品具有重要意義。

本研究將羊骨粉進行二次酶解，外加L-半胱氨酸、L-谷氨酸、D-木糖和葡萄糖高溫制備羊肉風味基料，通過單因素試驗和響應面試驗進行反應工藝優化，對反應產生的風味物質進行SPME-GC-MS分析，從而制備出羊肉香味突出的風味基料。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料與試劑

羊骨粉? ?青島佰旭食品有限公司；風味蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶、胰蛋白酶? ?廣州嘉業食品配料有限公司；L-半胱氨酸、L-谷氨酸、D-木糖? ?上海麥克林生物有限公司；葡萄糖? ?天津市大茂化學試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2? ?儀器與設備

PHSJ-3F pH計? ?上海雷磁儀器有限公司；PL203電子天平? ?梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ZNCL-GS190*90集熱式磁力攪拌器? ?鞏義市科瑞儀器有限公司；UV1901分光光度計? ?上海奧析科學儀器有限公司；8860-5977B氣相色譜-質譜聯用儀? ?美國安捷倫公司；L550高速離心機? ?湘儀離心機儀器有限公司；WSF分光測色儀? ?上海儀電物理光學儀器有限公司；HH-1水浴鍋? ?常州國華電器有限公司。

1.3? ?方法

1.3.1? ?羊骨素酶解液的制備

1.3.1.1? ?一次酶解法

參照余江泳等[16]的方法制備。準確稱取羊骨粉樣品，加入一定量的水，按表1條件進行酶解，水浴1 h后，升溫至90 ℃水浴滅酶10 min，制得4 種酶解液。

1.3.1.2? ?二次酶解法

參照詹萍等[13]的方法。稱取羊骨粉樣品，加入一定量的水，按表2的酶解條件先調至堿性蛋白酶的最適酶解條件進行酶解，后再調至風味性蛋白酶的最適酶解條件二次酶解，酶解完畢，于90 ℃水浴滅酶10 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心20 min后取上清液待用。

1.3.2? ?羊骨粉水解度的測定

參照韓克光等[17]的方法。二次酶解液4 000 r/min離心20 min，進行水解度測定。游離氨基酸采用甲醛滴定法進行測定[18]?？偟坎捎脛P氏定氮法進行測定[19]。

1.3.3? ?美拉德反應

在預實驗的基礎上，以50 mL羊骨二次酶解液為反應底物，添加2 g/100 mL L-半胱氨酸、3 g/100 mL L-谷氨酸、2 g/100 mL D-木糖和1 g/100 mL葡萄糖[20-21]，在不同反應溫度、初始pH值及反應時間條件下進行單因素試驗，以褐變度、色差及感官評分為指標。

1.3.3.1? ?溫度對褐變度、感官評分和色差的影響

取酶解液50 mL，初始pH值為6，反應時間50 min，研究不同反應溫度（80、90、100、110、120 ℃）對褐變度、色差及感官評分的影響。

1.3.3.2? ?初始pH值對褐變度、感官評分和色差的影響

取酶解液50 mL，反應時間50 min，反應溫度100 ℃，研究不同初始pH值（4、5、6、7、8）對褐變度、色差及感官評分的影響。

1.3.3.3? ?加熱時間對褐變度、感官評分和色差的影響

取酶解液50 mL，初始pH值為6，反應溫度100 ℃，研究不同加熱時間（30、40、50、60、70 min）對褐變度、色差及感官評分的影響。

1.3.4? ?褐變度的測定

參照Chen Kangni等[22]的方法，將美拉德反應液稀釋50 倍，于420 nm波長處測定吸光度。

1.3.5? ?色差的測定

參考Chen Xiao等[23]的方法稍加修改。將反應液倒于比色皿中，用分光光度計測定亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。每個樣品測定3 次，取平均值。

1.3.6? ?感官評價

挑選15 名（其中8 名男性、7 名女性，年齡20～40 歲）具有食品專業基礎的人員對樣品進行感官評價[24]，采用盲評的方式評價，最終結果取平均值。感官評價標準見表3。

