三葉青質量控制方法研究進展

伍婷 李振斌 杜家會 李茂凱 姚天月 崔玉發

【摘要】目的：綜述三葉青質量控制研究進展，為進一步完善三葉青藥材質量控制提供參考。方法：查閱目前關于三葉青質量評價的文獻，并對其進行整理和歸納。結果：目前關于三葉青質量控制研究主要涉及性狀鑒定、顯微鑒別、活性化學成分的含量測定及指紋圖譜研究。結論：雖然已有關于三葉青真偽辨別和質量好壞的評價研究，但目前質量優劣的評價僅憑一種或幾種化學成分的含量測定，不能真正控制其質量，對三葉青質量評價進行綜述，為進一步完善三葉青質量控制奠定基礎，促進三葉青藥用資源標準化、合理化的開發和利用。

【關鍵詞】三葉青；質量控制；黃酮類；多糖；酚類

【中圖分類號】R282.6【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）09-0049-06

Research Progress on Quality Control Methods of Tetrastigma HemsleyanumWU TingLI ZhenbinDU JiahuiLI MaokaiYAO TianyueCUI Yufa

Southwest Vocational and Technical College for Nationalities，Xingyi 562400，ChinaAbstract：Objective By summarizing the research progress on quality control of Tetrastigma hemsleyanum Diels，it provides reference for the quality control of Tetrastigma hemsleyanum.Methods By referring to the current literature on quality evaluation，it sorted out the research progress of quality control of Tetrastigma hemsleyanum.Results At present，the studies on quality control of Tetrastigma hemsleyanum mainly include character identification，microscopic identification，content determination of active components and fingerprint analysis. Conclusion There have been some studies on the identification and quality evaluation of etrastigma hemsleyanum，but the quality evaluation depends only on the content determination of one or several chemical components，which can not really control its quality.This paper summarizes the quality control of Tetrastigma hemsleyanum，which lays a foundation for further improving the quality control of Tetrastigma hemsleyanum，and promotes the standardization and rationalization of the development and utilization of medicinal resources of Tetrastigma hemsleyanum.

Keywords：Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg；Quality Control；Flavonoids；Polysaccharide；Phenols

三葉青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）又名金線吊葫蘆、蛇附子、石老鼠、絲線吊金鐘、石猴子等，為葡萄科三葉崖爬藤屬植物，多年生常綠草質藤本［1］。主要分布于浙江、福建、江西、廣東、廣西、四川、湖南、四川、云南和貴州等地，常生長在蔭蔽的山谷、林間等腐殖質較高的地方［2-3］。三葉青藥用價值很高，全株可入藥，以地下塊根和果實藥用效果較好，具有清熱解毒、祛風化痰、活血止痛等功效，在民間常用于治療小兒高熱驚風、百日咳、瘡癰痰核、毒蛇咬傷、急慢性肝炎和黃疸等疾病，素有“植物抗生素”的美譽［4-7］。三葉青的化學成分十分豐富，目前分離到成分主要為黃酮類、多糖類、酚酸類、萜類及甾體類、揮發油類等，黃酮、酚酸和多糖為其主要的活性成分［8］?，F代藥理學研究［9-14］表明，三葉青具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗肝損傷、調節免疫等藥理活性，被廣泛應用于藥品和保健品中，如華佗風痛寶、金絲地甲膠囊、結石康膠囊等，此外，三葉青還用于中西醫結合治療新冠肺炎的方劑中［15］。目前藥用三葉青主要來自于野生，而自然條件生長緩慢，加上人們過度采摘，野生三葉青已無法滿足人們的需求甚至瀕臨滅絕［16］。雖然三葉青的用途十分廣泛，藥用價值很高，但是目前2020版《中國藥典》未收載三葉青?，F對目前三葉青質量控制研究現狀進行概括，為進一步完善三葉青質量控制奠定基礎，從而促進三葉青藥用資源規范化、標準化和合理化的開發和利用。

1性狀鑒別

三葉青塊根呈紡錘形、軟圓形、葫蘆形或橢圓形，單枚或數枚連呈珠狀一般長1～7 cm，直徑0.3～4.2 cm。表面褐色、棕色，多數較光滑，或有皺紋，少數呈皮孔狀的小瘤狀突起，有時還有凹陷，其內殘留褐色細根。質硬且脆，斷面平坦而粗糙，類白色或灰棕色，可見棕色形成層環，氣辛、味甘［17-18］。三葉青分布較廣，因產地不同，塊根大小上略有差異［19］。