1.3.7? ?響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以反應時間、反應溫度、初始pH值為響應因素，感官評分為響應值進行響應面試驗設計，響應面試驗設計因素和水平見表4。

1.3.8? ?揮發性化合物的測定

1.3.8.1? ?SPME

參照丁曄等[25]的方法，修改如下：取5 mL樣品加入20 mL頂空瓶中，通過CAR/PDMS纖維頭對每個樣品進行SPME，樣品在50 ℃平衡10 min，頂空吸附20 min，待GC-MS分析。

1.3.8.2? ?GC-MS條件

GC條件參照張同剛等[26]的方法，修改如下：色譜柱HP-5MSUI毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm），進樣口溫度250 ℃，柱初溫40 ℃，保持2 min，40～100 ℃升溫速率為2 ℃/min，100～150 ℃升溫速率為4 ℃/min，保持2 min，150～280 ℃升溫速率為20 ℃/min；用氦氣作為載氣，流速1.0 mL/min，不分流。

MS條件參照Wei Chaokun等[27]的方法，修改如下：電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；質量掃描范圍40～450 u，全掃描模式。

1.4? ?數據處理

實驗均重復3 次，結果取平均值±標準差。采用Excel 2020軟件進行數據處理分析，SPSS 26.0軟件進行方差分析和顯著性檢驗（Duncans檢驗，P＜0.05），采用Design Expert 11.0軟件進行Box-Behnken響應面優化試驗設計。

2? ?結果與分析

2.1? ?不同單酶對水解度的影響

在酶解過程中，蛋白質被水解為多肽和氨基酸，可以提高美拉德風味。不同蛋白酶由于酶切位點不同，所以蛋白質被水解的程度不同[28]。由圖1可知，水解度隨著時間的延長而增加，2～4 h水解度增加比較明顯，4 種蛋白酶在4 h后水解度呈緩慢上升趨勢，5 h后胰蛋白酶水解度趨勢增加緩慢，這可能是由于隨著水解時間的延長，酶的活性會受到損失，同時底物的減少及產物的增加會造成對酶的反饋抑制作用增強，從而使得酶的水解速率下降[29]。

在一次水解的基礎上，選取風味蛋白酶和堿性蛋白酶2 種水解效果較好的酶進行二次酶解。二次酶解法的優點在于可以使2 種酶分別在各自的最優條件下進行水解，從而最大限度提高羊骨粉的水解度。先將羊骨酶解液調至堿性蛋白酶的最適反應條件進行水解，然后再調至風味蛋白酶的最適反應條件進行水解[30]。

由圖2可知，在堿性蛋白酶水解5 h后加入風味蛋白酶使其水解速率提高，水解至8 h后水解度達到最大，為40.25%，相比于單酶水解，其水解度提高。堿性蛋白酶屬于內切酶的一種，對肽鍵兩端發生的氨基酸水解產生大量疏水鍵，從而導致酶解液產生苦味，不利于后續產品的制備。先使用堿性蛋白酶酶解樣品后，再使用外切酶風味蛋白酶酶解，酶解液帶有骨香味，苦味降低，且經堿性蛋白酶酶解后酶解液pH值約為6.8，接近風味蛋白酶的最適pH值，可避免二次調節pH值[30]。綜合考慮，實驗選用堿性蛋白酶和風味蛋白酶對羊骨粉進行二次酶解。

2.2? ?單因素試驗結果

2.2.1? ?反應溫度對美拉德反應的影響

由圖3可知，隨著反應溫度的提高，美拉德體系褐變度呈顯著上升的趨勢。在80～100 ℃，溫度對美拉德反應的影響十分顯著，隨著溫度的上升，酶解液中的羰基化合物和氨基化合物迅速發生反應產生類黑精類物質，使得體系褐變度迅速上升[31]。當溫度上升到100 ℃以后時，褐變度的上升速率略微下降，體系吸光度上升較緩慢，這可能是由于體系中反應物消耗殆盡的緣故。

由圖4可知，隨著反應溫度的上升，感官評分先上升后下降，在110 ℃時感官評分達到最高。這是因為在較低的溫度時，氨基酸和還原糖反應不充分，產生具有肉香味的風味物質較少。隨著溫度的升高，半胱氨酸、木糖、谷氨酸熱降解形成具有揮發性的物質，從而形成肉味[32]。當高于110 ℃時，美拉德反應產生焦糊味，可能是由于反應溫度升高使得美拉德反應劇烈，從而產生一些不良風味物質[33]。

由圖5可知，隨著溫度的上升，L*逐漸下降，體系的亮度逐漸變暗，說明隨著反應溫度的增加，美拉德反應越來越劇烈，產生了大量有色物質，這與褐變度的測定結果相符。a*先下降后上升，于100 ℃時達到最低，說明紅色度先下降后上升。b*逐漸上升，說明黃色度逐漸上升。綜合反應溫度對體系褐變度、感官評價及色差的影響，加熱溫度在100～120 ℃最佳。

2.2.2? ?初始pH值對美拉德反應的影響

由圖6可知，隨著初始pH值的上升，褐變度呈顯著上升趨勢，說明美拉德反應越來越劇烈，這表明偏酸性的環境不利于美拉德反應的進行，而偏堿性的環境有利于美拉德反應的進行，且堿性越強，反應越劇烈[34]。

由圖7可知，隨著初始pH值的上升，感官評分先增加后下降，初始pH值為6時達到最高值。研究[35]表明，在較低pH值條件下，多肽和游離氨基酸的氨基會發生質子化，從而阻礙美拉德反應的進行，使得產生的風味物較少；pH值較高時，美拉德反應劇烈，產生的風味化合物容易發生環化反應，生成雜味物質，導致美拉德反應感官評分降低。

由圖8可知，L*隨初始pH值的上升呈下降趨勢，體系色澤逐漸變暗。a*和b*呈逐漸上升趨勢，即紅色度和黃色度逐漸增加，可能是由于堿性環境加快了美拉德反應中深色物質的形成，在初始pH值較高時，體系顏色渾濁無亮度，考慮到亮黃色的物質更容易為人所接受，綜合以上分析，初始pH值在5～7時最佳。

2.2.3? ?反應時間對美拉德反應的影響

由圖9～10綜合分析可知，反應時間達到50 min時，感官評分最高，反應時間低于或高于50 min時，感官評分均下降。這是由于短時間反應，美拉德反應不充分，產生的風味物質較少；而長時間反應，會導致產生的類黑素發生環化，生成吡啶等含氮化合物，產生的糊味和硫臭味會掩蓋產生的肉香味[36]。

由圖11可知，隨著反應時間的延長L*逐漸下降，說明體系的亮度逐漸變暗，a*和b*呈先下降后上升的趨勢，即紅色度和黃色度先下降后上升，分別于50 min和40 min達到最低。綜合褐變度、感官評價及色差相關測定結果，反應時間在40～60 min最佳，此時制得的產品晶瑩透明、呈亮黃色。

2.3? ?響應面試驗優化結果

2.3.1? ?優化試驗結果及分析

在單因素試驗的基礎上，用Design Expert 11.0軟件對反應時間、反應溫度和初始pH值進行的Box Behnken響應面試驗設計及結果如表5所示。對實驗數據進行多元回歸擬合，得到感官評分對反應時間（A）、反應溫度（B）、初始pH值（C）的二次回歸方程為：Y=16.08＋00.29A＋0.40B＋1.11C－1.03AB＋0.55AC－0.77BC－3.19A2－2.02B2－1.89C2。