2顯微鑒別

三葉青藥用價值十分廣泛，尤其在抗腫瘤方面有很好的效果，導致市場需求量大，價格居高不下，很多不良商家將外觀相似的烏頭類植物子跟的生品混在三葉青塊根飲片謀取利益，尤其打成藥粉后更加難以鑒別，而顯微鑒別是藥材粉末鑒別常用的手段之一。三葉青塊根粉末一般微黃至紅棕色，木栓細胞深黃棕色；淀粉粒極多，以單粒為主，橢圓形，類三角形，類圓形；有具緣紋孔導管；草酸鈣簇晶和針晶存在于黏液細胞或散開 ［20］。如圖1所示。

3三葉青薄層色譜研究

崔偉亮等［20］建立了薄層色譜法鑒別三葉青的方法。三葉青塊根粉末用乙醇加熱回流充分提取，過濾，濾液蒸餾去除乙醇，用石油醚洗滌2次后用乙酸乙酯提取，合并提取液，蒸干后用乙醇溶解配成供試液。以蘆丁為對照品，乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）作為展開劑，三氯化鋁（AlCl3）試液作為顯色試劑，置于紫外燈365 nm處，供試樣品和對照品薄層色譜均在相應位置顯示相同顏色的熒光斑點。周煜恒等［21］ 以葒草苷、異葒草苷、牡荊素等黃酮成分作為對照品，展開劑為乙酸乙酯-甲酸-甲苯-水（8∶1∶1∶1），3% 的AlCl3溶液作為顯色劑，于紫外燈365 nm下檢視，發現在薄層色譜中三葉青片劑供試品與對照品在相應位置上呈現相同顏色的斑點。薄層色譜分離效果較好、斑點清晰，可用于三葉青的定性鑒別。

4比色法測定三葉青總黃酮含量

黃酮及其苷類是三葉青的重要的活性成分，其塊根、莖、葉中均含有豐富的黃酮類活性成分，具有保肝抗炎、抗腫瘤、調節免疫等藥理活性，是目前三葉青中研究較為系統深入的一類化合物［22-24］ 。林婧等［25］ 建立了比色法測定三葉青總黃酮含量的方法，三葉青塊根經粉碎后加入適量甲醇，超聲提取約30 min后放冷至室溫，過濾后即制成三葉青甲醇提取液，依次加入5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、10%氫氧化鈉溶液，以蘆丁為對照品，于500 nm處測定吸光度。該方法準確、簡便、快速、重現性好，適用于三葉青藥材總黃酮的含量測定。阮明穎［26］用該方法測定不同產地三葉青莖葉及塊根中總黃酮含量，發現總黃酮含量在不同產地、相同產地不同樣品間均存在差異，莖葉部分總黃酮含量以浙江麗水產區最高，可達（46.9±3.8）mg/g，云南、貴州、重慶等地區含量較低；塊根部分總黃酮含量以廣西田林產區的最高，達（40.1±3.9）mg/g，同樣的云南、貴州、重慶等地區含量偏低。

5高效液相色譜法測定三葉青黃酮

何曉麗等［27］ 建立了以蘆丁、異槲皮苷等6種指標成分，同時測定不同產地三葉青塊根中這6 種黃酮含量的HPLC法，發現不同產地的三葉青樣品中6中黃酮類成分在含量上存在差異。于虹敏等［28］ 采用超快速液相色譜-光電二極管陣列檢測器法（UFLC-DAD），同時測定三葉青藥材塊根中原花青素B1和兒茶素的含量，用于浙江、福建不同產地三葉青的質量評價。三葉青黃酮類有效成分的研究多集中于塊根部位，且多為非碳苷類黃酮，而鄧思珊等［29］ 采用超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）對三葉青葉化學成分進行鑒定，檢測到碳苷黃酮成分葒草素類和牡荊素類，運用HPLC進行含量測定發現不同產地三葉青葉子中碳苷組成與含量差異較大，甚至有的樣品中檢測不到碳苷類黃酮。許文等［30］ 建立了10種三葉青黃酮類成分HPLC含量測定方法，并測定了30批不同產地野生或人工栽培的三葉青塊根中10種不同黃酮的含量，三葉青藥材來源及測定結果見表1。高效液相色譜法測定黃酮含量快速簡便、準確可行、重現性好，可作為中藥材三葉青質量評價的有效方法。