由表6可知，模型P＜0.01，說明該模型極顯著。根據均方項可知，影響美拉德反應產物感官評價的因素按重要性進行排序為初始pH值（C）＞反應溫度（B）＞反應時間（A），并且初始pH值（C）對模型有極顯著影響（P＜0.01）。失擬項P=0.44＞0.05，說明未知因素對模型的影響較小。該模型R2=0.972 7，說明該模型能夠解釋97.27%的響應模型變化。同時該模型的RAdj2=0.937 6，RPre2=0.777 2，二者的差值小于0.2，說明模型與實驗擬合程度較好，可以用此模型來進行預測分析。

2.3.2? ?不同因素交互作用分析

響應面圖是響應值與兩交互因素構成的3D曲面圖，曲面圖的陡峭程度可用來反映因素交互作用對響應值的影響，曲面越陡，說明該因素對感官評分的影響越顯著。等高線趨近于橢圓則表示兩因素間交互作用顯著。由圖12可知，AB、AC對羊肉風味基料感官評分影響交互作用明顯，AC之間交互作用不明顯。

2.3.3? ?參數優化及驗證實驗

用Design Expert 11.0軟件對試驗結果進行響應面優化，得到羊肉風味基料的最佳工藝參數為反應溫度110.44 ℃、加熱時間50 min、初始pH值6.28，在此條件下羊肉風味基料感官評分最高，為16.25 分。為了便于操作，實際工藝參數為反應溫度110 ℃、加熱時間50 min、初始pH值6.0，按照優化后的實際工藝進行重復驗證，所得的感官評分測定值與預測值的相對偏差小于5%，說明該工藝條件具有可行性。

2.4? ?羊肉風味基料揮發性成分分

優化后的羊肉風味基料進行SPME-GC-MS分析，結合NIST數據庫鑒定，確定羊肉風味基料香氣化合物，選出匹配率較高的物質[37]。由表7可知，該調味基料共檢測出51 種揮發性成分，其中醛類14 種、醇類7 種、酮類6 種、酸類7 種、酯類3 種、醚類1 種、烴類7 種、含硫化合物3 種、雜環類3 種。醛類化合物閾值一般較低，可能形成羊肉的特征風味物質，如檢測出產生具有獨特肉香風味的（E，E）-2，4-癸二烯醛和（E）-2-壬烯醛[38]，這可能是脂質降解后與美拉德反應相互作用產生的[39]，（E，E）-2，4-癸二烯醛逆羥醛縮合反應可以產生其他烯醛類物質，如檢測出具有肉香味的（E）-2-辛烯醛[40]；醇類物質風味閾值與醛類相比較高，如檢測出與肉味形成相關的1-辛烯-3-醇；酮類物質的閾值一般較高，所以其對羊肉風味的影響較小[38]，本實驗中檢出有肉香的2-庚酮；酸類物質中正辛酸、丁酸和2-甲基丁酸是形成肉香味的重要物質；酯類物質的閾值較低，常溫下易揮發，賦予食物一定的香氣，但對羊肉風味的形成作用較??；烴類化合物閾值較高，對羊肉風味的貢獻一般不大，但部分烴類可以進一步形成雜環芳烴，對風味形成有一定作用；含硫化合物的存在使風味基料具有一定的羊肉香味，這是由于半胱氨酸通過Strecker降解產生硫化氫等物質，通過美拉德反應進一步生成具有香氣的風味物質。

3? ?結? 論

通過對比一次酶解法和二次酶解法對羊骨粉的水解度，發現采用堿性蛋白酶和風味蛋白酶進行二次酶解的效果優于單酶。以羊骨酶解液為原料通過美拉德反應制備羊肉風味基料的最佳工藝參數為：2 g/100 mL L-半胱氨酸、3 g/100 mL L-谷氨酸、2 g/100 mL D-木糖和1 g/100 mL葡萄糖，反應溫度110 ℃、加熱時間50 min、初始pH值6.0。在此條件下得到整體風味良好的羊肉風味基料，感官得分為16.25 分。對該風味基料進行SPME-GC-MC揮發性成分分析，共檢測出51 種揮發性物質，其中（E）-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇、（E）-2-壬烯醛和（E，E）-2，4-癸二烯醛對羊肉風味基料的產生有重要作用。

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