6三葉青HPLC指紋圖譜研究

中藥組分是一個復雜體系，HPLC指紋圖譜能較為全面反映藥材中化學成分的種類及含量，有利于中藥質量的整體評價，對于提高中藥質量具有重要意義。程林等［31］ 應用HPLC對三葉青塊根進行色譜指紋圖譜研究，以β－谷甾醇作為參照峰，標定了7個共有特征峰，通過對比10批不同三葉青樣品色譜圖進行相似度分析，相似度在0.823 ～ 0.928之間，推測造成差異的原因可能是產地、氣候、土壤、種植方式等導致在化學成分方面存在差異。范世明等［32］ 采用超高效液相建立了三葉青葉指紋圖譜研究，以牡荊苷作為參照峰，共標定了15個共有峰，其中12個共有峰與標品進行比對鑒定，并通過相似度分析評價41批三葉青樣品的相似度均達到0.9以上，通過對比文獻發現三葉青葉與塊根的指紋圖譜存在較大差異，且三葉青葉指紋圖譜相似度高于塊根。張曉芹等［33］ 通過HPLC建立的三葉青飲片指紋圖譜共有模式，標定了7個共有峰，并指定了其中5個成分，對比指紋圖譜10批樣品在化學成分上一致，但在含量上存在差異（如圖2所示），進行相似度分析發現10批不同樣品中，除2個批號，其余批號樣品與對照圖譜相似度為0.941～0.973。李士敏等［34］ 采用 HPLC 指紋圖譜結合化學識別模式，對來自浙江、云南和貴州3個省份不同地區72批三葉青采集HPLC指紋圖譜，共標定18個共有峰，利用隨機森林算法結合指紋圖譜有效地鑒別和區分不同地區的三葉青，闡明樣品間的細微差別，為不同產區三葉青質量評價提供參考。HPLC指紋圖譜方法操作簡單、重復性好，為三葉青整體性質量評價提供可靠依據。

7三葉青總多糖含量測定

多糖是一類非常重要而復雜的化合物，對于機體的調控具有重要生物學意義。隨著對三葉青研究的不斷深入，發現從三葉青中提取的多糖具有很好的抗氧化、抗腫瘤和抗肝損傷等生物活性［12，35-37］。阮明穎［26］ 采用分光光度法分別測定其塊根及莖葉部位的多糖含量，樣品經粉碎后，置于索氏提取器中用50%的乙醇回流提取，提取液經4000 rpm離心10 min后，棄去上清液，待乙醇揮干后用水提取即得多糖提取液，提取液用Sevage試劑脫蛋白后，以葡萄糖作為標準品，采用苯酚—硫酸法在葡萄糖標準品溶液不同濃度下，于最大吸收波長489 nm下分別測定吸光度并繪制標準曲線，根據標準曲線計算供試樣品中多糖的含量。發現三葉青多糖含量因產地不同或部位不同存在顯著的差異，所測樣品中，對于莖葉部分，浙江慶元多糖含量最高，可達（49.5±5.1）mg/g，而湖北、貴州、云南和重慶等地區的多糖含量普遍低于其它地區，平均值僅為 20.3 mg/g；塊根部分，以浙江麗水最高，可達（63.2±5.8）mg/g，同樣湖北、貴州、云南和重慶等地區的多糖含量普遍低于其它地區，平均值僅為29.2 mg/g。

8三葉青總酚含量的測定

三葉青中分離到的酚酸類化合物主要是以苯甲酸和桂皮酸為基本母核，酚酸類化合物因其獨特的化學結構在抗炎、降血脂、抗氧化等方面具有顯著的活性，尤其在抗氧化方面甚至優于維生素C，是天然的抗氧劑［38］。陳翔等［39］采用分光光度法測定三葉青塊根的多酚含量，三葉青塊根粉末于75%乙醇溶劑中經超聲提取，過濾后所得濾液即為提取液，以沒食子酸為標準品，在最大吸收波長765 nm下測定不同濃度沒食子酸溶液的吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，根據標準曲線回歸方程可計算三葉青樣品中總多酚的含量。蔣夢丹等［40］ 也采用分光光度法測定三葉青總酚的含量，發現三葉青根須的總酚含量高于塊根，根須上端的含量最高，以抗壞血酸為標準品，采用DPPH 法測定三葉青地下部分不同部位的抗氧化活性，發現上端根須的抗氧化活性最佳，可能與總酚含量有關。

9小結與展望

三葉青作為我國特有的珍稀藥用植物，具有豐富的化學成分，藥理作用顯著，具有廣闊的藥用價值，本文主要綜述了三葉青藥材性狀鑒定、顯微鑒別、HPLC 指紋圖譜研究、活性化學成分的含量測定等的質量控制方法，這些研究成果將為今后更好地應用三葉青發揮了重要作用。雖然三葉青質量控制研究取得了一定進展，但目前仍存在一些問題需進一步探索，首先，含量測定的化學成分主要集中在黃酮類、多糖類化合物，缺乏對其他類化學成分的含量測定研究；其次，對于同時測定不同活性類型化學成分含量進行全面質量控制研究甚少。因此，對于三葉青質量控制的研究需進一步深入，為促進三葉青藥用資源規范化、標準化、合理化的開發和利用奠定基礎。

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（收稿日期：2022-04-05編輯：陶希睿）